CHƢƠNG 3 : VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VỚI VI TẢO
3.3.1. Vật liệu
3.3.1.1 Nguồn vi tảo
Chủng tảo Chlorella spp thuần đƣợc cung cấp từ viện Nuôi Trồng Thủy Sản II Chủng tảo Chlorella spp đƣợc phân lập từ hồ nuôi tôm tại Cần giờ.
3.3.1.2. Nguồn nƣớc thải:
Địa điểm nguồn nƣớc thải: các ao tôm tại huyện Cần Giờ, Bình Khánh.
3.3.1.3. Nơi thực hiện:
Địa điểm tiến hành các phƣơng pháp nghiên cứu: tại Trƣờng đại học công nghiệp Tp. HCM, Viện cơng nghệ sinh học – thực phẩm phịng F.6.02 và F.6.03 .
3.3.1.4. Môi trƣờng nuôi cấy
Môi trƣờng F2 Môi trƣờng Zarrouk
3.3.2 Phƣơng pháp phân lập vi tảo từ nƣớc ao nuôi
Nguyên tắc phân lập:
Gieo cấy mẫu đã pha lỗng trên mơi trƣờng dinh dƣỡng đặc trƣng. Nuôi dƣỡng trong điều kiện thích hợp cho tảo mọc tách biệt nhau.
Tiếp theo cấy tách từ tảo mọc tách biệt sang ống môi trƣờng dinh dƣỡng thạch nghiêng để thu nhận chủng tảo thuần khiết.
Quy trình phân lập
Pha mơi trƣờng -> thu mẫu -> pha lỗng mẫu-> Ni cấy- > thu nhận ->kiểm tra -> bảo quản.
Pha mơi trƣờng: cân chính xác thành phần mơi trƣờng; hòa tan các chất vào nƣớc đun và khuấy cho tan; kiểm tra thể tích và pH; rót mơi trƣờng vào dụng cụ đậy
104
chặt nắp (đối với ống nghiệm) hay đổ vào các chai; khử trùng ở nồi hấp hơi nƣớc autoclave (1atm/1210C 30 phút) . Đổ môi trƣờng ra làm thạch ngiêng và thạch đĩa.
Thu mẫu: mẫu dùng đƣợc phân lập đƣợc lấy từ nƣớc thải ni tơm.
Pha lỗng mẫu: Hút 1ml nƣớc thải vào ống nghiệm thứ nhất có chứa 9ml nƣớc cất vô trùng. Trộn đều dung dịch bằng cách huyền phù 3 – 5 lần. Độ pha loãng mẫu lúc này là 10-1. Tiếp tục hút 1ml nƣớc ở ống nghiệm thứ nhất cho vào ống nghiệm thứ 2 chứa 9ml nƣớc cất vô trùng. Trộn đều nhƣ trên, độ pha loãng mẫu lúc này là 10-2. Tùy loại tảo mà ta sẽ pha lỗng mẫu đến một mức nào đó: 10-3, 10-4,… Sự phân tách các tế bào tảo có thể đƣợc thực hiện bằng cách ni cấy trên bề mặt thạch cho phép thu nhận dần dần các tế bào từ mẫu tạp nhiễm ban đầu.
Nuôi cấy: các đĩa thạch đã đƣợc cấy mẩu.nƣớc chứa tảo đƣợc ni ở điều kiện nhiệt độ phịng và chiếu sáng liên tục với cƣờng độ 3000-7000 lux.
Thu nhận: sau khoảng thời gian 7 ngày
Bảo quản: tảo đƣợc.giữ trong ống nghiệm trên môi trƣờng thạch hoặc trên mơi trƣờng lỏng có ánh sáng yếu (750- 1000 lux), ở nhiệt độ thấp, cần phải định kỳ cấy chuyền để tránh tảo già, chết và bi suy thối.
Phƣơng pháp xử lý của NH3 trong mơi trƣờng nƣớc:
Phƣơng pháp Nessler đƣợc áp dụng cho nƣớc uống tinh khiết, nƣớc thiên nhiên, nƣớc thải đã đƣợc làm sạch hoặc chƣng cất. tất cả các loại này phải có độ màu thấp và nồng độ N-NH3 lớn hơn 20 µg/l. áp dụng phƣơng pháp Nessler hóa trực tiếp đối với nƣớc thải sinh hoạt, có thể chấp nhận sai số của N-NH3 từ 1-2 mg/l. Ammoniac tác dụng với thuốc thử Nessler trong môi trƣờng kiềm theo phản ứng sau để cho phản ứng cho sản phẩm có màu vàng:
2(2KI.HgI2)+ NH3+KOH(NH2)Hg-O-HgI + 7KI + 2H2O
(màu vàng)
Đối với nƣớc thải, để tránh những trở ngại do các tập chất có trong mẫu gây ra, mẫu cần đƣợc chƣng cất và dịch phẩm thu đƣợc sẽ dung phƣơng pháp Nessler để xác định.
Phƣơng pháp Nessler hóa trực tiếp
Khử clo dƣ (chỉ áp dụng cho nƣớc thải sinh hoạt hoặc nƣớc thải nhiễm clo). Thêm 1 ml Na2S2O3 N/70 cho 1mg Cl2/l trong 50ml mẫu.
Thêm 1 ml ZnSO4 và 0,5 ml NaOH 6N (pH=10.5)) trong 100 ml mẫu, xáo trộn đều, ly tâm loaị kết tủa, lấy phần nƣớc trong.
Lấy 50ml mẫu qua lọc them 1 giọt EDTA đề tránh ion Ca2+, Mg2+ hoặc các ion khác gây kết tủa với Nessler.
105
Chuẩn bị tham chiếu nhƣ sau:
STT 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Ml dung dịch N- NH3 chuẩn 10ppm 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 Ml nƣớc cất 50 49.5 49 48.5 48 47.5 47 46.5 46 0 Ml mẫu nƣớc - - - - - - - - - 50 Thuốc thử Nessler 2ml/ống C (µg) 0 5 10 15 20 25 30 35 40 ? C (mg/l) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 ? A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?
So sánh màu các dung dịch =430 nm sau khi them Nessler đƣợc 10 phút. Nếu màu của mẫu vƣợt quá đƣờng cong tham chiếu, làm lại với một thể tích mẫu thích hợp và pha lỗng thành 50 ml.
Phƣơng pháp xử lý của Phosphat trong môi trƣờng nƣớc:
Trong môi trƣờng acid các dạng của phosphate đƣợc chuyển về dạng orthophosphat và sẽ phản ứng với ammonium molydate để phóng thích acid molybdophosphoric, sau đó acid này sẽ bị khử bởi SnCl2 cho molybdenum màu xanh dƣơng.
PO43-+12(NH4)2MoO4+24H+(NH4)3PO4.12MoO3+21NH4++12H2O (NH4)3PO4.12MoO3+Sn2+Molybdenum (xanh dƣơng)+Sn4+
Lấy 50 ml mẫu đã đƣợc lắc đều cho vào 0.05 ml chất chỉ thị phenolphthalein. Nếu mẫu có màu thêm vào từ từ dung dịch acid sulfuric đến khi mất màu. Sau đó thêm 1ml dung dịch acid sulfuric và 0.4 g (NH4)2S2O8 hoặc 0.5g K2S2O8.
106
Đun khoảng 30-40 phút hoặc đun đến thể tích cịn 10ml, để nguội thêm vào 1ml chất chỉ thị phenolphthalein và trung hòa đến màu hồng nhạt bằng dung dịch NaOH, định thể tích lại thành 50ml bằng nƣớc cất.
Lấy 50ml mẫu, khơng có màu và đục, thêm 1 giọt chất chỉ thị phenolphthalein. Nếu mẫu chuyển sang màu hồng, thêm từ từ dung dịch acid mạnh để mất màu.
Thêm vào 2ml molybdate và 0.25 ml (5 giọt) tin chloride và lắc đều, tốc độ và cƣờng độ hiện màu phụ thuộc vào nhiệt độ, do đó nên giữ loạt dung dịch chuẩn, mẫu và hóa chất ở cùng nhiệt độ (chênh nhau không quá 20C) trong khoảng 20- 300C.
Để yên sau 10 phút (không quá 12 phút) đo độ hấp thụ bằng máy quang phổ kế ở bƣớc sóng 690nm.
Chuẩn bị đƣờng cong chuẩn
STT 0 1 2 3 4 5 6 (mẫu)
Ml dung dịch P-PO4 chuẩn 1µg/ml 0 1 2 3 4 5 - Ml nƣớc cất 50 49 48 47 46 45 - Ml mẫu nƣớc - - - - - - 50 Ml dung dịch molybdate 2 ml Ml SnCl2 0.25 ml = 5 giọt C (µg) 0 1 2 3 4 5 C (mg/l) 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1
Đo độ hấp thu bằng máy ở 690nm ? ? ? ? ? ? ? Phƣơng pháp xử lý của COD trong mơi trƣờng nƣớc:
Rửa sạch ống nghiệm có nắp với H2SO4 20% trƣớc khi sử dụng, chọn thể tích mẫu và thể tích hóa chất dung tƣơng ứng theo bảng sau:
ống nghiệm (d×l) Thể tích mẫu (ml) Dung dịch K2Cr2O7 H2SO4 reagent Tổng thể tích (ml) 20×150mm 25×150mm ống chuẩn 10ml 5 10 2.5 3 6 1.5 7 14 3.5 15 30 7.5 Cho mẫu vào ống nghiệm, thêm dung dịch K2Cr2O7 0.0167M vào, cẩn thận thêm H2SO4 reagent vào bằng cách cho acid chảy dọc từ từ theo thành ống nghiệm, đậy nắp ngay, đặt vào giá đựng ống nghiệm và cho vào tủ sấy hoặc máy COD ở 1500C trong 2 giờ. Để nguội ở nhiệt độ phòng, cho vào erlen, tráng ống COD bằng
107
nƣớc khoáng (nƣớc cất) và đổ vào erlen, sau đó thêm 0.05- 0.1ml (1-2 giọt) chỉ thị feroin, định phân bằng sắt (II) amoni sulfate 0.1 M (FAS). Hoàn thành khi mẫu chuyển màu từ xanh lục sang nâu đỏ. Làm một mẫu thử khơng với nƣớc cất (cũng bao gồm các hóa chất nhƣ mẫu thật nhƣng thay mẫu bằng nƣớc cất, cho vào tủ sấy ở 1500C trong 2 giờ).
3.3.3 Khảo sát q trình ni trồng vi tảo
3.3.3.1. Ni cấy và tăng sinh
Hình 3.7: Sơ đồ quy trình tăng sinh giữ giống tảo.
Pha chế môi trƣờng f2 và môitrƣờng Zarrouk (tảo Spirulina spp.).
Tiến hành nuôi cấy với tỷ lệ giống bổ sung vào môi trƣờng là 15% và 20%, kết hợp sục khí và cung cấp ánh sáng đầy đủ, điều kiện nhiệt độ phịng, ni cấy trong vòng 4-5 ngày , tiếp tục cấy chuyền sang môi trƣờng mới để giữ giống. Khi tảo đạt đến mật độ cực đại, lấy tảo để tăng sinh trong môi trƣờng nƣớc ao.
Cũng với tỷ lệ 15% và 20% giống với tỉ lệ nƣớc thải lần lƣợt là 25%, 50%, 75% và 100% kết hợp sục khí ni cấy trong nhiệt độ phòng và ánh sáng, sau 4-5 ngày, đem thu sinh khối để thực hiện bƣớc thí nghiệm tiếp theo.
Tảo giống Giữ giống
Tăng sinh trong môi trƣờng đặc trƣng
Tăng sinh trong môi trƣờng
nƣớc.ao Giữ giống
Thu sinh khối
4-5 ngày, nhiệt độ phịng
108
3.3.3.2. Điều kiện ni
Điều kiện mơi trƣờng ni: Nhiệt độ thích hợp 20-24o
C, khoảng chịu đựng 16-35oC Độ mặn: tốt nhất 20-24o/oo cho tảo biển
Ánh sáng: thích hợp 1.000- 10.000 lux, ánh sáng nhân tạo tốt nhất là đèn neon với chu kỳ chiếu sáng ≥ 16 giờ / ngày
pH: thích hợp 7-9
Sục khí giúp: tảo lơ lửng, tiếp xúc đều với ánh sáng và dinh dƣỡng, ổn định nhiệt độ, cung cấp CO2 và O2
Môi trƣờng dinh dƣỡng nuôi tảo
Gồm hỗn hợp các chất đa lƣợng (các chất vô cơ nhƣ Nitrate, Phosphre và Silicate) và vi lƣợng (các muối kim loại và có thể cả hỗn hợp vitamine),
Dụng cụ -phƣơng tiện
Ni tảo có thể thực hiện trong phịng thí nghiệm, trong trại với mái che trong suốt hay ngồi trời.
Phịng thí nghiệm nên đƣợc trang bị với hệ thống đèn Neon, giá đỡ, máy điều hòa nhiệt độ và một số máy khử trùng
Hệ thống thổi khí cũng rất cần thiết trong nuôi tảo nhằm đảm bảo tảo ni đƣợc sục khí liên tục.
Kỹ thuật khử trùng và vô trùng
Vô trùng là một trong những khâu rất quan trọng trong nuôi tảo, đặt biệt là tảo giống nhằm tránh tảo bị nhiễm tạp.
Trong phƣơng pháp khử trùng dụng cụ phịng thí nghiệm nhƣ ống nghiệm, bình tam giác, que cấy…cần đƣợc khử trùng bằng cách cho vào tủ sấy ở nhiệt độ 1800C trong 2 giờ (khử trùng khô).
Nƣớc ni tảo với thể tích nhỏ có thể đƣợc khử trùng bằng cách cho vào tủ hấp tiệt trùng với nhiệt độ 120oC và áp suất 20 psi. Thời gian hấp là 15 phút đối với thể tích nhỏ hơn 1 lit hay 20- 45 phút với thể tích lớn 10-20 lít (khử trùng ƣớt ).
3.3.4. Hê thống thiết bị
Các phƣơng pháp ni tảo
Có 3 phƣơng pháp ni tảo: ni theo mẻ, nuôi bán liên tục và nuôi liên tục (Trƣơng Sỹ Kỳ, 2004).
Nuôi theo mẻ: Ni tảo trong các bể ni có mơi trƣờng dinh dƣỡng, sau một vài ngày khi mật độ tảo lên đến cực đại hoặc gần cực đại thì thu hoạch. Đây là
109
phƣơng pháp nuôi khá phổ biến vì đơn giản và thuận tiện, có thể xử lý khi mơi trƣờng ni có sự cố.
Ni bán liên tục : Phƣơng pháp này nhằm mục đích kéo dài thời gian ni bằng cách thu hoạch tảo từng phần. Sau khi thu hoạch thì cấp thêm nƣớc và môi trƣờng dinh dƣỡng để cho tảo tiếp tục phát triển. Thơng thƣờng thì ni bán liên tục khơng tính đƣợc thời gian nuôi kéo dài bao lâu vì cịn phụ thuộc vào chất lƣợng nƣớc và các loài động vật dữ sử dụng làm thức ăn hoặc cạnh tranh không gian sống.
Nuôi liên tục: Là phƣơng pháp nuôi tƣơng đối hiện đại, giá thành cao và địi hỏi quy trình ni chặt chẽ. Nguyên tắc nuôi là liên tục dẫn tảo đến bể nuôi ấu trùng đồng thời cấp nƣớc và môi trƣờng dinh dƣỡng vào bể nuôi. Tốc độ dịng chảy của nƣớc lấy ra và nƣớc có mơi trƣờng dinh dƣỡng cấp vào phải bằng nhau. Nuôi theo phƣơng pháp này có thể kéo dài thời gian ni 2 – 3 tháng.
Hệ thống nuôi tảo hở:
Một số lƣu ý khi chuẩn bị ni tảo: Tìm hiểu về thị trƣờng tiêu thụ.
Hệ thống giao thông từ nơi nuôi tảo đến các nhà máy chế biến tảo phải thuận lợi. Tìm đƣợc thỏa thuận giữa ngƣời ni tảo và nhà chế biến tảo.
Chuẩn bị nguyên vật liệu xây dựng ao, bể nuôi, hệ thống khuấy nƣớc. Chuẩn bị nguồn giống tảo Spirulina spp.
Chuẩn bị hóa chất ni tảo, trang thiết bị cho các thông số của môi trƣờng nuôi tảo nhƣ: máy đo pH, đo oxygen, nhiệt độ .... Chuẩn bị kĩ thuật ni tảo.
110
Hình 3.8. Bố trí hệ thống ni tảo.
Hệ thống ni tảo bao gồm các thiết bị chính nhƣ đèn, hệ thống giá đỡ, máy sủi khí, các ống dây dẫn khí , các van điều chỉnh khí cho phù hợp và đầu sủi khí.
111