Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 2.5. Phổ hấp thụ hồng ngoại của H3[Tm(His)3Cl3].3H2O
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 2.7. Phổ hấp thụ hồng ngoại của H3[Lu(His)3Cl3].2H2O Bảng 2.3. Các tần số hấp thụ đặc trƣng (cm-1) của L- histidin Bảng 2.3. Các tần số hấp thụ đặc trƣng (cm-1) của L- histidin và các phức chất Hợp chất OH NH3 COO as OO C s ∆ OO as C s L - histidin - 3095,01 1583,24 1414,21 169,03 H3[Tm(His)3Cl3].3H2O 3423,40 3136,70 1627,03 1433,08 193,95 H3[Yb(His)3Cl3].3H2O 3426,30 3179,17 1627,03 1465,91 161,12 H3[Lu(His)3Cl3].2H2O 3432,64 3136,24 1631,49 1444,22 187,27 (-) Không xác định
Trong phổ hồng ngoại của L- histidin dải hấp thụ ở tần số 3095,01 cm-1 quy cho dao động hóa trị của nhóm NH3+. Dải hấp thụ ở 1583,24 cm-1 và 1414,21 cm-1 đặc trưng cho dao động hóa trị bất đối xứng và dao động hóa trị đối xứng của nhóm COO-.
Chúng tơi nhận thấy phổ hấp thụ hồng ngoại của các phức chất
H3[Tm(His)3Cl3].3H2O, H3[Yb(His)3Cl3].3H2O, H3[Lu(His)3Cl3].2H2O đều khác với phổ hồng ngoại của L- histidin (hình 2.4) về hình dạng cũng như vị trí của các
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
dải hấp thụ. Điều này cho biết sự tạo phức đã xảy ra giữa các ion Tm3+, Yb3+, Lu3+ với L- histidin.
So sánh phổ hồng ngoại các phức chất của Ln3+
với L- histidin và phổ hồng ngoại của L- histidin ở trạng thái tự do thấy dải hấp thụ ở 1585,24 cm-1
đặc trưng cho dao động hóa trị bất đối xứng ( COO
as
) của nhóm COO- trên phổ của
L- histidin tự do dịch chuyển về vùng tần số cao hơn (1627,03 cm-1 ÷ 1631,49 cm-1), dải hấp thụ ở 1414,21 cm-1
đặc trưng cho dao động hóa trị đối xứng ( COO
s
) của nhóm COO-
cũng dịch chuyển về vùng tần số cao hơn (1433,08 cm-1 ÷ 1465,91 cm-1) trên phổ của các phức chất. Điều này chứng tỏ nhóm cacboxyl của
L- histidin đã liên kết với ion Ln3+. Sự chênh lệch ∆ OO as
C s
của phức chất so với L- histidin tự do chứng tỏ L- histidin đã liên kết với Ln3+ qua nguyên tử oxi của nhóm cacboxyl. Dải dao động hóa trị (NH3) của nhóm NH3 trên phổ của
L- histidin (3095,01 cm-1) dịch chuyển lên vùng tần số cao hơn (3136,24 cm-1 ÷ 3179,17 cm-1) trên phổ của các phức chất. Chứng tỏ L- histidin cũng đã liên kết với Ln3+ qua nguyên tử nitơ của nhóm amin. Ngồi ra trên phổ của các phức chất còn xuất hiện dải hấp thụ đặc trưng cho dao động hóa trị của nhóm OH- của nước (3423,40 cm-1 ÷ 3432,64 cm-1). Điều này một lần nữa chứng tỏ trong thành phần của phức có chứa nước và hồn toàn phù hợp với kết quả nghiên cứu phức chất bằng phương pháp phân tích nhiệt ở trên [20].
2.5. Nghiên cứu các phức chất bằng phƣơng pháp đo độ dẫn điện
Độ dẫn điện riêng của dung dịch L- histidin, các dung dịch phức chất H3[Ln(His)3Cl3].nH2O được đo trên máy FIGURE7 của Mỹ (phịng Hóa lí- khoa Hóa học - Đại học sư phạm Thái Nguyên). Chỉnh điện cực của máy bằng dung dịch chuẩn NaCl nồng độ 692 ppm và 7230 ppm (các dung dịch chuẩn có kèm theo máy). Chuẩn bị dung dịch L- histidin, các dung dịch phức chất đều có nồng độ 10-3M trong dung môi nước.
Từ các số liệu độ dẫn điện riêng thu được tính ra được độ dẫn điện mol phân tử. Kết quả được chỉ ra ở bảng 2.4.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 2.4. Độ dẫn điện mol phân tử (μ) của L- Histidin và các phức chất trong nƣớc ở 25 ± 0,50C Dung dịch (10-3 M ) μ (Ω-1 .cm2.mol-1) Số ion L- histidin 0.0 - H3[Tm(His)3Cl3].3H2O 372 4 H3[Yb(His)3Cl3].3H2O 383 4 H3[Lu(His)3Cl3].2H2O 398 4 TmCl3 419 - YbCl3 417 - LuCl3 413 -
Kết quả bảng 2.4 cho thấy: độ dẫn điện mol của L- Histidin μ = 0.0 (Ω-1
.cm2.mol-1) chứng tỏ L- histidin là phối tử trung hồ và các phức chất có μ ≠ 0.0 (Ω-1
.cm2.mol-1) chứng tỏ phức chất là phức điện li. Độ dẫn điện mol của các phức chất khác với độ dẫn điện mol của các muối kim loại tương ứng. Trong dung dịch nước mỗi phân tử phức chất phân li thành 4 ion. Từ đó có thể giả thiết cân bằng phân li trong các dung dịch phức chất như sau:
H3[Ln(His)3Cl3] ↔ 3H+
+ [Ln(His)3Cl3]3-
2.6. Bƣớc đầu thăm dị hoạt tính sinh học của Tm(His)3Cl3.3H2O
2.6.1. Hoạt tính kháng khuẩn của phức H3[Tm(His)3Cl3].3H2O
2.6.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của phức chất H3[Tm(His)3Cl3].3H2O đến vi khuẩn Salmonella, vi khuẩn Shigella; vi khuẩn Escherichia coli và Staphylococcus aureus
Mẫu nghiên cứu được tiến hành ở phòng vi sinh, trường Đại học Y - Dược, Đại học Thái Nguyên.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 2.8. Kết quả thử nghiệm kháng khuẩn với khuẩn Salmonella của phức
H3[Tm(His)3Cl3].3H2O
Hình 2.9. Kết quả thử nghiệm kháng khuẩn với khuẩn Shigella của phức
H3[Tm(His)3Cl3].3H2O
Hình 2.10. Kết quả thử nghiệm kháng khuẩn với khuẩn E.coli của phức
H3[Tm(His)3Cl3].3H2O
Hình 2.11. Kết quả thử nghiệm kháng khuẩn với khuẩn Sta của Phức H3[Tm(His)3Cl3].3H2O 1- Nồng độ phức 2 500 μ g/ml
2- Nồng độ phức 5 000 μ g/ml 3- Nồng độ phức 10 000 μ g/ml 4- Nồng độ phức 20 000 μ g/ml
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 2.5. Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của phức chất phức H3[Tm(His)3Cl3].3H2O
STT Nồng độ phức
chất (μ g/ml)
Đƣờng kính vịng vô khuẩn (mm)
Salmonella Shigella E.coli Sta
1 2 500 12 10 13 10
2 5 000 15 14 16 12
3 10 000 17 19 19 15
4 20 000 21 22 23 20
Trong khoảng nồng độ khảo sát từ 2 500÷ 20 000 μ g/ml, phức chất H3[Tm(His)3Cl3].3H2O có tác dụng ức chế các vi khuẩn kiểm định, sự ức chế thể hiện ngay từ nồng độ đầu 2 500μ g/ml và tăng dần theo nồng độ.
2.6.1.2. So sánh ảnh hưởng của H3[Tm(His)3Cl3].3H2O, TmCl3, L- histidin đến vi khuẩn Salmonella, Shigella; Escherichia coli và Staphylococcus aureus
Để so sánh ảnh hưởng của H3[Tm(His)3Cl3].3H2O, TmCl3, L- histidin đến 4 loại vi khuẩn trên, chúng tơi tiến hành thí nghiệm với các mẫu:
1- Phức H3[Tm(His)3Cl3].3H2O nồng độ 10 000 μ g/ml 2- Muối TmCl3 nồng độ 10 000 μ g/ml
3- Phối tử L- histidin nồng độ 30 000 μ g/ml
Hình 2.12. Kết quả thử nghiệm kháng khuẩn với khuẩn Salmonella giữa
Tm(His)3Cl3.3H2O, TmCl3 và L- histidin
Hình 2.13. Kết quả thử nghiệm kháng khuẩn với khuẩn Shigella giữa
Tm(His)3Cl3.3H2O, TmCl3 và L- histidin
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 2.14. Kết quả thử nghiệm kháng khuẩn với khuẩn E.coli giữa
Tm(His)3Cl3.3H2O, TmCl3 và L- histidin
Hình 2.15. Kết quả thử nghiệm kháng khuẩn với khuẩn Sta giữa Tm(His)3Cl3.3H2O, TmCl3
và L- histidin
Bảng 2.6. Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của
H3[Tm(His)3Cl3].3H2O, TmCl3, L- histidin STT Nồng độ của H3[Tm(His)3Cl3].3H2O, TmCl3, L- histidin Đƣờng kính vịng vơ khuẩn (mm)
Salmonella Shigella E.coli Sta
1 Tm(His)3Cl3.3H2O 17 19 19 15
2 TmCl3 23 20 21 22
3 L_histidin 0 0 0 0
Phức chất H3[Tm(His)3Cl3].3H2O và muối TmCl3 đều có hoạt tính
kháng khuẩn với cả bốn loại vi khuẩn Salmonella, Shigella, Ecoli và Sta, phức chất H3[Tm(His)3Cl3].3H2O có hoạt tính kháng khuẩn kém hơn so với muối TmCl3, phối tử L- histidin khơng có hoạt tính kháng khuẩn.
2.6.2. Thăm dò ảnh hưởng của phức chất H3[Tm(His)3Cl3].3H2O đến sự nẩy mầm và phát triển mầm của hạt ngô nẩy mầm và phát triển mầm của hạt ngơ
2.6.2.1. Phương pháp thí nghiệm
Chọn 6 mẫu hạt ngơ, mỗi mẫu 50 hạt kích thước tương đối đồng đều (khối lượng 12,57±0,01 g). Ngâm hạt trong các dung dịch phức chất có nồng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
độ 30, 60, 120, 180, 240 ppm (mẫu so sánh ngâm trong nước cất). Thể tích các dung dịch phức chất và nước cất đem ngâm là 100 ml. Sau thời gian 24 giờ vớt ra và ủ hạt trong cốc cỡ 500 ml, được lót dưới và đậy trên bằng giấy lọc và đặt trong tủ ủ ấm ở nhiệt độ 300
C. Các dung dịch ngâm được thu hồi để tưới lại lần sau. Hàng ngày tưới hạt bằng các dung dịch phức và nước cất theo thứ tự các mẫu, ngày tưới 3 lần, mỗi lần 30 phút.
Sau khi mầm hạt phát triển được số ngày tuổi nhất định, chúng tôi tiến hành xác định tỷ lệ nảy mầm của hạt, đo độ dài thân và rễ của từng cây trong các mẫu thí nghiệm. Các thí nghiệm được lặp lại 5 lần [13].
2.6.2.2. Ảnh hưởng của phức chất đến sự nảy mầm của hạt ngô
Sau khi ủ hạt được một ngày, đếm số hạt nảy mầm từ đó tính tỷ lệ nảy mầm của hạt. Kết quả được trình bày ở bảng 2.7.
Bảng 2.7. Ảnh hƣởng của phức chất H3[Tm(His)3Cl3].3H2O đến sự nảy
mầm của hạt ngô Mẫu 1 2 3 4 5 6 Nồng độ phức H3[Tm(His)3Cl3].3H2O ppm 0(H2O) 30 60 120 180 240 Tỷ lệ nảy mầm (%) 94,00 96,00 90,00 86,00 82,00 80,00 N 5
Nhận xét: Phức chất có tác dụng ức chế sự nảy mầm của hạt ngô. Sự ức chế làm giảm tỷ lệ nảy mầm của hạt ngô. Sự ức chế rõ rệt và tăng theo nồng độ.
2.6.2.3. Ảnh hưởng của phức chất đến sự phát triển mầm của hạt ngô
Khi mầm hạt phát triển được 4 ngày tuổi, chúng tôi tiến hành đo chiều cao của mầm và độ dài của rễ. Dùng thước đo có chia độ đến mm để đo. Đối với mầm đo từ cổ rễ đến mút lá.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 2.8. Ảnh hƣởng của nồng độ phức chất H3[Tm(His)3Cl3].3H2O đến sự phát triển mầm của ngô
Mẫu 1 2 3 4 5 6
Nồng độ phức
H3[Tm(His)3Cl3].3H2O (ppm) 0(H2O) 30 60 120 180 240
Thời gian (ngày) 4 ngày
d T (cm) 3,46 3,25 2,95 2,59 2,17 1,93 d R (cm) 2,82 2,53 2,29 1,98 1,73 1,52 AT (%) 100 93,94 85,26 74,85 62,72 55,78 AR (%) 100 89,71 81,20 70,21 61,35 53,90 n 5 n : độ lặp lại
d T: là độ dài trung bình của thân mầm ngơ
d R : là độ dài trung bình của rễ mầm ngô
AT là % độ dài thân so với đối chứng AR là % độ dài rễ so với đối chứng
AT, AR = X
SS
d
d .100 (%)
d SS: Độ dài trung bình thân, rễ của mầm ngơ ở mẫu so sánh (đối chứng).
d X: Độ dài trung bình thân, rễ của mẫu xử lý.
Hình 2.16. Ảnh hƣởng của nồng độ phức chất H3[Tm(His)3Cl3].3H2O đến sự nảy mầm hạt ngơ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Mẫu 1 2 3 4 5 6
Nồng độ phức chất
(ppm) 0(H2O) 30 60 120 180 240
Nhận xét: Từ kết quả ở bảng 2.8, hình 2.16 cho thấy phức chất có tác dụng ức chế sự phát triển mầm của hạt ngô. Sự ức chế làm giảm chiều cao của mầm và độ dài của rễ. Trong khoảng nồng độ khảo sát từ 30 ÷ 240 ppm, phức chất có tác dụng ức chế sự phát triển mầm của hạt ngô. Sự ức chế tăng chậm khi nồng độ của phức chất tăng.
2.6.2.4. So sánh ảnh hưởng của phức chất, ion kim loại và phối tử đến sự nảy mầm của ngô
Để so sánh ảnh hưởng của phức H3[Tm(His)3Cl3].3H2O, ion kim loại và phối tử đến sự nảy mầm của hạt ngơ, chúng tơi tiến hành thí nghiệm với các mẫu:
Mẫu 1: H2O
Mẫu 2: Dung dịch phức H3[Tm(His)3Cl3].3H2O nồng độ 120 ppm. Mẫu 3: Dung dịch muối Tm3+ nồng độ 120 ppm.
Mẫu 4: Dung dịch L- histidin nồng độ 360 ppm.
Thời gian ủ hạt là 1 ngày. Kết quả được trình bày ở bảng 2.9.
Bảng 2.9: Ảnh hƣởng của hàm lƣợng phức H3[Tm(His)3Cl3].3H2O,
TmCl3, và L- histidin đến sự nảy mầm của hạt ngô
STT 1 2 3 4
Mẫu H2O H3[Tm(His)3Cl3].3H2O TmCl3 L- His
Nồng độ (ppm) 0 120 120 360
Tỷ lệ nảy mầm (%) 94,00 86,00 88,00 84,00
Cũng như phức chất, phối tử và ion trung tâm có tác dụng ức chế sự nảy mầm của hạt ngơ. Phức chất có tác dụng ức chế kém hơn phối tử và tốt hơn ion trung tâm.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.6.2.5. So sánh ảnh hưởng của phức chất, ion kim loại và phối tử đến sự phát triển mầm của hạt ngô
Khi mầm hạt phát triển được 4 ngày tuổi, chúng tôi tiến hành đo chiều cao của mầm và độ dài của rễ.
Kết quả được trình bày ở bảng 2.10, hình 2.17.
Bảng 2.10: Kết quả so sánh ảnh hƣởng của phức H3[Tm(His)3Cl3].3H2O, TmCl3, và L- histidin đến sự phát triển mầm của hạt ngô
Mẫu 1 2 3 4
Dung dịch H2O H3[Tm(His)3Cl3].3H2O TmCl3 L- His
Nồng độ (ppm) 0 120 120 360
Thời gian (ngày) 4
d T (cm) 3,46 2,59 2,68 2,31 d R (cm) 2,82 1,98 2,01 1,73 AT (%) 100 74,85 77,45 66,76 AR (%) 100 70,21 71,27 61,35 N 5 Hình 2.17. Ảnh hƣởng của phức H3[Tm(His)3Cl3].3H2O, TmCl3, và L- histidin đến sự phát triển mầm của hạt ngô
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Từ kết quả ở bảng 2.10, hình 2.17 cho thấy cũng như phức chất, phối tử và ion kim loại có tác dụng ức chế sự phát triển mầm của hạt ngơ. Phức chất có tác dụng ức chế kém hơn phối tử và tốt hơn ion kim loại.
2.6.3. Thăm dò sự ảnh hưởng của phức chất đến hàm lượng protein, proteaza, α- amilaza có trong mầm hạt ngơ
2.6.3.1. Phương pháp thí nghiệm
Để xác định một số chỉ tiêu sinh hóa: protein theo phương pháp Lowry, hoạt độ proteaza theo phương pháp Anson cải tiến, hoạt độ α-amilaza theo phương pháp Wohlgemuth chúng tôi tiến hành xây dựng các đường chuẩn:
* Xây dựng đường chuẩn xác định protein: Dùng ống hút lấy 0,1 ÷ 0,5 ml dung dịch protein huyết thanh bò (0,5 mg/ml) cho vào 5 ống nghiệm đánh số từ 1 đến 5. Cho vào mỗi ống 5 ml dung dịch D (gồm 48 ml dung dịch Na2CO3 2% trong NaOH 0,1N, 1 ml dung dịch CuSO4 0,5% và 1ml dung dịch NaKC4H4O6 1%), thêm nước cất đến cùng thể tích là 9 ml. Lắc đều, để yên 15 phút, bổ sung vào mỗi ống 1 ml dung dịch E (thuốc thử Folin-Ciocalto pha loãng với nước cất tỉ lệ 1:1), lại lắc đều và để yên 30 phút.
Mẫu so sánh khơng có protein: 5 ml dung dịch D, 4 ml nước và 1 ml dung dịch E. Đo độ hấp thụ quang A của các dung dịch ở bước sóng 750 nm [4]. Kết quả được trình bày ở bảng 2.11, hình 2.18.
Bảng 2.11: Sự phụ thuộc của độ hấp thụ quang vào khối lƣợng protein
Mẫu 1 2 3 4 5
Khối lượng protein
(huyết thanh bò) (mg) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
đường chuẩn xác định protein
y = 0.1442x + 0.0056 R2 = 0.9347 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 Protein A bs Hình 2.18. Đƣờng chuẩn xác định protein
* Xây dựng đường chuẩn xác định hoạt độ proteaza: Dùng ống hút lấy những thể tích xác định dung dịch chuẩn tyrosin 1 μmol/ml cho vào các bình định mức cỡ 25 ml. Dùng dung dịch HCl 0,2N pha loãng đến vạch để được các dung dịch tyrosin có nồng độ 0,02; 0,04; 0,06; 0,08; 0,1 μmol/ml. Lấy 1 ml ở mỗi ống nghiệm trên cho vào 5 ống nghiệm có đánh số thứ tự, thêm vào mỗi ống 4 ml dung dịch Na2CO3 6%. Lắc đều, thêm vào 1ml thuốc thử Folin-Ciocalteu đã pha loãng 5 lần, để yên 30 phút ở nhiệt độ phòng.
Mẫu so sánh khơng có tyrosin: 1 ml nước cất, 4 ml dung dịch Na2CO3
6% và 1 ml thuốc thử Folin-Ciocalteu.
Đo độ hấp thụ quang của các dung dịch ở bước sóng 750 nm [4]. Kết