CHƢƠNG III : VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.3 Cấy giống nấm và trồng thu quả thể nấm
Phƣơng pháp cấy giống nấm:
Đề tài sử dụng phƣơng pháp cấy giống trên cọng mì (hay cịn gọi là meo cọng). Với phƣơng pháp này cần tạo lỗ ở túi ngun liệu có đƣờng kính 1,5- 1,8cm và sâu 15-17cm. Khi cấy giống phải đặt túi nguyên liệu gần đèn cồn và túi giống, sau đó gắp từng que meo cọng ở túi giống cấy vào túi nguyên liệu.
Chú ý: Giống cấy phải đảm bản đúng độ tuổi tức khoảng 15 ngày tuổi. Trƣớc khi cấy giống ta phải dùng cồn lau miệng bịch giống bóc tách lớp màng trên bề mặt. Trong q trình cấy, bịch giống ln phải để nằm ngang. Sau khi cấy giống ta đậy lại nút bông, vận chuyển túi vào khu vực ƣơm. Phải thƣờng xuyên vệ sinh sạch sẽ phòng cấy giống.
Cách ni trồng, chăm sóc
Kể từ ngày cấy giống đến khi mở nút bơng (khoảng 25-30 ngày) sợi nấm đã ăn kín ¾ túi. Tiến hành mở nút bông. Treo các bịch giá thể trên các dây treo, trung bình một dây có thể treo từ 8-10 bịch để nấm ra không chạm vào nhau. Từ 7 đến 10 ngày đầu chủ yếu tiến hành tƣới nƣớc trên nền nhà, đảm bảo độ ẩm 80- 90%, thơng thống vừa phải. Khi quả thể nấm bắt đầu mọc qua nút bông thì ngồi việc tạo ẩm khơng khí, có thể tƣới phun sƣơng nhẹ vào túi nấm mỗi ngày từ 1-3 lần (tuỳ theo điều kiện thời tiết). Chế độ chăm sóc nhƣ trên đƣợc duy trì liên tục cho đến khi viền trắng trên vành mũ quả thể khơng cịn nữa là hái đƣợc. Thời gian từ khi cấy giống nấm lên giá thể đến khi thu hoach đƣợc khoảng 3 tháng. Sau đó tiến hành thu hoạch nấm, ghi nhận sản lƣợng nấm thu đƣợc trên
31
từng giá thể để từ đó tìm ra đƣợc mơi trƣờng với tỷ lệ thích hợp để trồng nấm cho năng suất.
Bã mía
Giá thể tổng hợp
Giá thể đã cấy giống
Giống sản xuất trên cọng mì (giống cấp III) Quả thể nấm Hồng chi Giống gốc môi trƣờng thạch Giống môi trƣờng hạt ( malt lúa cấp II)
Nhà ủ
Thu hái quả thể nấm Nhà trồng, nhà tƣới Ủ 25-30 ngày, chuyển ra nhà trồng, mở nắp túi phôi Mùn cƣa cao su Sàn, ủ vôi 1% trong 2 ngày Ngâm nƣớc vôi 2% 2 lần,
phơi ráo nƣớc 4-5 ngày, ủ đống 2 ngày Bổ sung DAP 3‰, cám gao 3%, vô bịch Thanh trùng 1000C/12 giờ Cấy giống
32
Sơ đồ 3.1: Quy trình trồng nấm Hồng Chi (Ganoderma lucidum) trên
mơi trƣờng kết hợp bã mía và mùn cƣa 3.3.4 Khảo sát tốc độ lan tơ của nấm Hồng Chi
Sau khi cấy giống, tơ trong bịch phôi sẽ lan từ trên đỉnh bịch phôi xuống đáy bịch. Cứ sau 3 ngày, ta tiến hành đo độ dài tơ lan xuống. Từ đó tính ra đƣợc tốc độ lan tơ trung bình của từng loại cơ chất.
3.3.5 Khảo sát năng suất thu hoạch của nấm Hồng Chi
3.3.5.1 Đo đường kính và độ dày quả thể
Sau khi quả thể nấm Hồng Chi ngừng sinh trƣởng (khoảng 80 ngày từ ngày cấy giống), tiến hành thu hái quả thể nấm Hồng Chi. Sau đó tiến hành đo đƣờng kính, độ dày của quả thể, độ dài cuống nấm.
3.3.5.2 Khảo sát trọng lượng nấm Hồng Chi
Cân trọng lƣợng tƣơi của quả thể, sau đó mang đi sấy đến trọng lƣợng khơng đổi, từ đó xác định lƣợng ẩm có trong nấm Hồng Chi thu hái đƣợc trên từng cơ chất.
3.3.6 Phân tích dƣợc tính của nấm Hồng Chi sau khi thu hái
3.3.6.1 Định tính alkaloid
Nguyên tắc
Để phát hiện sự hiện diện của alkaloid trong dƣợc liệu ngƣời ta thƣờng áp dụng nguyên tắc thử Webb với cách thử gồm 2 phần nhƣ sau
Phần 1: Bột nấm Linh Chi xay nhuyễn (5 – 10 g) và dung dịch H2SO4 1% cho vào bình tam giác. Đun nhẹ trong 1 giờ. Lọc và lấy dịch lọc để thử nghiệm với cả 2 loại thuốc thử: Mayer, Dragendorff. Quan sát kết tủa, nêu có kết tủa theo qui định là dƣơng tính. Tuy nhiên, nếu khơng có kết tủa cũng chƣa thể kết luận là khơng có alkaloid mà phải tiếp tục thử nghiệm phần 2.
Phần 2: Bột xay nhuyễn (5 – 10 g) ngâm trong dung dịch prollius là hỗn hợp gồm: chloroform: ethanol 950: NH4OH đậm đặc, theo tỷ lệ là 8:8:1 (môi trƣờng phải có tính bazơ). Ngâm nguội trong 24 giờ, ở nhiệt độ phòng, thỉnh thoảng lắc trộn. Lọc và đuổi dung mơi đến cạn, thu đƣợc cặn. Hịa tan cặn trong dung dịch
33
HCl 1%, đun ấm cho dễ tan. Lọc và lấy dịch lọc để thử nghiệm với 2 loại thuốc thử: Mayer, Dragendorff.
Thuốc thử định tính alkaloid
Thuốc thử Mayer: hòa tan 1,36g HgCl2 trong 60 ml nƣớc cất và 5g KI trong 10 ml nƣớc cất. Thu hỗn hợp 2 dung dịch này lại và thêm nƣớc cất cho đủ 100 ml. Nhỏ vài giọt thuốc thử Mayer vào dung dịch acid lỗng có chứa alkaloid, nếu có chứa alkaloid thì sẽ xuất hiện tủa màu trắng hoặc vàng nhạt. Cần lƣu ý vì tủa tạo thành có thể hịa tan trở lại trong lƣợng thừa thuốc thử hoặc hòa tan bởi ethanol có sẵn trong dung dịch thử.
Thuốc thử Dragendorff: hòa tan 8g Nitrat bismuth Bi(NO3)3 trong 25ml HNO3 30% (D = 1,18). Hòa tan 28g KI và 1ml HCl 6N trong 5ml nƣớc cất. Hỗn hợp 2 dung dịch màu cam – đỏ đƣợc chứa trong bình sậm màu để che sáng, cất trong tủ lạnh, có thể giữ lâu vài tuần. Nhỏ thuốc thử Dragendorff vào dung dịch acid lỗng có chứa alkaloid nếu có alkaloid sẽ xuất hiện tủa màu cam – nâu.
3.2.6.2 Xác định hợp chất saponin
Chiết 5g dƣợc liệu với cồn 70% bằng cách ngâm trong 24 giờ rồi lọc. Cô dịch lọc bốc hơi đến cặn khơ. Dùng cặn để làm các phản ứng định tính [5].
Thử nghiệm tính tạo bọt
Một đặc tính quan trọng của saponin là tính tạo bọt, nên đây là một trong những phƣơng pháp chính xác để định tính sự hiện diện của saponin. Hòa tan một lƣợng cặn tƣơng ứng với 1g dƣợc liệu vào 5ml nƣớc nóng. Lọc vào một ống nghiệm 1,6 – 16 cm và để nguội, thêm nƣớc cho đủ 10 ml, dùng ngón tay cái bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh theo chiều dọc ống nghiệm trong 1 phút. Để yên ống nghiệm, quan sát lớp bọt
Bọt bền trong 15 phút: + Bọt bền trong 30 phút: ++ Bọt bền trong 60 phút: +++ Thử ngiệm Fontan – Kaudel [5]
Lấy một lƣợng cặn tƣơng ứng với 1g bột dƣợc liệu, đun cách thủy để hòa tan với 10 ml nƣớc. Chia đều vào 2 ống nghiệm.
34 Ống 1: thêm 2 ml HCl 0.1 N (pH = 1) Ống 2: thêm 2 ml NaOH 0.1 N (pH= 13)
Bịt ống nghiệm và lắc mạnh theo chiều dọc cả 2 ống trong 1 phút và để yên, quan sát các cột bong bóng trong cả 2 ống nghiệm.
Nếu cột bong bóng trong cả 2 ống nghiệm ngang nhau và bền nhƣ nhau thì sơ bộ kết luận có saponin triterpenoid.
Nếu ống pH = 13 có cột bọt cao hơn nhiều so với ống pH = 1, sơ bộ xác định là có saponin steroid.
3.2.6.3 Định tính triterpenoid (phản ứng Liebermann-Burchard)
Chiết 5 -10g bột dƣợc liệu bằng diethylether lắc trong bình tam giác, trong 10 – 20 phút, chiết cho tới khi dịch ether sau khi bốc hơi khơng cịn để lại vết mờ trên mặt kính đồng hồ, gộp các dịch chiết, lọc và cô lại cho đến khi còn khoảng 50 ml dịch chiết ether.
Lấy 5 ml dịch chiết ether cho vào chén sứ, bốc hơi tới cắn. Hòa tan cắn với 0,5 ml anhydrid acetic, rồi thêm vào dung dịch 0,5 ml chloroform. Chuyển dung dịch vào 1 ống nghiệm nhỏ khô, dùng pipet thêm cẩn thận 1 – 2 ml H2SO4 đậm đặc lên thành ống nghiệm để nghiêng cho acid chảy xuống đáy ống nghiệm. Nơi tiếp xúc giữa 2 lớp dung dịch có màu đỏ nâu hay đỏ đến tím, lớp phía dung dịch trên dần dần chuyển thành màu xanh lục hay tím. Kết luận có triterpenoid.[5]
3.2.6.4 Định tính acid hữu cơ
Lấy 2 ml dịch chiết nƣớc cho vào một ống nghiệm. Thêm vào dung dịch một ít tinh thể Na2CO3. Nếu có các bọt khí sủi lên từ các tinh thể Na2CO3 thì kết luận có acid hữu cơ.
35
Sơ đồ 3.2: Phƣơng pháp định lƣợng Polysaccharide
Polysaccharide có nhiều dạng và nhiều quy trình chiết khác nhau. Chiết GLPs ở 1000C trong vịng 16 giờ, cho năng suất trích ly cao, nhƣng làm biến đổi cấu trúc sinh học các polysaccharide có trong nấm Linh Chi. Một quy trình thứ hai đƣợc ứng dụng rộng rãi để chiết GLPs ở nhiệt độ thấp, nhằm ổn định cấu trúc sinh học của các GLPs (Sơ đồ 3.2)
Sau quy trình, thu nhận cả 3 dịch chiết và đem lọc. Lấy phần cặn đem đi sấy khơ và xác định trọng lƣợng. Từ đó đánh giá hàm lƣợng polysaccharide thơ có trong quả thể nấm Linh Chi.
Quả thể nấm Linh chi
Thái mỏng Hỗn hợp chiết rút lần 1 Ngâm nƣớc 700 C/ 3 giờ Bã chiết rút lần 1 Hỗn hợp chiết rút lần 2 Bã chiết rút lần 2 Ngâm cồn 800/ 3 giờ ở 700C Ngâm nƣớc 700 C/ 3 giờ Dịch chiết rút lần 3 Dịch chiết rút lần 2 Dịch chiết rút lần 1
36
3.3.7 Phƣơng pháp xử lý số liệu
Sử dụng phần mềm Excel để xử lý số liệu.
3.3.8 Thiết lập quy trình, hƣớng dẫn kỹ thuật, hỗ trợ nông dân cách trồng nấm Hồng Chi nấm Hồng Chi
Sơ đồ 3.1: Quy trình Triển khai trồng nấm Hồng Chi cho một số hộ
nghèo tại xã Trung Hòa huyện Trảng Bom
Theo dõi Đánh giá kết quả Hƣớng dẫn kỹ thuật theo
từng công đoạn Liên hệ Địa phƣơng
Tiếp cận và tƣ vấn cho một số Hộ nghèo Lựa chọn hộ làm Thí điểm Kết luận và Định hƣớng triển khai Đồng thuận
37
CHƢƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 KẾT QUẢ KHẢO SÁT TỐC ĐỘ LAN TƠ 4.1 KẾT QUẢ KHẢO SÁT TỐC ĐỘ LAN TƠ
Kết quả này đƣợc ghi nhận trong vòng 15 ngày, cứ 3 ngày đo tốc độ lan tơ một lần. Đơn vị đo là cm. Kết quả với 5 lần lặp lại ở mỗi nghiệm thức. Kết quả cụ thể đƣợc trình bày ở bảng 4.1 và biểu đồ 4.1.
Bảng 4.1: Bảng thống kê kết quả khảo sát tốc độ lan tơ
STT Tỷ lệ mùn cưa: bã mía
Tốc độ lan tơ trung bình của các lần lặp lại cm/ngày Tốc độ lan tơ cm/ngày 1 2 3 4 5 1 100:0 0.95 0.94 1.09 1.13 1.10 1.05 2 95:5 1.03 1.00 0.95 0.98 1.20 1.03 3 90:10 1.01 0.98 0.97 1.05 1.10 1.02 4 85:15 0.99 0.85 0.96 1.02 1.00 0.96 5 80:20 1.08 0.99 0.99 1.05 0.80 0.98 6 75:25 0.87 0.92 0.98 1.20 1.20 1.02 7 70:30 0.9 0.97 0.99 1.00 1.10 0.99 8 65:35 0.93 0.99 0.95 0.96 1.00 0.97 9 60:40 1.00 0.98 0.89 1.04 1.00 0.98 10 55:45 1.04 1.05 0.98 0.97 1.00 1.00 11 50:50 1.00 1.10 1.00 1.03 1.00 1.02 12 45:55 1.02 1.05 0.98 1.00 0.90 0.98 13 40:60 0.95 1.00 1.01 0.94 1.00 0.99 14 35:65 0.99 0.8 0.95 0.90 0.92 0.91 15 30:70 1.00 0.97 0.88 0.99 1.00 0.97 16 25:75 0.87 0.89 0.93 1.00 0.90 0.92 17 20:80 1.05 1.00 0.99 0.88 0.80 0.94 18 15:85 0.9 0.89 0.87 0.89 0.90 0.89 19 10:90 0.79 0.83 0.92 0.91 0.90 0.88 20 5:95 0.9 0.92 0.82 0.88 0.90 0.89 21 0:100 0.91 0.85 0.92 0.91 0.90 0.89
38
Biểu đồ 4.1: Tốc độ lan tơ trung bình
Nhận xét:
Từ bảng 4.1 và Biểu đồ 4.1 cho thấy nấm Hồng Chi lan tơ khá tốt và đều trên các môi trƣờng nghiệm thức. Môi trƣờng 100% mùn cƣa là mơi trƣờng có tốc độ lan trung bình nhanh nhất và môi trƣờng nghiệm thức 19 (tỉ lệ mùn cƣa:bã mía 10:90) là mơi trƣờng có tốc độ lan tơ chậm nhất. Mơi trƣờng nghiệm thức 2, 3, 6, 10, 11 cho tốc độ lan tơ đồng đều và tƣơng đối cao.
4.2 KẾT QUẢ KHẢO SÁT NĂNG SUẤT NẤM HỒNG CHI 4.2.1 Kết quả khảo sát kích thƣớc nấm Hồng Chi 4.2.1 Kết quả khảo sát kích thƣớc nấm Hồng Chi
Kích thƣớc của nấm Hồng Chi đƣợc đánh giá dựa vào những yếu tố sau: Đƣờng kính quả thể ; Độ dài cuống nấm; Độ dày quả thể. Kết quả cụ thể đƣợc trình bày ở bảng 4.2 và biểu đồ 4.2
39
Bảng 4.2: Kết quả khảo sát kích thƣớc quả thể nấm Hồng Chi
Nghiệm thức Tỷ lệ mùn cƣa: bã mía Đƣờng kính quả thể Độ dài cuống nấm Độ dày quả thể 1 100:0 12.2 5.7 1.4 2 95:5 12.7 5.3 1.2 3 90:10 12.6 5.6 1.4 4 85:15 12.2 5.7 1.2 5 80:20 12.5 5.6 1.3 6 75:25 12.7 5.8 1.3 7 70:30 12.8 5.7 1.4 8 65:35 12.8 5.5 1.4 9 60:40 13.1 6.3 1.6 10 55:45 13.6 6.5 1.4 11 50:50 13.5 6.2 1.5 12 45:55 12.6 6.2 1.1 13 40:60 13.1 5.5 1.2 14 35:65 13.3 5.6 1.4 15 30:70 12.5 6.1 1.2 16 25:75 12.4 5.3 1.6 17 20:80 12.2 5.4 1.7 18 15:85 11.8 5.9 1.4 19 10:90 11.7 5.8 1.3 20 5:95 11.3 5.8 1.1 21 0:100 11.8 5.1 1
40
Biểu đồ 4.2: Kết quả khảo sát kích thƣớc quả thể nấm Hồng Chi
Qua biểu đồ 4.2 cho thấy, nấm Hồng Chi đƣợc nuôi trồng trên môi trƣờng nghiệm thức số 10 có kích thƣớc tốt hơn so với những nghiệm thức còn lại về độ dài cuống và đƣờng kính quả thể.
4.2.2 Kết quả khảo sát trọng lƣợng nấm Hồng Chi
Nấm Hồng Chi đƣợc thu hái trên 5 bịch phôi ở từng nghiệm thức. Sau đó đƣợc tiến hành thí nghiệm khảo sát trọng lƣợng. Kết quả thể hiện ở bảng 4.3 và Biểu đồ 4.3 nhƣ sau:
41
Bảng 4.3: Kết quả khảo sát trọng lƣợng của nấm Hồng Chi
Nghiệm thức Tỷ lệ mùn cưa:bã mía Khối lượng tươi (g) Khối lượng khô (g) Hàm lượng nước (%) 1 100:0 198 70 64.5 2 95:5 195 69 64.7 3 90:10 196 71 63.9 4 85:15 192 67 65.2 5 80:20 194 65 66.7 6 75:25 197 67 66.2 7 70:30 198 65 69.4 8 65:35 203 65 68.3 9 60:40 210 74 64.7 10 55:45 215 75 65.2 11 50:50 212 73 65.8 12 45:55 205 70 65.9 13 40:60 202 72 64.5 14 35:65 203 70 65.6 15 30:70 198 71 64.3 16 25:75 193 67 65.3 17 20:80 193 69 64.3 18 15:85 191 66 65.6 19 10:90 188 62 67.2 20 5:95 182 65 64.5 21 0:100 179 64 64.2
42
Biểu đồ 4.3: Kết quả khảo sát trọng lƣợng của nấm Hồng Chi
Nhận xét:
Từ kết quả ở bảng 4.3, Biểu đồ 4.3 cho thấy trọng lƣợng khô của nấm Hồng Chi thu hái đƣợc cao ở nghiệm thức 10 (75 gam) và thấp nhất ở nghiệm thức 21 (64 gam). Hàm lƣợng nƣớc có trong nấm Hồng Chi khá cao từ 64,2% – 69,4%. Giải thích cho kết quả này là do nấm Hồng Chi đƣợc thu hái ở giai đoạn 3 tuần tuổi, đây là giai đoạn nấm hút nƣớc nhiều để sinh trƣởng và tăng kích thƣớc tai nấm.
4.3 KẾT QUẢ KHẢO SÁT DƢỢC TÍNH NẤM HỒNG CHI 4.3.1 Định tính alkaloid 4.3.1 Định tính alkaloid
+ Tiến hành thí nghiệm nhƣ mục 3.3.6. thu đƣợc kết quả nhƣ sau: Nấm Hồng Chi thu hái trên 21 môi trƣờng nghiệm thức đều chứa alkaloid.
43
Hình 4.1: Phản ứng định tính Alkaloid
(a) Thử với thuốc thử Mayer; (b) Thử với thuốc thử Dragendorff
4.3.2 Định tính saponin
+ Tiến hành thí nghiệm nhƣ mục 3.2.6.2 thu đƣợc kết quả nhƣ sau: Nấm Hồng Chi thu hái trên 21 môi trƣờng nghiệm thức đều saponin.
4.3.3 Định tính triterpenoid
Hình 4.2: Thử nghiệm tính tạo bọt
44
+Tiến hành thí nghiệm nhƣ mục 3.2.6.3 thu đƣợc kết quả nhƣ sau: Nấm Hồng Chi thu hái trên 21 môi trƣờng nghiệm thức đều chứa triterpenoid
Hình 4.3: Phản ứng Liebermann – Burchard định tính Triterpenoid
(a) ống mẫu; (b) ống chứa anhydride acetic, chloroform, H2SO4 đậm đặc; (c) ống mẫu hòa trong anhydride acetic, chloroform, H2SO4 đậm đặc; (1) lớp
trên màu xanh lục; (2) vòng ngăn cách màu nâu đỏ.
4.3.4 Định tính acid hữu cơ
+Tiến hành thí nghiệm nhƣ mục 3.3.6.4 thu đƣợc kết quả nhƣ sau: Nấm Hồng Chi thu hái trên 21 môi trƣờng nghiệm thức đều chứa acid hữu cơ.
4.3.5 Định lƣợng Polysaccharide (GPLs)
Cân 14g nấm Hồng Chi ở từng nghiệm thức và tiến hành theo thí nghiệm 3.3.6.5, kết quả đƣợc trình bày ở bảng 4.4:
45 Bảng 4.4: Lƣợng polysaccharide thu nhận đƣợc Nghiệm thức Tỷ lệ mùn cưa:bã mía Trọng lượng polysaccharide (g) Hàm lượng (%) 1 100:0 0.17 1.13 2 95:5 0.17 1.13 3 90:10 0.16 1.07 4 85:15 0.15 1.00 5 80:20 0.16 1.07 6 75:25 0.14 0.93 7 70:30 0.15 1.00 8 65:35 0.15 1.00 9 60:40 0.15 1.00 10 55:45 0.16 1.07 11 50:50 0.15 1.00 12 45:55 0.14 0.93