M Ở ĐẦU
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Các phương pháp phân tích
+ Định lượng protein hòa tan theo phương pháp Lowry.
+ Định lượng peptid theo phương pháp dựa vào đường chuẩn tyrosine. + Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Kjehldal.
+ Xác định NNH3 theo phương pháp chưng cất lôi cuốn bằng hơi nước. + Xác định hàm lượng lipid bằng phương pháp Soxhlet.
+ Xác định thành phần các acid amin và acid béo bằng phương pháp sắc ký khí.
+ Xác định độ ẩm bằng phương pháp sấy ở nhiệt độ 1050C tới khối lượng không đổi theo TCVN 3700- 90.
+ Kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh vật theo TCVN.
2.2.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm
2.2.2.1. Xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân sinh
khối Artemia bằng enzyme protease
Để có thể tìm được các điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân sinh khối
Artemia bằng enzyme protease của hãng Novo - Đan Mạch, tiến hành các thí nghiệm như sau:
* Chọn loại enzyme protease thích hợp cho quá trình thủy phân
Tiến hành bố trí thí nghiệm chọn lọai protease phù hợp cho quá trình thủy phân sinh khối Artemianhư sau:
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn loại protease thích hợp cho quá trình thủy phân Artemia Xử lý Thủy phân - Tỷ lệ enzyme: 0,3% - t0: 500C - Tỷ lệ nước: 5%
- pH tự nhiên của Artemia tươi
Các loại protease: - Neutrase - Flavourzyme - Protamex Phân tích Chọn enzyme thích hợp
Từ sơ đồ bố trí thí nghiệm này, đề tài sẽ tiến hành nghiên cứu thủy phân sinh khối Artemia bằng các loại enzyme protease khác nhau trong điều kiện cố định các thông số: nhiệt độ, pH, tỷ lệ nước bổ sung, tỷ lệ enzyme bổ sung. Sau các thời điểm 0; 2; 4;…; 10 giờ lấy mẫu phân tích: đánh giá cảm quan và xác định một số chỉ tiêu hóa học như hàm lượng protein hòa tan, hàm lượng peptid, hàm lượng Naa và NNH3. Từ đó lựa chọn loại enzyme thích hợp cho quá trình thủy phân.
* Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân
Bố trí thí nghiệm chọn nhiệt độ phù hợp cho quá trình thủy phân như sau:
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn nhiệt độ thích hợp cho quá trình thủy phân
Từ sơ đồ bố trí thí nghiệm này, đề tài sẽ tiến hành nghiên cứu thủy phân
Artemia bằng protease đã lựa chọn ở các nhiệt độ thủy phân khác nhau (nhiệt độ thường (300C); 450C; 500C; 550C) với các thông số cố định như: pH, tỷ lệ nước bổ sung, tỷ lệ enzyme bổ sung. Sau các thời điểm 0; 2; 4;…; 10 giờ lấy mẫu đánh giá cảm quan và phân tích một số chỉ tiêu hóa học như hàm lượng protein hòa tan, hàm lượng peptid, hàm lượng Naa và NNH3. Từ đó lựa chọn nhiệt độ thích hợp cho quá trình thủy phân. Protease đã lựa chọn Artemia Xử lý Thủy phân - Tỷ lệ enzyme: 0,3% - Tỷ lệ nước: 5% - pH tự nhiên - t0 khác nhau: 300C; 450C; 500C; 550C Phân tích
* Xác định ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân
Để chọn được pH phù hợp cho quá trình thủy phân sinh khối Artemia, tiến hành bố trí thí nghiệm như sau:
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn pH thích hợp cho quá trình thủy phân
Từ sơ đồ bố trí thí nghiệm này, đề tài sẽ tiến hành nghiên cứu thủy phân 4 mẫu sinh khối Artemia ở các pH khác nhau trong điều kiện cố định các thông số khác như: nhiệt độ, tỷ lệ enzyme: 0,3%, tỷ lệ nước bổ sung: 5%. Sau các thời điểm 0; 2; 4;…; 10 giờ lấy mẫu đánh giá cảm quan và phân tích một số chỉ tiêu hóa học như hàm lượng protein hòa tan, hàm lượng peptid, hàm lượng Naa và NNH3. Từ đó lựa chọn pH thích hợp cho quá trình thủy phân.
* Xác định ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme đến quá trình thủy phân
Để chọn được tỷ lệ enzyme phù hợp cho quá trình thủy phân sinh khối
Artemia, tiến hành bố trí thí nghiệm như sau:
Protease đã lựa chọn Artemia Xử lý Thủy phân - t0đã chọn - Tỷ lệ enzyme: 0,3% - Tỷ lệ nước: 5% - pH khác nhau: 6; 6,5; 7; 7,5 Phân tích Chọn pH thích hợp
Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn tỷ lệ enzyme bổ sung thích hợp cho quá trình thủy phân
Từ sơ đồ bố trí thí nghiệm này, đề tài sẽ tiến hành nghiên cứu thủy phân 4 mẫu thí nghiệm sinh khối Artemiaở các tỷ lệ enzyme khác nhau trong điều kiện cố định các thông số khác như : nhiệt độ, pH, tỷ lệ nước bổ sung. Sau các thời điểm 0; 2; 4;…; 10 giờ lấy mẫu đánh giá cảm quan và phân tích một số chỉ tiêu hóa học như hàm lượng protein hòa tan, hàm lượng peptid, hàm lượng Naa và NNH3. Từ đó lựa chọn tỷ lệ enzyme bổ sung thích hợp cho quá trình thủy phân.
* Xác định ảnh hưởng của tỷ lệ nước bổ sung đến quá trình thủy phân
Để chọn được tỷ lệ nước bổ sung phù hợp cho quá trình thủy phân sinh khối
Artemia, tiến hành bố trí thí nghiệm như hình 2.6. Từ sơ đồ bố trí thí nghiệm này, đề tài sẽ tiến hành 4 mẫu thủy phân sinh khối Artemiaở các tỷ lệ nước bổ sung khác nhau trong điều kiện cố định các thông số khác như: nhiệt độ, pH, tỷ lệ enzyme. Sau các thời điểm 0; 2; 4;…; 10 giờ lấy mẫu đánh giá cảm quan và phân tích một số chỉ tiêu hóa học như hàm lượng protein hòa tan, hàm lượng peptid, hàm lượng Naa và NNH3. Từ đó lựa chọn tỷ lệ nước bổ sung thích hợp cho quá trình thủy phân.
Protease đã lựa chọn Artemia Xử lý Thủy phân - t0đã chọn - pH đã chọn - Tỷ lệ nước: 5% - Tỷ lệ enzyme: 0,1%; 0,2%, 0,3%; 0,4% Phân tích Chọn tỷ lệ enzyme
Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn tỷ lệ nước bổ sung thích hợp cho quá trình thủy phân
* Xác định ảnh hưởng của tỷ lệ ethanol bổ sung thích hợp cho quá trình phòng thối
Trong quá trình thủy phân thịt cá nói chung và protein từ động vật thủy sản khác bằng phương pháp sử dụng enzyme protease thường xảy ra hiện tượng phân hủy các hợp chất có chứa nitơ tạo ra NH3 gây thối hỗn hợp thủy phân. Vì thế quá trình thủy phân phải sử dụng các chất phòng thối. Sau khi tham khảo các công trình nghiên cứu khác chúng tôi chọn ethanol là tác nhân phòng thối. Để chọn được tỷ lệ ethanol thích hợp cho quá trình phòng thối, tiến hành bố trí thí nghiệm như hình 2.7. Từ sơ đồ bố trí thí nghiệm này, đề tài sẽ tiến hành nghiên cứu thủy phân 4 mẫu sinh khối Artemia ở các tỷ lệ ethanol bổ sung khác nhau trong điều kiện cố định các thông số khác như: nhiệt độ, pH, tỷ lệ enzyme và tỷ lệ nước bổ sung. Sau các thời điểm 0; 2; 4;…; 10 giờ lấy mẫu đánh giá cảm quan và phân tích một số chỉ tiêu hóa học như hàm lượng protein hòa tan, hàm lượng peptid, hàm lượng Naa và NNH3. Từ
Protease đã lựa chọn Artemia Xử lý Thủy phân - t0đã chọn - pH đã chọn - Tỷ lệ enzyme đã chọn - Tỷ lệ nước: 0%; 5% ; 10%; 15% Phân tích Chọn tỷ lệ nước thích hợp
Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn tỷ lệ ethanol bổ sung thích hợp
* Xác định thời gian thủy phân
Để xác định thời gian thủy phân chúng tôi tiến hành thí nghiệm thủy phân sinh khối Artemia bằng enzyme protease ở các điều kiện đã lựa chọn ở trên. Sau các khoảng thời gian: 2, 4, …, 20 h thủy phân, lấy mẫu đánh giá cảm quan và phân tích một số chỉ tiêu hóa học như hàm lượng protein hòa tan, hàm lượng peptid, hàm lượng Naa và NNH3. Từ đó lựa chọn tỷ lệ thời gian thích hợp cho quá trình thủy phân.
2.2.2.2. Thử nghiệm sản xuất bột đạm thủy phân từ sinh khối Artemia
Sau khi chọn được các điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân, tiến hành thử sản xuất bột đạm theo điều kiện tối ưu đã lựa chọn và phân tích đánh giá chất lượng của bột đạm qua các chỉ tiêu: thành phần hóa học, thành phần acid amin và thành phần acid béo của bột đạm sản xuất được.
Protease đã lựa chọn Artemia Xử lý Thủy phân - t0đã chọn - pH đã chọn - Tỷ lệ enzyme đã chọn - Tỷ lệ nước đã chọn - Tỷ lệ ethanol: 4%; 6%; 8%; 10% Phân tích Chọn tỷ lệ ethanol thích hợp
2.3. THIẾT BỊ THÍ NGHIỆM VÀ HÓA CHẤT
- Luận văn sử dụng các thiết bị hiện có trong phòng thí nghiệm: cân điện tử Shimazu (Nhật), loại 3200g và 220g độ chính xác 10-6 (g); Máy ly tâm lạnh Rotina - Đức; Lò nung Hàn Quốc (12000C); Máy sấy hút chân không - Hàn Quốc; Máy sắc ký khí ;… Một số hình ảnh về thiết bị:
Hình 2.8. Hình ảnh về máy so màu UV/VIS
Hình 2.10. Hình ảnh về máy sấy hút chân không - Hàn Quốc
Hình 2.11. Hình ảnh về máy sắc ký khí
- Các loại hóa chất sử dụng cho các phân tích sử dụng kỹ thuật cao như phân tích acid amin, peptid, acid béo, phân tích vi sinh đều là hóa chất tinh khiết của Merck - Đức. Các hóa chất thông dụng: NaOH, HCl,… là hóa chất tinh khiết của Trung Quốc.
2.4. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
- Các thí nghiệm đều tiến hành 3 lần, mỗi lần 3 mẫu và kết quả là trung bình cộng của các lần thí nghiệm.
- Xử lý số liệu và vẽ đồ thị bằng phần mềm Excel với hệ số tương quan R 0,95.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ SƠ BỘ NGHIÊN CỨU BẢO QUẢN SINH KHỐI ARTEMIA BẢO QUẢN SINH KHỐI ARTEMIA
3.1.1. Xác định thành phần hóa học cơ bản của nguyên liệu Artemia
Tiến hành lấy mẫu sinh khối Artemiađể xác định thành phần hóa học cơ bản, thành phần acid béo và thành phần acid amin. Kết quả phân tích được thể hiện ở các bảng từ 3.1 3.3.
Bảng 3.1. Thành phần acid amin của sinh khối Artemia
STT Thành phần acid amin Hàm lượng (mg/kg)
1 Alanine 219,04 2 Glycine 41,39 3 Valine 3.871,67 4 Leucine 1.176,92 5 Isoleucine 3.043,80 6 Threonine 398,04 7 Serine 584,13 8 Proline 810,48 9 Asparagine 5.666,02 10 Methionine 3.030,89 11 4-Hydroxyproline 6.215,32 12 Glutamine 81,82 13 Phenylalanine 4.144,41 14 Lysine 6.502,44 15 Histidine 3.743,73 16 Tyrosine 14.671,89
Bảng 3.2. Thành phần hóa học cơ bản của sinh khối Artemia
(% so với trọng lượng khô)
STT Thành phần Hàm lượng (%) 1 Protein 68,8 2 Lipid 8,84 3 Acid amin 5,4 4 Tro 10,2 5 Acid béo 6,76
Bảng 3.3. Thành phần acid béo của sinh khối Artemia
Acid béo (% )
SFA MUFA PUFA HUFA DHA EPA
2,01 1,96 2,00 0,4 0,1 0,3
Nhận xét:
Từ các kết quả phân tích ở trên cho thấy sinh khối Artemia có chứa hàm lượng protein rất cao tới 68,8% và hàm lượng khoáng chất 10,2% tổng trọng lượng khô (bảng 3.2). Mặt khác, kết quả phân tích thành phần acid amin (bảng 3.1) cho thấy sinh khối Artemia rất giàu acid amin không thay thế, đặc biệt là giàu Tyr, Lys, đây là những acid amin kích thích tiêu hóa tạo cảm giác ngon miệng, thèm ăn ở con người và động vật nuôi. Thêm vào đó khi phân tích thành phần acid béo (bảng 3.3 ) cho thấy sinh khối Artemia rất giàu các acid béo không thay thế mà đặc biệt là các acid béo không no có nhiều nối đôi - thành phần rất cần thiết cho sự phát triển của trẻ em và động vật nuôi còn non. Kết quả này cho thấy sinh khối Artemia là nguồn dinh dưỡng quý. Vì thế việc nghiên cứu chế biến sinh khối Artemia thành bột đạm là cần thiết nhằm nâng cao khả năng sử dụng nguồn dinh dưỡng quý báu này.
3.1.2. Nghiên cứu bảo quản sinh khối Artemia
Tiến hành thu sinh khối Artemia nuôi trong các ao đất tại ruộng muối ở Cam Ranh theo kỹ thuật đã được đề tài “Thử nghiệm nuôi thu sinh khối Artemia salina
trong ao đất tại ruộng muối ở Cam Ranh” nghiên cứu như sau: sau khi vớt sinh khối Artemia bằng lưới, tạm thời giữ sinh khối thu được trong lưới đặt ở trong
ruộng nuôi, tiến hành sục khí mạnh để cung cấp oxy cho Artemia sống trong lưới. Sau đó rửa nhẹ sinh khối bằng nước biển và chuyển sinh khối đã rửa vào các thùng chứa có nước biển với mật độ tối đa là 500g sinh khối/lít nước biển. Dùng nước đá để hạ nhiệt độ của sinh khối xuống 5-100C và giữ sinh khối ở nhiệt độ này trong điều kiện có sục khí. Phương pháp này cho phép giữ sinh khối với mật độ cao tỷ lệ sống > 90% trong vòng 1 đến 3 giờ để làm thức ăn sống nuôi động vật thủy sản. Tuy thế nếu thu sinh khối theo kỹ thuật này để dùng làm nguyên liệu sản xuất bột đạm sẽ cần thiết bị vận chuyển tốn kém. Còn nếu thu sinh khối Artemia và ướp đá vận chuyển về phòng thí nghiệm thường xảy ra hiện tượng sinh khối bị chuyển sang mầu xám đen. Do vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu bảo quản sinh khối Artemia. Tiến hành 2 mẫu thí nghiệm, mỗi mẫu 0,5kg sinh khối Artemiatươi bảo quản bằng 2 phương pháp: mẫu 1 bảo quản bằng đá cách ướp đá để giữ nhiệt độ mẫu 40C, mẫu 2 bảo quản lạnh ở nhiệt độ 40C có bổ sung thêm NaHSO3 (0,1%). Sau khi bảo quản 2, 4,…, 8 giờđánh giá cảm quan và phân tích một số chỉ tiêu hóa học. Kết quả phân tích được thể hiện ở bảng 3.4 và 3.5
Bảng 3.4. Ảnh hưởng thời gian tới sự thay đổi trạng thái cảm quan của các mẫu bảo quản sinh khối Artemia tươi
Thời gian (giờ) Mẫu bảo quản lạnh bằng nước đá Mẫu bảo quản lạnh bằng nước đá có bổ sung thêm NaHSO3
0,1%
0 Sinh khối Artemia có màu vàng tươi, có mùi tanh tự nhiên.
Sinh khối Artemia có màu vàng tươi, có mùi tanh tự nhiên.
2 Sinh khối Artemia có màu vàng tươi, có mùi tanh tự nhiên.
Sinh khối Artemia có màu vàng tươi, có mùi tanh.
4 Sinh khối Artemia có màu vàng hơi xám, có mùi tanh.
Sinh khối Artemia có màu vàng tươi, có mùi tanh.
6 Sinh khối Artemia có màu vàng xám, có mùi tanh.
Sinh khối Artemia có màu vàng tươi, có mùi tanh.
8 Sinh khối Artemia có màu xám, có mùi tanh.
Sinh khối Artemia có màu vàng tươi, có mùi tanh.
Bảng 3.5. Kết quảphân tích hàm lượng NNH3 và Naacủa sinh khối Artemia theo
thời gian bảo quản
Thời gian (giờ)
NNH3 (mg/g) Naa (mg/g)
Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 1 Mẫu 2
0 0,962 0,978 5,137 5,122
4 1,043 1,045 5,222 5,204
8 1,172 1,169 5,406 5,390
Hình 3.1. Hình ảnh về sinh khối Artemia sau 8 giờ bảo quản bằng nước đá có bổ sung NaHSO3 0,1%
Nhận xét:
Từ các kết quả phân tích ở trên cho thấy sau 8 giờ bảo quản thành phần NNH3 và Naa ở 2 mẫu sinh khối Artemia bảo quản bằng hai phương pháp khác nhau thay đổi không nhiều nhưng mầu sắc của mẫu thì thay đổi đáng kể. Ở mẫu bảo quản theo phương pháp truyền thống - bảo quản bằng nước đá thì sau 8 giờ bảo quản sinh khối
Artemia có hiện tượng chuyển mầu mạnh, mầu của Artemia chuyển sang mầu xám (bảng 3.4). Vì thế khi dùng sinh khối Artemia bảo quản theo kỹ thuật này để sản xuất bột đạm thì bột đạm rất đen (hình 3.2). Còn khi bảo quản sinh khối Artemia
bằng nước đá có bổ sung NaHSO3 (0,1%) thì sinh khối Artemia có mầu sắc tốt, hầu như không bị chuyển màu sau quá trình bảo quản vận chuyển về phòng thí nghiệm (hình 3.1). Ngòai ra khi sử dụng sinh khối Artemia bảo quản theo phương pháp này để sản xuất bột đạm thủy phân thì bột đạm thu được có mầu sáng hơn. Do vậy chúng tôi sử dụng phương pháp này để bảo quản sinh khối Artemia dùng làm nguyên liệu cho quá trình nghiên cứu.
3.2. CHỌN LOẠI ENZYME PROTEASE THÍCH HỢP CHO QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN