Thiết kế các protein để tinh sạch: Công nghệ DNA tái tổ hợp có một ảnh
hưởng quan trọng lên sự tinh sạch protein. Bằng cách dung hợp một gen quan tâm với một trình tự promoter hiệu quả, thì một protein ngoại lai có thể được biểu hiện trong cơ thể vật chủ từ 10 tới 40% protein tổng số hòa tan của tế
chủ yếu ở các dung hợp ái lực để tinh sạch protein là phải loại bỏ thành công đuôi ái lực và các tác nhân được sử dụng. Vấn đề này có thể được giải quyết bằng sự cắt bỏ các liên kết acid không bền ở chỗ nối của protein tái tổ hợp và đuôi ái lực [79],[80].
Sử dụng công nghệ di truyền tái tổ hợp DNA trong công nghệ protein đã được ứng dụng hơn 10 năm qua và có một hiệu quả rất lớn trong sản xuất protein vi sinh vật. Ứng dụng công nghệ protein được sử dụng trong rất nhiều lĩnh vực: sản xuất tá dược vắc xin, kháng thể…
1.4.2. Kĩ thuật tạo kháng thể bằng gây miễn dịch trên động vật [81]
Điều chế kháng huyết thanh bằng gây miễn dịch trên động vật là một trong những phương pháp tạo kháng thể đã được sử dụng từ lâu và ngày càng được hoàn thiện bên cạnh sự ra đời của nhiều kĩ thuật tạo kháng thể hiện đại. Kết quả tạo kháng huyết thanh bằng gây miễn dịch phụ thuộc một số yếu tố: (1) Chất lượng kháng nguyên, (2) Liều lượng kháng nguyên, (3) Cách tiêm, (4) Khoảng cách giữa các lần tiêm. (5) Thời gian thu kháng thể. Để đánh giá một mơ hình gây miễn dịch tốt người ta dựa vào thời gian thu được kháng thể, hiệu giá và độ tinh khiết của kháng thể.
1.4.2.1. Chất lượng kháng nguyên
Tính KN của một chất phụ thuộc vào cấu trúc, trọng lượng, phân tử, tính lạ và khả năng chuyển hóa của chất đó trong cơ thể. Tính KN cịn phụ
thuộc cấu trúc của KN gồm nhiều protein hay chỉ một protein tinh khiết. Độ tinh khiết của KN quyết định độ tinh khiết của kháng huyết thanh.
1.4.2.2. Đường tiêm của kháng nguyên
Khi gây miễn dịch trên động vật, tùy theo loại động vật thí nghiệm mà người ta chọn các đường tiêm khác nhau như tiêm trong da, dưới da, tiêm tĩnh mạch hay tiêm phối hợp màng bụng và gan bàn chân. Mỗi cách tiêm đều có hiệu quả khác nhau. Tiêm bắp, tiêm dưới da có tác dụng tốt với các hạch địa phương.
1.4.2.3. Liều lượng của kháng nguyên, thời gian giữa các lần tiêm.
Tùy thuộc KN và yêu cầu điều chế kháng huyết thanh mà lựa chọn tiến hành gây miễn dịch với các dung dịch và thời gian tiêm khác nhau. Dung dịch gây miễn dịch có 3 loại: (1) dung dịch kháng nguyên đơn thuần, (2) kháng nguyên cùng tá chất Fruend, (3)Dung dịch phối hợp của cả (1) và (2).
Phương pháp điều chế kháng huyết thanh bằng KN đơn thuần hiện nay ít sử dụng.
Phương pháp thường sử dụng hiện nay là gây miễn dịch bằng dung dịch hỗn hợp KN với tá chất vì kết quả cho hiệu giá KT cao hơn so với phương pháp dùng KN đơn thuần.
Gây miễn dịch bằng dung dịch hỗn hợp kháng nguyên với tá chất
Tá chất được sử dụng với KN có thể là: Alumin hydroxit, Kali alumin sulfat hoặc tá chất Freund.
Gây miễn dịch bằng hỗn hợp KN-tá chất Freund là phương pháp được ứng dụng rộng rãi do hỗn hợp này mang lại đáp ứng miễn dịch tốt, tạo được lượng KT nhiều. Có 2 loại Freund được bán trên thị trường đó là Fruend hồn tồn và Freund khơng hồn tồn. Freund hồn tồn gồm dung dịch nhũ hố trong dầu khống và một loại vi khuẩn bất hoạt đơng khô (thường là vi khuẩn lao), cịn Freund khơng hồn tồn thiếu các thành phần vi khuẩn đơng khơ, chỉ có nước và nhũ tương dầu.
lần tiêm là 2ml hỗn dịch. Đường tiêm: là dưới da hoặc tiêm bắp. Thời gian tiêm: mỗi mũi cách nhau một tuần.
Huyết thanh thỏ sẽ xuất hiện KT tăng cao kéo dài trong quá trình gây miễn dịch và duy trì 2 đến 4 tháng sau. Có thể kiểm tra hiệu giá KTtrong huyết thanh thỏ từ ngày thứ 7 sau mũi tiêm 3. Thời điểm thu nhận KT tồn bộ có thể vào ngày thứ 15 đến 20 sau mũi tiêm cuối.
1.4.3. Kĩ thuật phân lập albumine từ huyết thanh [82].
Tủa là phương pháp thường được sử dụng để tinh sạch, thu nhận các phân tử sinh học nhất là protein. Để tủa protein, người ta có thể dùng nhiều cách khác nhau: tủa bằng muối, tủa bằng các dung môi hữu cơ hoặc thay đổi pH của dung dịch có chứa protein.
Tủa bằng muối
Dùng muối là cách phổ biến để tủa protein. Khả năng hòa tan của protein tùy thuộc vào nhiều yếu tố như: đặc tính lý hóa tự nhiên của protein, pH, nhiệt độ, nồng độ của muối…Ở nồng độ muối thấp, tính tan của protein tăng nhẹ. Tuy nhiên, ở nồng độ muối cao, tính tan của protein giảm mạnh.Tính tan của protein trong mơi trường muối nồng độ cao được giải thích bởi Kirkwood. Sự gia tăng lượng ion muối trong dung dịch làm giảm tính hịa tan của protein dẫn đến sự tủa.
Ở nồng độ muối cao, độ hịa tan tn theo cơng thức của Cohn:log S =
protein, pH và nhiệt độ), K: hằng số tan (tuỳ thuộc vào pH, hỗn hợp và lượng muối có trong dung dịch), I: cường độ ion của muối). Vì vậy, khi muốn tách một protein từ một hỗn hợp nhiều protein, người ta có thể lựa chọn nồng độ muối sao cho phù hợp nhất với protein mục tiêu.Hiệu quả tủa protein của các anion muối khác nhau thì khác nhau. Hiệu quả tủa được xếp theo thứ tự giảm dần như sau: citrate > phosphate > sulphate > acetate/chloride > nitrate > thiocyanate.
Tủa protein bằng các dung môi hữu cơ
Khi thêm dung môi hữu cơ vào môi trường, hằng số điện môi của môi trường giảm xuống. Công thức biểu diễn mối quan hệ giữa độ hịa tan và hằng số điện mơi: ln (S/Sw) = (A/RT) (1/Dw - 1/D). Trong đó S: độ hịa tan của protein trong dung mơi hữu cơ, Sw: độ hịa tan của protein trong nước, D: hằng số điện môi của môi trường sau khi đã bổ sung dung môi hữu cơ, Dw: hằng số điện mơi của nước, R: hằng số khí, T: nhiệt độ tuyệt đối, A: hằng số khí.
Cơng thức trên cho thấy: khi thêm dung môi hữu cơ vào môi trường, hằng số điện mơi tăng lên, khả năng hịa tan của protein giảm, vì thế tạo sự kết tủa. Tuy nhiên, các dung mơi hữu cơ lại có ái lực với các bề mặt kỵ nước của phân tử protein. Kết quả là chúng làm biến tính protein trong suốt q trình tủa. Do đó, khi tủa, chỉ nên sử dụng các dung môi hữu cơ ở nồng độ thấp (ngoại trừ:2–methyl–2,4–pentanediol(MPD), dimethyl Sulfoxide(DMSO) và Ethanol có thể sử dụng nồng độ cao.
Từ các nguyên tắc trên Rodkey đã đưa ra một phương pháp tủa protein cải tiến. Phương pháp này là sự kết hợp của cả phân tử muối nồng độ thấp (Tricloroacetate acid 2%) và dung môi hữu cơ (Ethanol 84,5%) nhằm làm tủa tối đa các phân tử albumine trên bề mặt và thu nhận globuline trong dịch lắng (Qui trình kĩ thuật được trình bày trong phần phương pháp nghiên cứu)[82].
Solomon Aaron Berson công bố lần đầu tiên năm 1960 và được giải Nobel y học năm 1977. Năm 1971, hai nhóm nghiên cứu Peter Perlmann và Eva Engvall cùng với Anton Schuurs và Bauke van Weemen đã độc lập cơng bố các bài báo về qui trình kỹ thuật ELISA đang sử dụng hiện nay.
ELISA (Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay) là kỹ thuật hấp phụ miễn dịch gắn enzym dựa vào tính hấp phụ tự nhiên của protein trên một số chất như polystyren. Các KN hoặc KT được gắn lên polystyren, sau đó cho ủ với KT hoặc KN đặc hiệu tương ứng để tạo nên phản ứng kết hợp KN-KT. Cuối cùng cho gắn với KT hoặc KN đã biết trước đã gắn với enzyme. Enzyme sẽ phân hủy cơ chất không màu thành một sản phẩm có màu đặc trưng. Mật độ màu được nhận định sơ bộ bằng mắt thường hoặc được đọc chính xác bằng quang phổ kế.
Dựa trên nguyên lý của các phản ứng kết hợp KN-KT. Nếu muốn tìm KN trong hỗn dịch thì phải có KT đặc hiệu với KN đó đã biết hoặc ngược lại.
1.4.4.1. Kĩ thuật ELISA trực tiếp
ELISA trực tiếp ít được sử dụng trong ELISA định lượng mà thường được sử dụng cho ELISA định tính. Yếu tố cần chẩn đốn (ví dụ như KN) được cố định trực tiếp lên một bề mặt rắn sau đó được xác định sự hiện diện bằng yếu tố phát hiện. Nguyên lý của kĩ thuật được mô tả ở sơ đồ hình 1.14:
Sinh màu
KNcần tìm Kháng KT Cơ chất
gắn enzym