I. TỔNG QUAN VỀ CÁC LOÀI ỐC CỐI VÀ ĐỘC TỐ CỦA CHÚNG
1.3.3.Tình hình nghiên cứu di truyền ốc cối
Sử dụng chỉ thị DNA ty thể trong phân loại và xây dựng hệ thống phát sinh loài của ốc cối.
Việc phân tích mối quan hệ phát sinh chủng loại của các loài dựa trên các đặc điểm hình thái giải phẫu (mà chủ yếu là kích thước, màu sắc, hoa văn vỏ, cấu tạo tuyến độc tố, cấu trúc răng kitin, …) đôi khi mang lại kết quả không chính xác, đặc biệt là đối với các loài có quan hệ gần gũi vì chúng có nhiều đặc điểm hình thái giải phẫu giống nhau. Vì vậy, việc sử dụng các chỉ thị phân tử để định danh loài và xác định một cách chính xác quan hệ phát sinh chủng loại loài là điều rất cần thiết. Việc xây dựng cây phát sinh chủng loại có thể dựa trên phân tích trình tự một gen hoặc một họ gen. Tuy nhiên, dữ liệu phân tích cũng có thể mở rộng hơn, chẳng hạn kết hợp nhiều gen hoặc nhiều vùng DNA khác nhau.
Với những loài có quan hệ gần, các gen hay vùng DNA có độ linh động cao (như intron, các vùng liên gen - đoạn chèn) thường hay được sử dụng. Song với các loài có quan hệ xa thì các gen hay vùng DNA có độ bảo thủ cao như gen mã hóa các rRNA hay một protein ty thể hoặc nhân thường được sử dụng. Để tăng độ tin cậy, các nghiên cứu hiện nay thường sử dụng kết hợp cả hai (vùng DNA có độ bảo thủ với vùng DNA có độ biến thiên cao). Hơn thế nữa, các chỉ thị ty thể cũng thường được sử dụng kết hợp với các chỉ thị nhân. Đối với các động vật thân mềm, DNA ty thể đã được chứng minh là công cụ hữu hiệu trong phân tích mối quan hệ loài. Các chỉ thị (marker) của DNA ty thể thường được sử dụng là các gen mã hóa 12S rRNA, 16S rRNA, cytochrome b, cytochrome oxydase, tRNA, và một số vùng không mã hóa như vùng liên gen trnF-cox3, atp6-trnM, cox1-cox2, cox3-trnK, nad1-trnP (Grande và cs, 2008; Michael và Robert, 2005). Tuy nhiên, sử dụng toàn bộ trình tự DNA ty thể sẽ giúp nâng cao độ phân giải và ý nghĩa thống kê so với việc sử dụng từng đoạn gen riêng lẻ. Gen 16S rRNA mang đặc điểm cấu trúc cơ bản, có mặt ở
khắp nơi và có đặc tính tiến hóa, bởi vậy nó trở thành marker phổ biến nhất trong sinh học phân tử.
Bandyopadhyay và cs (2008) khi phân tích trình tự bộ gen DNA ty thể của
C. textile đã phát hiện đoạn chèn (intergenic) giữa gen coxI/coxII của C. textile lớn hơn (165bp), nghiên cứu đã chứng minh đoạn chèn giữa gen này rất hữu dụng trong các nghiên cứu về tiến hóa, cũng như định danh loài.
Nghiên cứu mối quan hệ tiến hóa
Đối với lớp chân bụng Gastropoda, DNA ty thể đã được chứng minh là công cụ hữu hiệu trong phân tích đa dạng loài (Grande và cs, 2008). Các marker chuẩn của DNA ty thể thường được sử dụng là các gen mã hóa cytochrome b, 12S rRNA, 16S rRNA, tRNA-Val,...và một số vùng không mã hóa như vùng liên gen trnF- cox3, atp6-trnM, cox1-cox2, cox3-trnK, nad1-trnP. Việc sử dụng toàn bộ trình tự DNA ty thể cũng nâng cao độ phân giải và độ tin cậy thống kê so với sử dụng từng đoạn gen riêng lẻ.
Tuy nhiên, cho tới nay, mối quan hệ phát sinh chủng loại của các loài thuộc giống ốc cối vẫn chưa được giải quyết một cách triệt để do các marker phân tử của DNA ty thể tỏ ra ít tin cậy khi được áp dụng để xác định vị trí phân loại của các loài mới tách ra (Espiritu và cs, 2002; Duda và cs, 2001; Duda và Kohn, 2005). Vì vậy, trong các nghiên cứu tiến hóa gần đây, các marker DNA ty thể thường được sử dụng kết hợp với các marker nhân có tốc độ tiến hóa thấp hơn và trong một số trường hợp cho thấy mối quan hệ tiến hóa rõ hơn (Duda & Palumbi, 1999; Cunha và cs, 2005; Duda và Kohn, 2005; Bandyopadhyay và cs, 2008; Nam và cs, 2009). Một số marker nhân đã được khảo sát bao gồm các vùng gen mã hóa 18S rRNA, 28S rRNA, EF1-α, Histone H3, calmodulin,…và vùng không mã hóa như đoạn chèn ITS2 (Internal Transcribed Spacer 2).
Các marker phân tử cũng được ứng dụng rộng rãi để nghiên cứu sự tiến hóa và mối quan hệ loài của độc tố ốc cối. Espiritu và cs (2001) nghiên cứu sự đa dạng của độc tố δ-conotoxin trên 9 loài ốc cối. Kết quả cho thấy độc tố của các loài trên
phân thành những nhóm chuyên biệt (distinct clade): nhóm 5 loài ốc ở khu vực biển Ấn Độ Dương sử dụng thức ăn là cá (Clade 1), nhóm 2 loài ốc ăn nhuyễn thể (Clade 5) và nhóm 2 loài ốc ăn cá ngoài khu vực biển Ấn Độ Dương (Clade 3).
Duda và Kohn (2005) khảo sát giả thuyết về sự phát sinh loài dựa trên trình tự của DNA ti thể (16S) và gen calnodulin của DNA bộ gen của 138 loài ốc cối ở vùng biển Ấn Độ Dương, Tây Thái Bình Dương và Đại Tây Dương. Kết quả chỉ ra rằng các loài ốc cối là con cháu từ 2 dòng chính và phân hóa ít nhất cách đây 33 triệu năm. Dựa trên sự phân bố địa lý, 1 nhóm bắt nguồn từ vùng biển Ấn Độ Dương và nhóm kia thuộc khu vực Đông Thái Bình Dương và Tây Đại Tây Dương.
Duda và cs (2001) tiến hành nghiên cứu nguồn gốc của chế độ ăn của ốc cối dựa trên các marker phân tử 16S, calmodulin và sự kết hợp của 2 gen trên. Kết quả từ cây tiến hóa cho thấy chế độ ăn giun biển (errant polychaetes) là phương thức ăn cổ xưa nhất. Sự chuyên hóa trong chế độ ăn dựa trên các loài nhuyễn thể khác cũng như sự chuyển chế độ ăn trên các họ giun biển khác nhau như Terebellidae, Nereidae, và Amphinomidae, được tiến hóa riêng biệt và có lẽ chỉ 1 lần, trong khi đó chuyên hóa trên chế độ ăn các loài cá có thể xuất hiện 2 đến 3 lần. Sự khác biệt trình tự gen cho thấy sự phân hóa chế độ ăn của ốc cối xuất hiện ở kỷ Miocene và tồn tại cho đến ngày nay.
Nam và cs (2008) đề xuất việc sử dụng marker bộ gen (nuclear marker), đoạn chèn giữa gen N02 (đoạn giữa của 5,8S và 28S) của DNA ribosome - Internal Transcribed Spacer 2 (ITS2). Với 1 số đặc tính được ghi nhận (là đoạn không mã hóa nên ít chịu áp lực của quá trình tiến hóa, chứa tần suất lớn các indel), trình tự của ITS 2 rất hữu hiệu trong việc xác định vị trí phân loại ở mức độ loài. Các tác giả đã sử dụng 26 trình tự của ITS2 để xác định mối quan hệ loài của các loài ốc ăn nhuyễn thể với loài ăn cá và giun biển. Kết quả cho thấy trình tự ITS2 rất conserved giữa các cá thể của cùng 1 loài, nhưng lại thể hiện sự đa dạng ở mức độ phù hợp cho việc xác định vi trí phân loại của các loài mới phân hóa. Khi đoạn ITS2 được kết hợp với gen CO1 của DNA ti thể và các gen bảo tồn của DNA ribosome (16S và
12S), và với mô hình tiến hóa phù hợp, giá trị tin cậy tăng lên khi xây dựng cây tiến hóa, Có 3 nhánh chính được xác định trong nhóm 12 loài ốc ăn nhuyễn thể, đó là
Conus marmoreus và C. bandanus có quan hệ gần gũi với nhánh Cylinder
(Montfort, 1810; textile, ammiralis, dalli and gloriamaris) và nhánh Darioconus
(Iredale, 1930, aulicus, crocatus, episcopatus, omaria và furvus).
Nghiên cứu đinh danh các loài ốc cối và phân biệt các loài cận giống
Hiện nay, phân loại ốc cối chủ yếu dựa vào kích thước vỏ, kiểu, hoa văn và màu sắc hay vân trên vỏ, cụ thể là những đường gờ hay phần lồi trên vỏ (Kohn và cs, 1999). Bên cạnh đó, mô tả các dải răng chitin cũng được coi là một chỉ tiêu phân loại quan trọng (Frankin và cs, 2007, Duda và cs, 2009). Sự định danh chính xác loài ốc cối và chế độ ăn của ốc cối cũng cần đến các nghiên cứu về mối quan hệ tiến hóa giữa các loài trong giống Conus (Duda và cs, 2001). Hơn thế nữa, chỉ thị phân tử DNA ty thể đã được chứng minh là công cụ hữu hiệu trong phân tích mối quan hệ loài, đa dạng di truyền, định danh phân loại và phân biệt các loài cận giống (Baxter 2003, 2004 Hebert và cs, 2003 a, b; Stoekle 2003).
Duda và cs (2009) phát hiện trình tự DNA ty thể và DNA nhân khác biệt ở những cá thể loài ốc cối C. ebraeus có vùng phân bố rộng ở vùng biển nhiệt đới Okinawa. Các cá thể này không thể phân biệt được bằng hình dạng và kiểu vân trên vỏ. Trên thực tế, kích thước và hình dạng răng kitin, loại mồi trong tự nhiên và khu vực sống thể hiện sự khác biệt đáng kể và có thể phân thành 2 dạng hình thái. Cá thể trưởng thành với kiểu gen và hình thái răng kitin chuẩn của C. ebraeus chủ yếu ăn giun biển, trong khi đó dạng với trình tự DNA chủ yếu săn loại mồi là Sedentary capitellids (giun biển cố định). Răng kitin của dạng khác biệt về trình tự tượng tự với loài C. judaeus vốn được phân biệt với C. ebraeus bởi Rudolph Bergh năm 1895 (chỉ dựa vào răng kitin của 1 mẫu vật thu ở Philippine). Nhóm tác giả khẳng định sự tồn tại của loài C. judaeus dựa vào các dẫn liệu hình thái, sinh thái và di truyền.
Nghiên cứu cấu trúc hệ gen
Bandyopadhyay và cs (2008) tiến hành phân tích trình tự gen DNA ti thể của ốc cối cho thấy thứ tự gen (gene orders) là tương tự giữa Conus textile và Lophiotoma cerithiformis (loài khác thuộc Conoidean) và Neogastropod Ilyanassa obsoleta
(không thuộc tổng họ Conoidea). Tuy nhiên, đoạn chèn (intergenic) giữa gen coxI
and coxII của C. textile lớn hơn (165 bp). Nghiên cứu đã chứng minh đoạn chèn giữa gen này rất hữu dụng trong các nghiên cúu về tiến hóa, cũng như định danh loài.
Hình 1.17: Cấu trúc hệ gen ty thể của Conus textile. Mũi tên ký hiệu gen CO1 và 16S
Hệ gen ty thể của Conus textile là một phân tử DNA dạng vòng, có chiều dài 15562 nucleotide, mã hóa cho: 13 protein ty thể [3 cytochrome oxidase (các gen
coxI, coxII, coxIII); cytochrome b (gen cob); tiểu đơn vị 6 và 8 của ATPasegen atp6 và atp8); các tiểu đơn vị từ 1-6 và tiểu đơn vị 4L của NADH dehydrogenase (các gen nad1-nad6 và nad4L)]; 2 rRNA; 22 tRNA [D, V, L (1), L (2), P, S (1), S (2), H, F, K, A, R, N, I, M, Y, C, W, H, G, E và T] (Bandyopadhyay và cs, 2008).
CHƯƠNG II:
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
II.1. PHƯƠNG PHÁP, ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU VÀ ĐỊA ĐIỂM THU MẪU (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Mẫu ốc cối được thu 2 lần/năm và đại diện cho mùa mưa và mùa khô cụ thể là tháng 5 và tháng 10 năm 2010 tại Lý Sơn (Quảng Ngãi), Cù Lao Chàm (Quảng nam), vịnh Vân Phong (Khánh Hòa) và Sông Cầu (Phú Yên). Địa điểm thu mẫu được mô tả ở hình 2.1. Mẫu ốc cối được vận chuyển về phòng thí nghiệm trong Nitơ lỏng và được phân loại sơ bộ sau đó bảo quản ở tủ đông sâu -700C cho các phân tích tiếp theo.
Các loài ốc được mô tả đặc điểm hình thái bao gồm: Conus marmoreus,
Conus bandanus, Conus imperialis, Conus caracteristicus, Conus capitaneus, Conus betulinus và Conus lividus. Bên cạnh đó có 3 nhóm loài có hình thái chưa rõ nét được xử lý vỏ ốc để quan sát hình thái đồng thời tiến hành giải trình tự gen 16S mtDNA và ITS2 rRNA để kiểm chứng định danh loài bao gồm các nhóm loài sau:
C. marmoreus và C. bandanus; C. leopardus và C. litteratus; C. distans và Conus cf. distans.
Hình 2.1: Địa điểm thu mẫu ốc cối tại vùng biển Nam Trung Bộ
II.2. MÔ TẢ ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI
Tiến hành chọn trong mỗi loài nhiều con có kích thước khối lượng khác nhau để làm mẫu nghiên cứu.
Mẫu ốc được rửa bằng nước sạch và đặt lên khay đá để ráo nước.
Đo chiều cao vỏ, chiều cao tầng thân, chiều rộng, chiều cao tháp vỏ của mẫu (Hình 2.2).
Cân khối lượng từng mẫu.
Chụp ảnh và quan sát số lượng đường xoắn ốc, đường suture, màu sắc và hoa văn.
Ốc được định danh dựa vào đặc điểm hình thái theo Rockel và cs (1995) và Nguyễn Ngọc Thạch (2007) và đối chiếu mẫu với các thông số phân loại theo bảng dưới đây (Bảng 2.1, 2.2, 2.3 và 2.4): hình 2.3
Bảng 2.1: Thông số dùng để phân loại kích cỡ chiều dài của ốc theo Verlag Christa Hemmen (1995) L (mm) Phân loại <15 Rất nhỏ 15 – 25 Nhỏ 25 – 35 Nhỏ vừa phải 35 – 55 Trung bình 55 – 80 Lớn vừa >80 Lớn
Bảng 2.2: Công thức được dùng để phân loại trọng lượng của các loài ốc theo Verlag Christa Hemmen (1995)
RW (W/L, gam/mm) Phân loại
<0.06 Nhẹ 0.06 - 0.1 Nhẹ vừa 0.1 - 0.3 Rắn vừa 0.3 - 0.8 Rắn 0.8 -1.1 Nặng vừa >1.1 Nặng
Bảng 2.3: Công thức dùng để phân loại hình thái của ốc cối theo Verlag Christa Hemmen (1995)
PMD (l2/L); RD (Dmax/L) Phân loại
PMD > 0.85; RD: 0.5 – 0.7 Hình nón PMD > 0.85; PD > 0.7 Hình nón rộng PMD > 0.85; RD < 0.5 Hình nón hẹp PMD: 0.75 -0.85; RD > 0.7 Rộng, nón lồi PMD: 0.75 -0.85; RD: 0.5 - 0.7 Hình trụ PMD: 0.75 - 0.85; RD < 0.5 Hình trụ, nón hẹp PMD < 0.75; RD > 0.7 Hình trứng, rộng hoặc hình trụ rộng PMD < 0.76; RD: 0.5 – 0.7 Hình trứng hoặc hình trụ PMD < 0.77; RD <0.5 Hình trứng hẹp hoặc hình trụ hẹp
Bảng 2.4: Công thức dùng để phân loại kích cỡ của ốc cối theo Verlag Christa Hemmen (1995) RSH (L – l2)/L Phân loại < 0.12 Thấp 0.12 - 0.23 Vừa phải > 0.23 Cao
Hình 2.3: Các dạng hình dạng vỏ của Conus tính theo công thức PMD và RD
RW = W/L
PMD = l2/L; RD =Dmax/L RSH = (L-l2)/L
RD: đường kính tương đối của ốc cối L: chiều cao vỏ của ốc cối
nón rộng Rộng, nón lồi Trứng rộng Trứng Hình trụ Trụ rộng Nón rộng Hình nón Hình trụ hẹp Trứng hẹp Trụ hẹp Hình nón hẹp
Dmax: đường kính lớn nhất (chiều rộng) của ốc cối l1: chiều cao tháp vỏ của ốc cối
l2: chiều cao tầng thân của ốc cối W: khối lượng của ốc cối
RW: Trọng lượng tương đối của ốc PMD: Vị trí của đường kính tối đa RSH: Chiều cao tương đối của tháp vỏ RD: Đường kính tương đối của ốc cối
Giải phẫu tách tuyến nọc độc:
Dùng búa đập bỏ vỏ mẫu ốc đã được rửa sạch để ráo nước, đặt nội quan vào đĩa petri (được giữ trên khay đá). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Dùng dao mổ và kéo cắt tại vị trí chứa tuyến nọc độc.
Dùng panh, dùi, kéo loại bỏ các mô không dùng để nghiên cứu, chuyển tuyến nọc độc qua đĩa petri mới để tách các cơ quan, quan sát và đo kích thước (chiều dài và đường kính (túi chứa độc, ống dẫn độc, vòi hút, túi răng kitin), chụp ảnh các cơ quan trong tuyến nọc độc, vẽ và mô tả các cơ quan đó.
Nghiên cứu cấu trúc răng chitin:
Để nghiên cứu răng chitin dùng kéo cắt túi chứa răng chitin, sau đó tách các răng, đếm số lượng, lấy răng ở các mẫu rửa sạch với cồn 700C, sau đó đặt lên lam kính đậy lam men sao cho không tạo bọt, quan sát dưới kính hiển vi điện tử ngắm có gắn camera và kết nối máy tính (BX45) để chụp ảnh, quan sát dưới vật kính 4x, 10x và đo kích thước.
II.3. NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN CỦA ỐC CỐI (Conus spp.)
Tách chiết ADN, khuếch đại gen và giải trình tự được tiến hành theo quy trình như hình 2.4 bao gồm các bước sau:
Hình 2.4: quy trình tách chiết ADN, khuếch đại gen và giải trình tự
Tách chiết DNA tổng số
DNA được tách chiết từ mẫu cơ của từng cá thể ốc cối bằng bộ kit WIZARD SV genomic DNA purification (Promega).
Các bước tiến hành: Mồi 16S ITS2 WIZARD SV Genomic DNA Purification (Promega) TÁCH CHIẾT DNA Phản ứng PCR ĐIỆN DI SO SÁNH KHÁC BIỆT DI TRUYỀN GIẢI TRÌNH TỰ
Kết nối: Vector NTI Kiểm tra: BLAST Chỉnh sửa: BioEdit 7.0.1 Dóng hàng: Clustal X Ver. 1.8
Cắt một mảnh nhỏ chừng khoảng 0,2 cm2 mẫu mô cơ, rửa sạch bằng cồn 70oC cắt nhỏ mẫu rồi cho vào các ống Eppendorf 1,5 ml đã khử trùng.
Sau đó thêm vào 275 µl dung dịch phá tế bào (Digestion Solution Master Mix) vào mỗi ống.
Ủ ống mẫu qua đêm trên các block nhiệt ở 55oC.
Thêm 250 µl dung dịch đệm (Wizard SV Lysis Buffer) vào mỗi ống, sau đó đem vortex nhẹ.
Hút phần dịch nổi ở mỗi ống sang các cột Wizard SV Minicolumn (được đặt trên các ống thu mẫu 1.5 ml).
Ly tâm 13000 vòng trong 3 phút.
Chuyển các cột Wizard SV Minicolumn sang các ống thu mẫu 1,5 ml mới