Flavonnoids là các hợp ch t thuộc các hợp ch t phenolic đa vịng: Hình 1.8 C u tạo một số hợp ch t saponin
25
1.10.3 Công dụng của lá sake
Lá cây sake tƣơi có tác dụng kháng sinh, tiêu viêm, lợi tiểu, khi phối hợp với lá đu đủ non tƣơi, giã với vôi để đắp trị mụn.
Lá cây sake cịn có tác dụng điều trị ệnh gout, sỏi thận, cao huyết áp, đái tháo đƣờng[5].
1.11 Các phƣơng pháp chiết dịch từ thực vật
1.11.1 Phương pháp chiết xuất gián đoạn
Phƣơng pháp ngâm: đơn giản nh t
Tiến hành: sau khi chuẩn ị nguyên liệu, ngƣời ta đổ dung môi cho ngập nguyên liệu trong ình chiết sau một thời gian ngâm nh t định, rút l y dịch chiết (lọc và gạn) và rửa nguyên liệu ằng một dung mơi thích hợp. Có thể khu y trộn ằng cánh khu y hoặc rút dịch chiết ở dƣới rồi lại đổ lên trên. Có nhiều cách ngâm: ngâm tĩnh hoặc ngâm động, nóng hoặc lạnh, một lần hoặc nhiều lần.
Ƣu điểm: đơn giản, dễ thực hiện, thiết ị đơn giản, rẻ tiền.
Nhƣợc điểm: n ng su t th p, thủ cơng. Chiết 1 lần thì không chiết kiệt đƣợc thành phần, chiết nhiều lần thì dịch chiết lỗng, tốn dung mơi, thời gian[14].
1.11.2 Phương pháp ngấm kiệt
Tiến hành: sau khi chuẩn ị nguyên liệu, ngâm nguyên liệu vào dung mơi trong ình ng m kiệt. Sau một thời gian xác định rút nhỏ giọt dịch chiết ở phía dƣới, đồng thời ổ sung thêm dung mơi ở phía trên ằng cách cho dung môi chảy r t chậm và liên tục qua lớp nguyên liệu nằm yên. Dung môi thƣờng ngập ề mặt khoảng 3 - 4 cm. Ng m kiệt đơn giản: luôn sử dụng dung môi mới chiết để kiệt. Ng m kiệt phân đoạn: sử dụng dịch chiết loãng để chiết mẻ mới hoặc để chiết các mẻ có mức độ chiết kiệt khác nhau.
26
Nhƣợc điểm: n ng su t th p, thủ công, phức tạp hơn phƣơng pháp ngâm[14].
1.11.3 Phương pháp chiết xuất bán liên tục
Phƣơng pháp này sử dụng một hệ thống gồm nhiều ình chiết khác nhau, có thể mắc thành một dãy từ 4 – 16 bình chiết nối tiếp nhau (coi ngƣợc chiều là tƣơng đối vì dịch chiếtkhơng chuyển động).
Tiến hành:nguyên liệu và dung môi đƣợc nạp vào trong t t cả các thiết ị, nguyên liệu đƣợc ngâm trong dung môi trong khoảng thời gian xác định. Sau đó dịch chiết đƣợc chuyển tuần tự từ thiết ị này qua thiết ị khác. Hệ thống tổ hợp kín này cho phép đóng ngắt một cách có chu kỳ thiết ị ra khỏi hệ thông, cho phép tháo ã và nạp nguyên liệu mới. Sau đó thiết thiết ị này lại đƣợc đƣa vào hệ thống và dịch chiết đậm đặc nh t đƣợc qua nó và các thiết ị cón lại. Tiếp theo đóng ngắt một thiết ị kế tiếp, càng nhiều thiết ị thì quá trình càng gần quá trình liên tục. Quá trình xảy ra theo nguyên tắc: dung môi mới tiếp xúc với nguyên liệu cũ và nguyên liệu mới tiếp xúc với dung môi cũ. Ƣu điểm: dịch chiết đậm đặc, nguyên liệt đƣợc vắt kiệt.
Nhƣợc điểm: hệ thồng cồng kềnh chiếm nhiều diện tích. Vận hành phức tạp, thao tác thủ cơng, khơng tự động hóa đƣợc[14].
1.11.4 Phương pháp chiết xuất liên tục
Tiến hành: đƣợc tiến hành trong những thiết ị làm việc liên tục, nguyên liệu và dung môi liên tục đƣợc đƣa vào chuyển động ngƣợc chiều trong thiết ị. Nguyên liệu di chuyển nhờ cơ c u vận chuyển chuyên dụng khác nhau. Dịch chiết trƣơc khi tiếp xúc với nguyên liệu mới nên dịch chiết thu đƣợc đậm đặc. Bã nguyện liệu đƣợc tiếp xúc với dung môi mới trƣớc khi thay nên đƣợc chiết kiệt.
Ƣu điểm: N ng su t cao, tiết kiệm thời gian, không phải làm thủ cơng có thể tự đơng hóa, cơ giới hóa. Dịch chiết đệm đặc, nguyên liệu đƣợc chiết kiệt, dung mơi ít tốn kém[14].
27
CHƢƠNG 2 THỰC NGHIỆM
2.1 Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị, dụng cụ
2.1.1 Nguyên liệu
- Lá sake tƣơi đƣợc thu hái tại thành phố Hồ Chí Minh.
- Nghiên cứu đƣợc thực hiện trong phạm vi quy mơ phịng thí nghiệm.
2.1.2 Hóa chất
Bảng 2.1 Bảng hóa ch t sử dụng trong nghiên cứu
2.1.3 Thiết bị, dụng cụ
Bảng 2.2 Bảng các thiết ị sử dụng trong nghiên cứu
STT Hóa chất STT Hóa chất
1 CuSO4.5H2O 4 Nƣớc c t
2 HCl 5 NaOH
3 H2SO4 6 Gi y pH, gi y lọc
STT Dụng cụ STT Dụng cụ
1 Máy khu y từ gia nhiệt 9 Máy xay sinh tố 2 Cân điện tử 10 Phễu thủy tinh
3 Tủ s y 11 Buret
4 Cá từ 12 Beaker
5 Máy UVVIS 13 Erlen
6 Cuvet 14 Nhiệt kế
7 Bình định mức 15 Bóp cao su
28
2.2 Quy trình chiết dịch lá sake
Hình 2.1 Quy trình chiết dịch lá sake
Lá sake tƣơi đƣợc thu hái và xử lý trong từng uổi thí nghiệm. Lá sake đƣợc rửa sạch, mang đi m nhỏ. Cân 10g lá sake cho vào ngâm với nƣớc trong khoảng thời gian khảo sát. Sau đó mang đi chiết l y dịch chiết lá sake. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình chiết nhƣ thời gian chiết và tỷ lệ rắn/lỏng (khối lƣợng lá/200ml H2O) đƣợc khảo sát.
2.3 Khảo sát thông số ảnh hƣởng đến quá trình chiết lá sake
2.3.1 Khảo sát thời gian chiết
Tiến hành ngâm chiết lá sake trong các thời gian khác nhau 10 phút, 15 phút, 20 phút, 25 phút, 30 phút để xác định thời gian phù hợp để dịch chiết có lƣợng ch t khử thích hợp nh t để khử với CuSO4 tạo hạt nano đồng. Các mức thời gian này đƣợc chọn để giảm thiểu các ch t khử có trong dịch chiết ị oxi hóa trong khơng khí và đủ để tạo phản ứng tổng hợp hạt nano đồng.
29
2.3.2 Khảo sát tỷ lệ rắn lỏng
Tƣơng tự với thời gian chiết ta cũng tiến hành khảo sát tỷ lệ rắn/lỏng khác nhau với khối lƣợng lá thay đổi 10g, 15g, 20g, 25g, 30g để xác định tỷ lệ thích hợp tạo ra đƣợc hạt nano với hiệu su t cao.
2.4 Quy trình thực nghiệm tổng hợp hạt nano đồng
Hình 2.2 Quy trình tổng hợp nano đồng sử dụng dịch chiết lá cây sake
Cho dung dịch CuSO4 vào dịch chiết vừa thu đƣợc để thực hiện phản ứng tạo hạt nano đồng. Hỗn hợp đƣợc điều chỉnh pH sử dụng dung dịch NaOH hay H2SO4, sau đó mang hỗn hợp lên ếp khu y từ khu y và gia nhiệt để tạo phản ứng.
Dung dịch sau phản ứng sẽ đƣợc mang đi phân tích trên máy quét phổ UV-Vis xác định đỉnh h p thu cực đại, độ dịch chuyển của các đỉnh h p thu cực đại, từ đó có thể dự đốn đƣợc khả n ng hình thành cũng nhƣ hình thái hạt nano đồng trong dung dịch sau quá trình tổng hợp. Phân tích nhiễu xạ XRD đƣợc tiến hành để xác định c u trúc tinh thể của nano đồng thu đƣợc. Trong khi đó SEM, TEM đƣợc dùng để xác định hình thái, phân ố kích thƣớc hạt nano đồng trong
30 dung dịch.
Các yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu su t của các giai đoạn trong quá trình tổng hợp ao gồm tỉ lệ mol tác ch t, nhiệt độ, thời gian phản ứng, pH, nhiệt độ đƣợc tập trung khảo sát.
2.5 Khảo sát các thơng số ảnh hƣởng đến q trình tạo hạt nano đồng
2.5.1 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ CuSO4
Tiến hành thực nghiệm khảo sát nồng độ CuSO4 ở nhiều nồng độ khác nhau, các nồng độ đƣợc chọn thay đổi: 1mM, 2mM, 3mM, 4mM, 5mM cố định các thơng số thể tích dịch chiết, nhiệt độ, thời gian, pH để xác định nồng độ thích hợp cho phản ứng đạt hiệu quả cao nh t.
2.5.2 Khảo sát ảnh hưởng thể tích dịch chiết từ lá sake
Tiến hành thực nghiệm khảo sát thể tích dịch chiết ở thể tích khác nhau, cố định các thông số nồng độ CuSO4, nhiệt độ, thời gian, pH để xác định thể tích thích hợp cho phản ứng đạt hiệu quả cao nh t.
2.5.3 Khảo sát ảnh hưởng thời gian phản ứng
Tiến hành thực nghiệm khảo sát thời gian ở nhiều mức thời gian khác nhau, cố định các thông số nồng độ CuSO4, nhiệt độ, thể tích dịch chiết, pH để xác định thời gian phù hợp cho phản ứng tạo hạt nano đồng đạt hiệu quả cao nh t.
2.5.4 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ phản ứng
Tiến hành thực nghiệm khảo sát ở nhiều nhiệt độ khác nhau, cố định các thơng số nồng độ CuSO4, thể tích dịch chiết, thời gian, pH để xác định nhiệt độ phù hợp cho phản ứng tạo hạt nano đồng đạt hiệu quả cao nh t.
2.5.5 Khảo sát ảnh hưởng pH môi trường phản ứng
Tiến hành thực nghiệm khảo sát pH nhiều pH khác nhau, cố định các thông số nồng độ CuSO4, nhiệt độ, thời gian, thể tích dịch chiết để xác định pH phù hợp cho phản ứng tạo hạt nano đồng đạt hiệu quả cao nh t.
31
2.6 Khảo sát hoạt tính sinh học của hạt nano đồng
Tiến hành khảo sát khả n ng kháng n m của hạt nano đồng vừa mới tổng hợp trên chủng vi khẩn gram dƣơng (+) đại diện là vi khuẩn Bacillus Su tilis và Staphylococcus aureus
Khảo sát đƣợc thực hiện ởi Phòng sinh học thực nghiệm – Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (Viện hóa học các hợp ch t thiên nhiên) theo quy trình sau:
Hình 2.3 Quy trình khảo sát hoạt tính sinh học của nano đồng
Đậu tƣơng đƣợc rửa sạch, mang đi thủy phân để thu đƣợc dịch đậu tƣơng tạo môi trƣờng c y n m. Sau khi quá trình c y n m hoàn thành quá trình phơi nhễm với hạt nano đồng đƣợc thực hiện. Hỗn hợp đƣợc mang đi ủ trong khoảng thời gian xác định sau đó mang đi đo đƣờng kính tơ n m ta sẽ thu đƣợc kết quả kháng n m. Quá trình phơi nhiễm cũng đƣợc thực hiện cho các mẫu đối chứng ao gồm dung dịch CuSO4 và dịch chiết lá sake.
32 Chuẩn ị dung dịch mẫu:
L y trực tiếp dung dịch mẫu Mẫu 2: Dịch Sake
Mẫu 3: CuSO4 0.05M Mẫu 4: Nano đồng Sake
L y trực tiếp mẫu so sánh (nƣớc c t vô trùng)
Phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch, tiến hành 3 lần, l y kết quả trung ình Điều kiện thí nghiệm:
Thể tích dung dịch thử nhỏ vào mỗi lỗ thạch (Đƣờng kính 8 mm): 100 l Thể tích mơi trƣờng đƣa vào mỗi đĩa petri đƣờng kính 8 mm): 24 ml Nhiệt độ và thời gian nuôi c y:
Vi khuẩn: 37oC/18 giờ Sơ đồ thí nghiệm: Vị trí 2: Mẫu 2 Vị trí 3: Mẫu 3 Vị trí 4: Mẫu 4 Vị trí 7: Nƣớc
33
2.7 Các phƣơng pháp phân tích vật liệu nano đồng
- Phổ tử ngoại-khả kiến (UV-Vis): Phƣơng pháp quang phổ tử ngoại khả kiến hay còn gọi là phƣơng pháp quang phổ h p thụ, hay phƣơng pháp đo quang dựa trên khả n ng h p thụ chọn lọc các ức xạ soi vào dung dịch của ch t nghiên cứu trong một dung môi nh t định. Các mẫu trong nghiên cứu đƣợc đo trên máy UV-Vis Genesys20 của Mỹ.
- Nhiễu xạ tia X (X-ray diffraction, XRD)đƣợc sử dụng để phân tích c u trúc ch t rắn, vật liệu... Xét về bản ch t vật lý, nhiễu xạ tia X cũng gần giống với nhiễu xạ điện tử, sự khác nhau trong tính ch t phổ nhiễu xạ là do sự khác nhau về tƣơng tác giữa tia X với nguyên tử và sự tƣơng tác giữa điện tử và nguyên tử.
- Kính hiển vi điện tử truyền qua (tiếng Anh: transmission electron
microscopy, viết tắt: TEM) là một thiết ị nghiên cứu vi c u trúc vật rắn,
sử dụng chùm điện tử có n ng lƣợng cao chiếu xuyên qua mẫu vật rắn mỏng và sử dụng các th u kính từ để tạo ảnh với độ phóng đại lớn (có thể tới hàng triệu lần), ảnh có thể tạo ra trên màn huỳnh quang, hay trên film quang học, hay ghi nhận ằng các máy chụp kỹ thuật số.
34
- Kính hiển vi điện tử quét (tiếng Anh: Scanning Electron Microscope, thƣờng viết tắt là SEM), là một loại kính hiển vi điện tử có thể tạo ra ảnh với độ phân giải cao của ề mặt mẫu vật ằng cách sử dụng một chùm điện tử (chùm các electron) hẹp quét trên ề mặt mẫu. Việc tạo ảnh của mẫu vật đƣợc thực hiện thơng qua việc ghi nhận và phân tích các ức xạ phát ra từ tƣơng tác của chùm điện tử với ề mặt mẫu vật. Các mẫu trong nghiên cứu đƣợc đo trên máy FE-SEM S4800 sản xu t tại Hitachi Nhật Bản.
- Phổ tán xạ n ng lƣợng tia X hay Phổ tán sắc n ng lƣợng là kỹ thuật phân tích thành phần hóa học của vật rắn dựa vào việc ghi lại phổ tia X phát ra từ vật rắn do tƣơng tác với các ức xạ (mà chủ yếu là chùm điện tử có n ng lƣợng cao trong các kính hiển vi điện tử). Trong các tài liệu khoa học, kỹ thuật này thƣờng đƣợc viết tắt là EDX hay EDS xu t phát từ tên gọi tiếng Anh Energy-dispersive X-ray spectroscopy. Các mẫu trong
35
CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng tới quá trình chiết lá sake
Ảnh hƣởng của các yếu tố khác nhau nhƣ thời gian chiết, tỷ lệ rắn/lỏng đến quá trình chiết lá sake đƣợc khảo sát gián tiếp thông qua kết quả UV -Vis thu đƣợc từ phản ứng tổng hợp nano đồng. Trong nghiên cứu này, kết quả UV-Vis là kết quả then chốt đƣợc dùng để iện luận cho khả n ng hình thành hạt nano cũng nhƣ là ảnh hƣởng của các thông số phản ứng đến quá trình hình thành. Ở đây, trong toàn ộ nghiên cứu này, các kết quả UV-Vis không thể hiện mũi h p thu của hạt nano đồng ở vào khoảng 550-570 nm nhƣ các nghiên cứu khác đã áo cáo [9]. Thay vào đó, mũi h p thu thể hiện trên phổ UV-Vis một phần là của dịch chiết. Tuy nhiên, điều này không chứng tỏ là phản ứng tổng hợp nano đồng không xảy ra. Cụ thể, sự thay đổi trong cƣờng độ h p thu cũng nhƣ vị trí của các mũi h p thu khi thay đổi các điều kiện phản ứng nhƣ đƣợc trình ày trong các khảo sát dƣới đây sẽ khẳng định sơ ộ sự xu t hiện của hạt nano đồng tạo thành. Rõ ràng là, nếu phản ứng tổng hợp không xảy ra, cƣờng độ mũi h p thu trong phổ UV-Vis sẽ không đổi theo thời gian, hoặc nếu phản ứng xảy ra và mũi h p thu chỉ hoàn tồn là của dịch chiết thì cƣờng độ h p thu phải giảm. Điều này không thể hiện trong hầu hết các kết quả mà nghiên cứu này thu đƣợc. Chứng tỏ mũi h p thu trong phổ UV-Vis có sự đóng góp của hạt nano đồng tạo thành. Sự có mặt của hạt nano đồng cũng đƣợc xác nhận thơng qua các phƣơng pháp phân tích khác ao gồm TEM, SEM, EDX, XRD.