Hàm lượng polyphenol tổng số ựược xác ựịnh bằng phương pháp Folin Ờ Ciocalteu (Singleton, V. L. and Ross , L. A, 1965)
Nguyên tắc
Dựa trên phản ứng oxi hoá hợp chất phenol bằng thuốc thử Folin- Ciocalteu tạo thành sản phẩm có màu xanh thẫm, nồng ựộ polyphenol tỷ lệ thuận với cường ựộ màu xanh.
Sau khi phản ứng ổn ựịnh màu ựem ựo ựộ hấp màu của dung dịch ở bước sóng 755nm và dựa vào ựồ thị chuẩn của acid gallic ta xác ựịnh ựược hàm lượng polyphenol của quả sim ở các ựộ chắn.
Tiến hành
Tiến hành phản ứng trong ống nghiệm theo tỷ lệ các chất như sau: + 1000ộl dung dịch mẫu cần phân tắch ựã pha loãng thắch hợp + 500ộl Folin-Ciocalteu 1N
+ Vortex, ựợi 5 phút + 2500ộl Na2CO3 7,5%
+ Vortex cho dung dịch ựồng nhất
+ để 30 phút trong bóng tối cho ổn ựịnh màu + đo ựộ hấp thụ quang tại bước sóng 755nm
Acid gallic ựược dùng làm chất chuẩn trong test này, từ kết quả thu ựược và ựường chuẩn acid galic ta tắnh ựược hàm lượng polyphenol trong 1g chất khô quả sim và ựược biểu diễn theo mgGAE/g CK (GAE-Gallic Acid Equivalent).
3.3.4. Phương pháp xác ựịnh hàm lượng anthocyanin tổng số
Hàm lượng anthocyanin tổng số ựược xác ựịnh bằng phương pháp pH vi sai (AOAC method 2005.02, 37.1.68.)
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 31 o đệm pH = 1: Cân 1.86g KCl và 980 ml nước cất ựem chuẩn pH về 1.0 bằng acid HCl gốc sau ựó lên thể tắch 1 lắt bằng nước cất.
o đệm pH = 4,5: Cân 54.43g CH3COONạ3H2O và 960 ml nước cất, chuẩn dung dịch về p = 4,5 bằng HCl gốc sau ựó lên thể tắch 1 lắt bằng nước cất.
Nguyên tắc
Xác ựịnh hàm lượng anthocyanin tổng số dựa vào màu sắc của dịch anthocyanin ở các pH khác nhaụ Ở pH 1 cho màu ựậm nhất, pH 4,5 cho màu nhạt nhất.
Tiến hành
+ Dịch chiết mẫu ựược pha loãng trong dung dịch ựệm pH = 1 và pH = 4,5 với hệ số pha loãng là 10: lấy 4,5 ml dung dịch ựệm pH = 1 và pH = 4,5
+ Thêm 0,5 ml dịch chiết
+ Votex cho dung dịch ựồng nhất
+ để 30 phút và ựem ựo hấp thụ quang tại 2 bước sóng 520nm và 700nm. - Hàm lượng anthocyanin ựược tắnh theo công thức:
TAC (mg/g CK) = A*MW*V*f/ε/l/m*100/CKTS Trong ựó:
o V: Tổng thể tắch dịch chiết anthocyanin của mẫu cần xác ựịnh (ml)
o f: Hệ số pha loãng trong các dung dịch pH =1 và pH = 4,5 (f=10)
o A = (A512 Ờ A700)pH1 Ờ (A520 Ờ A700)pH4,5
o MW = 449,2 g/mol: khối lượng phân tử của cyanidin 3-glucosid
o l: chiều dày của cuvet (l=1cm)
o ε = 25,965 l/mol/cm: hệ số háp thụ phân tử của cyaniding 3-glucosid
o m: Khối lượng mẫu (g)
o CKTS: Hàm lượng chất khô tổng số (%)
Hàm lượng anthocyanin tổng số ựược biểu diễn theo mg cyanidin-3- glucosid/g chất khô mẫụ đây là anthocyanin phổ biến trong tự nhiên.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 32
3.3.5. Xác ựịnh khả năng kháng oxy hóa bằng phương pháp DPPH
Khả năng oxy hoá ựược xác ựịnh bằng phương pháp DPPH (Prasad et al., 2009).
Nguyên tắc
DPPH-Diphenylpicrylhydrazyl là gốc tự do có màu tắm có ựộ hấp thụ quang cực ựại là Amax =517.
Khi cho dung dịch chất có khả năng kháng oxy hóa vào dung dịch DPPH thì các gốc tự do bị khử và mất màu tắm. Dựa vào khả năng làm mất màu tắm gốc tự do DPPH của dịch chiết polyphenol từ quả sim ta xác ựịnh ựược khả năng kháng oxy hóa của dịch chiết polyphenol từ quả sim.
Tiến hành
+ 150ộl dịch chiết ựã pha loãng ựến nồng ựộ thắch hợp + 3850ộl DPPH 1ộmol/lit
+ Tiến hành ựồng thời một mẫu control thay dịch chiết bằng methanol + Vortex cho dung dịch ựồng nhất trong ống nghiệm, ựặt ống nghiệm ở ựiều kiện 250C trong 30 phút rồi ựem ựo ựộ hấp thụ quang tại bước sóng 517nm, dựa vào ựường chuẩn trolox ta xác ựịnh ựược khả năng kháng oxy hóa của dịch chiết polyphenol từ quả sim.
độ kìm hãm (%) ựược xác ựịnh theo công thức:
độ kìm hãm (%) = (ODcontrol - ODmẫu) / ODcontrol
Trong ựó: ODcontrol: độ hấp thụ quang của mẫu control ODmẫu: độ hấp thụ quang của mẫu cần xác ựịnh
Trolox ựược dùng làm chất chuẩn trong test này, khả năng kháng oxy hoá ựược xác ựịnh dựa trên ựường chuẩn mô tả mối quan hệ giữa nồng ựộ trolox và ựộ kìm hãm (%) và ựược tắnh bằng ộmol TE/g CK (TE Ờ Trolox Equivalent)
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 33
3.3.6. Phương pháp xác ựịnh hàm lượng flavan-3ol tổng số
Hàm lượng flavan-3ol tổng số bằng phương pháp DMACA (Quettier Ờ Deleu et al., 2000).
Nguyên tắc
Phản ứng dựa trên sự tạo phức màu giữa các hợp chất flavan-3ol và DMACẠ Phức có màu xanh lá cây và có ựộ hấp thụ cực ựại tại 640nm.
Tiến hành
+ 600ộl dung dịch mẫu cần phân tắch ựã pha loãng 5 lần (mẫu trắng thay dịch chiết bằng dung dịch HCl 0,5 %)
+ 3000ộl DMACA (0,5g/L)
+ Vortex ựể dung dịch ựồng nhất trong ống nghiệm, ựể yên 10 phút trong phòng sau ựó ựo dộ hấp thụ quang tại bước sóng 640nm.
Catechine ựược dùng làm chất chuẩn trong test nàỵ Từ kết quả thu ựược và ựường chuẩn tắnh ra hàm lượng flavan-3ol trong 1g chất khô quả sim và ựược biểu diễn theo mg CE/g CK (CE- Catechine Equivalent).
3.3.7. Phương pháp xác ựịnh hàm lượng proanthocyanidine
Hàm lượng proanthocyanidine bằng phương pháp butanol acid hóa (Souza et al., 2008).
Nguyên tắc
Các hợp chất proanthocyanidin hay còn gọi là tannin ngưng tụ dưới tác dụng của butanol acid sẽ bị phân giải theo cách oxi hóa tạo thành các nhân anthocyanidin. Sự chênh lệch của nồng ựộ các nhân cyaniding sau và trước phân giải bằng butanol acid chắnh là lượng nhân anthocyanidin giải phóng từ tannin ngưng tụ.
Tiến hành
+ 3000 ộl Butanol Ờ HCl ựặc (95/5, v/v)
+ 500 ộl dịch chiết (mẫu trắng thay dịch chiết bằng dung môi acetone: H2O: acid acetic = 50: 49: 1 v/v)
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 34
+ để yên 1h ở nhiệt ựộ phòng
+ Vortex cho dung dịch ựồng nhất, ựem ựo ựộ hấp thụ quang tại bước sóng 550 nm
+ Làm tương tự, ựun sôi trong 1h và ựem ựo ựộ hấp thụ quang + Tắnh hiệu ựộ hấp thụ của mẫu ựun sôi và không ựun sôị
Cyanidin chlorid ựược dùng làm chất chuẩn trong test nàỵ Từ kết quả thu ựược và ựường chuẩn ta tắnh ựược hàm lượng proanthocyanidin trong 1g chất khô quả sim (mg CCE/g CK Ờ mg cyanidin chlorid equivalent/ g chất khô).
3.3.8. Phương pháp xác ựịnh hàm lượng flavon và flavonol tổng số
Hàm lượng flavon và flavonol tổng số bằng phương pháp tạo phức màu với AlCL3 (Chang et al., 2002).
Nguyên tắc
Phản ứng dựa trên sự tạo phức màu giữa các nhóm ceto và hydroxyl của flavon và flavonol với Al. Phức này có màu vàng và hấp thụ cực ựại tại 415 nm.
Tiến hành
+ 500ộl dịch chiết + 1500ộl ethanol 95%
+ 100ộl AlCl3 ựối với mẫu phân tắch (100ộl H2O ựối với mẫu trắng) + 100ộl CH3COOK 1M
+ 2800ộl H2O
+ Vortex ựể dung dịch ựồng nhất, ựể yên 30 phút ở nhiệt ựộ phòng sau ựó ựo ựộ hấp thụ quang tại bước sóng 415nm.
Quercetine ựược dùng làm chất chuẩn trong test nàỵ Từ kết quả thu ựược và ựường chuẩn ta tắnh ựược hàm lượng flavonol trong 1g chất khô quả sim và ựược biểu diễn theo mg QE/g CK (QE-Quercetine Equivalent).
3.3.9. Phương pháp xử lý số liệu
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 35
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Một số chỉ tiêu hoá lý của quả sim ở các ựộ chắn
Trong quá trình sinh trưởng và phát triển của quả sim, các chỉ tiêu hoá lý có sự thay ựổị để ựánh giá các ựặc tắnh hóa lý của quả, mẫu quả sim ựược chúng tôi thu hái tại 3 tỉnh: Thái Nguyên, Hải Dương và Hoà Bình.
4.1.1. Khối lượng của quả sim ở các ựộ chắn
Trong quá trình chắn có sự biến ựổi về khối lượng quả. Kết quả theo dõi biến ựộng khối lượng quả sim ựược thể hiện qua ựồ thị 4.1.
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 1 2 3 4 5 Độ chắn K hố i lư ợ n g t ru n g b ìn h q uả ( g ) TN HD HB b ab ab ab a
Hình 4.1. Sự biến ựổi của khối lượng trung bình quả theo ựộ chắn
Có thể nhận thấy thấy khối lượng quả lại tăng dần theo ựộ chắn của cả 3 mẫu thu hái tại TN, HD và HB. Tuy nhiên khối lượng quả tăng nhiều khi chuyển từ ựộ chắn 1 sang ựộ chắn 2 và từ ựộ chắn 4 sang ựộ chắn 5. Ở ựộ chắn 5, khối lượng quả ựạt cao nhất. điều này cũng phù hợp với thực tế khi thu hái quả và phù hợp với quy luật chung: trong quá trình chắn, quả tăng lên về kắch thước và khối lượng. Không có sự khác biệt nhiều giữa các mẫu quả thu hoạch ở TN, HD và HB.
4.1.2. Chỉ số màu sắc của quả sim ở các ựộ chắn
Màu sắc của quả nhìn chung thường biến ựổi theo ựộ chắn của quả, phần nào phản ánh sự biến ựổi của các hợp chất tạo nên sắc tố trong quả. Kết quả
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 36
theo dõi sự biến ựổi màu sắc của quả sim tại 3 ựịa ựiểm ựược thể hiện qua các chỉ số ựo màu (L, a, b) và ựược thể hiện ở hình 4.2, 4.3, 4.4.
Chỉ số L (Light) là ựộ ựậm nhạt của màu sắc vỏ quả có giá trị từ 0 Ờ 100. Từ hình 4.2 ta thấy chỉ số L giảm dần từ ựộ chắn 1 ựến ựộ chắn 5 của quả sim thu ở TN, HD và HB. Sở dĩ như vậy là do khi quả sim còn xanh thì màu vỏ quả sáng hơn, khi quả chắn màu vỏ quả sẫm hơn. Ở ựộ chắn 5 quả sim có màu tắm sẫm nên chỉ số L giảm thấp nhất. Chúng tôi cũng nhận thấy quả sim ở TN có màu vỏ sẫm hơn so với quả thu hái ở HB và HD.
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 1 2 3 4 5 Độ chắn C h ỉ s ố L TN HD HB
Hình 4.2. Sự biến ựổi của chỉ số L theo ựộ chắn
Trong các chỉ số màu, trị số a thể hiện dải màu từ xanh lá cây ựến ựỏ, có giá trị từ - 60 ựến + 60. Từ hình 4.3 chúng tôi thấy giá trị a của cả 3 mẫu quả sim tăng dần từ ựộ chắn 1 ựến ựộ chắn 3, sau ựó lại giảm xuống do vỏ quả chuyển sang màu tắm hay tắm sẫm. Màu sắc của quả sim chủ yếu do nhóm sắc tố chlorophyl, anthocyanin và carotenoid quyết ựịnh. Trong quá trình chắn có sự thay ựổi về màu sắc, tuỳ theo mức ựộ chắn của quả mà màu xanh của quả mất dần do chlorophyl giảm, màu vàng, ựỏ tăng dần do hàm lượng carotenoid và anthocyanin tăng. Trong 3 mẫu quả thì quả sim của TN cũng có chỉ số a luôn cao hơn so với 2 mẫu còn lạị
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 37 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 1 2 3 4 5 Độ chắn C h ỉ s ố a TN HD HB
Hình 4.3. Sự biến ựổi của chỉ số a theo ựộ chắn
Chỉ số b là dải màu từ xanh nước biển tới màu vàng, có giá trị từ - 60 ựến + 60. Qua hình 4.4 chúng tôi nhận thấy giá trị b giảm dần từ ựộ chắn 1 ựến ựộ chắn 5 của cả 3 mẫu thu hái tại tỉnh TN, HB và HD. Sự biến ựộng giá trị b cũng có liên quan ựến sự phân hủy chlorophyll và tổng hợp carotenoid trong quả. Khi quả sim còn non có màu xanh nên b có giá trị cao nhất, và ở ựộ chắn 5 có giá trị thấp nhất khi quả chuyển màu tắm sẫm. Không có sự khác biệt nhiều về chỉ số b giữa các mẫu TN, HD và HB. 0 3 6 9 12 15 18 21 24 1 2 3 4 5 Độ chắn C hỉ số b TN HD HB
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 38
4.1.3. Hàm lượng chất khô tổng số của quả sim ở các ựộ chắn
Chất khô tổng số bao gồm các chất khô hòa tan (ựường, acid, rượu cao phân tử, vitamin, enzymeẦ) và các chất khô không hòa tan (cellulose, hemicellulose, tinh bột, chất béo, một số vitamin và chất khoáng,..).
Kết quả hình 4.4 cho thấy hàm lượng chất khô tổng số giảm dần theo ựộ chắn của quả sim. Có thể thấy hàm lượng chất khô tổng số giảm nhanh từ ựộ chắn 1 sang ựộ chắn 2, sau ựó giảm chậm dần trong quá trình quả chắn. Hàm lượng chất khô tổng số của mẫu TN và HB luôn cao hơn so với mẫu quả sim ở HD. 0 5 10 15 20 25 30 35 1 2 3 4 5 Độ chắn C hấ t k h ô tổ n g số ( % ) TN HD HB a a a b b b bc b c cd c c d c b
Hình 4.5. Sự biến ựổi của hàm lượng chất khô tổng số theo ựộ chắn
Theo các nghiên cứu, trong quá trình chắn của quả, hàm lượng các chất khô hòa tan trong quả tăng lên do các phản ứng thủy phân xảy ra rất mạnh ựể tạo thành ựường. Hàm lượng tinh bột, tanin giảm ựể chuyển thành ựường ựơn, lipit cũng dễ bị thủy phân, protein không bị thủy phân trong quá trình quả chắn mà trái lại còn ựược tổng hợp thêm. Quy luật này ựúng với ở quả mâm xôi và dâu tây (Wang et al., 2009).
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 39
4.2. động thái biến ựổi các hợp chất phenol và khả năng kháng oxi hoá của quả sim ở các vùng sinh thái khác nhau quả sim ở các vùng sinh thái khác nhau
4.2.1. động thái biến ựổi các hợp chất phenol của quả sim ở các ựộ chắn khác nhau khác nhau
4.2.1.1. Sự biến ựổi của hàm lượng polyphenol tổng số trong quá trình chắn
Quả sim là loại quả giàu polyphenol. Tuy nhiên hàm lượng polyphenol tổng số của quả có thể biến ựộng trong quá trình chắn. Kết quả ựánh giá sự biến ựổi của hàm lượng polyphenol tổng số trong quá trình chắn của quả sim thu hoạch ở 3 tỉnh ựược thể hiện ở hình 4.6. Chúng tôi nhận thấy hàm lượng polyphenol tổng số của quả sim giảm dần từ ựộ chắn 1 (57,07 mg GAE/g CK ựối với mẫu TN; 55,02 mg GAE/g CK ựối với mẫu HD; 58,38 mg GAE/g CK ựối với mẫu HB) ựến ựộ chắn 5 (40,34 mg GAE/g CK ựối với mẫu TN, 47,27 mg GAE/g CK ựối với mẫu HD; 44,75 mg GAE/g CK ựối với mẫu HB). đối với quả thu hái ở TN, trong quá trình chắn, hàm lượng polyphenol của quả sim giảm 1,41 lần. đối với mẫu thu hái tại HD giảm 1,16 lần. đối với mẫu thu hái tại HB giảm 1,30 lần. 0 10 20 30 40 50 60 70 1 2 3 4 5 Độ chắn P h o ly p h e n o l tổ n g số ( m g G A E / g C K ) TN HD HB
Hình 4.6. Sự biến ựổi của hàm lượng polyphenol tổng số theo ựộ chắn
Kết quả xử lý thống kê cho thấy xác suất ựối với phép thử ảnh hưởng của ựộ chắn, của ựịa ựiểm và tương tác ựộ chắn và ựịa ựiểm lần lượt là p<0,0001 (<0,05); p=0,0001 (<0,05) và p=0,4134 (>0,05) cho thấy ựộ chắn, ựịa ựiểm thu
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 40
hái ảnh hưởng có ý nghĩa ựến hàm lượng polyphenol của quả sim nhưng tương tác giữa hai yếu tố ựộ chắn và ựịa ựiểm lấy mẫu ảnh hưởng không có ý nghĩa ựến chỉ tiêu nàỵ
Hàm lượng polyphenol tổng số ở các loại quả khác nhau có hàm lượng khác nhaụ Theo M. Carmen(2009) hàm lượng Polyphenol tổng số của quả nằm trong biên ựộ từ 13 mg GAE/g CK ựến 29 mg GAE/ g CK , ựược thể hiện trong bảng 4.1.
Bảng 4.1. Hàm lượng polyphenol tổng số của một số loại quả
STT Loại quả Polyphenol tổng số
(mg GAE/g CK) 1 Thanh long (Stenocereus stellatus
Riccobono) 13,84 Ờ 15,52
2 Táo (Malus pumila) 13,00 Ờ 13,10 3 Dâu tây (Fragaria ananassa) 16,00 Ờ 18,00 4 Quả mâm xôi (Rubus idaeus) 27,00 Ờ 29,00 5 Quả nam việt quất (Vaccinium oxycoccus) 22,00
(Nguồn: M. Carmen Beltran-Orozc0 et al., 2009)
Khảo sát trên quả sim thì thấy hàm lượng polyphenol tổng số của quả giảm dần theo ựộ chắn. Sự biến ựổi theo qui luật tương tự ựược quan sát ở ựu