3 NGUYấN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
3.3.3.2 Nghiờn cứu tỏc dụng làm tăng phục hồi tổn thương gan
Chuột nhắt trắng, được chia thành 7 lụ, mỗi lụ 10 con. Gõy tổn thương gan chuột bằng cỏch tiờm màng bụng CCl4 3 ngày liờn tục, với liều 0,2ml/kg/ngày (pha 0,2ml CCl4 trong 3,8ml dầu olive, tiờm 0,04ml/10g). Ngày thứ ba, sau khi tiờm CCl4 1 giờ
bắt đầu cho uống nước cất, sylimarin (67mg/kg) hoặc cao cỏ mật (9,0g/kg) tương
ứng với từng lụ theo sơ đồ 3.2. Chuột được lấy mỏu động mạch cảnh để định lượng cỏc enzym AST, ALT và bilirubin, lấy gan để xỏc định trọng lượng, nồng độ MDA và làm tiờu bản mụ bệnh học ở cỏc thời điểm sau uống thuốc 2 ngày và 4 ngày.
Sơđồ 3.2 Thời gian làm thực nghiệm nghiờn cứu tỏc dụng tăng phục hồi tổn thương gan
Ngày 1 ngày 2 ngày 3 ngày 4 ngày 5 ngày 6 ngày 7
Lụ 1 tiờm dầu olive nước cất nước cất giết 5 chuột Lụ 2 tiờm CCl4 nước cất giết 5 chuột
Lụ 3 tiờm CCl4 silymarin giết chuột Lụ 4 tiờm CCl4 cỏ mật
Lụ 5 tiờm CCl4 nước cất
Lụ 6 tiờm CCl4 silymarin giết chuột
Lụ 7 tiờm CCl4 cỏ mật
3.3.3.3. Tỏc dụng hiệp đồng giấc ngủ của cỏ mật với phenobarbital
Phương phỏp nghiờn cứu tỏc dụng hiệp đồng giấc ngủ của cỏ mật với phenobarbital.
- Cỏch tiến hành: Chuột nhắt trắng được chia ngẫu nhiờn thành 3 lụ, mỗi lụ 20 con
+ Lụ 1: (lụ chứng) Uống nước cất (cựng thể tớch với cao cỏ mật), 30 phỳt sau tiờm phenobarbital 100mg/kg
+ Lụ 2: Uống cao cỏ mật liều 4,5g/kg, 30 phỳt sau tiờm phenobarbital 100mg/kg
+ Lụ 3: Uống cao cỏ mật liều 9,0g/kg, 30 phỳt sau tiờm phenobarbital 100mg/kg
+ Thời gian tiềm tàng là thời gian được tớnh từ lỳc tiờm phenobarbital đến khi chuột ngủ ( đặt chuột ở tư thế nằm ngửa mà chuột khụng lật dậy được thỡ được coi là ngủ)
+ Thời gian ngủ được tớnh từ lỳc bắt đầu ngủ đến khi thức dậy (lỳc bũ được bằng 4 chõn).
3.3.3.4.Nghiờn cứu tỏc dụng lợi mật: Tiến hành theo phương phỏp Rudii Chuột nhắt trắng được chia ngẫu nhiờn thành 4 lụ: Chuột nhắt trắng được chia ngẫu nhiờn thành 4 lụ:
Lụ 1 (Csh): Uống nước cất với thể tớch 0,2 ml/10g
Lụ 2 (chứng dương): Uống actiso 1 ống/kg (1 ống 5 ml chứa 9,3 mg cao mềm actiso).
Lụ 3 : Uống cao cỏ mật liều 4,5 g/kg. Lụ 4 : Uống cao cỏ mật liều 9,0 g/kg.
Actiso hoặc cao nước cỏ mật được pha trong nước cất, cho chuột uống với lượng 0,2 ml/10g.
Chuột được uống nước hoặc thuốc trong 4 ngày liền. Ngày thứ tư, sau khi uống thuốc 30 phỳt, gõy mờ chuột bằng ether. Mổ bụng chuột, thắt ống mật chủ, sau
đú khõu tạm thành bụng lại.
Sau 30 phỳt, mở lại ổ bụng chuột, búc tỏch tỳi mật, thấm sạch bằng giấy lọc, cõn xỏc định trong lượng tỳi mật (m1).
Rạch tỳi mật, thấm hết dịch mật, cõn vỏ tỳi mật (m2). Trọng lượng dịch mật m = m1 – m2.
Trọng lượng dịch mật được quy về 10 g thể trọng.
So sỏnh trọng lượng dịch mật ở cỏc lụ uống thuốc và lụ chứng.
Độ lợi mật được tớnh theo cụng thức:
LM% = x 100
Trong đú: m t : Trọng lượng dịch mật trung bỡnh ở lụ uống thuốc. m c : Trọng lượng dịch mật trung bỡnh ở lụ chứng sinh học
3.3.3.5.Nghiờn cứu tỏc dụng chống viờm cấp
Chuột cống trắng được chia ngẫu nhiờn thành 5 lụ Lụ 1 (Csl): Uống nước cất với thể tớch 1,0 ml/100g c c t m m m −
Lụ 2 (chứng dương 1): Uống prednisolon 1,25 mg/kg Lụ 3 (chứng dương 2): Uống indometacin 1,5 mg/kg. Lụ 4: Uống cao cỏ mật liều 3,0 g/kg.
Lụ 5: Uống cao cỏ mật liều 6,0 g/kg.
Cỏc thuốc chuẩn hoặc cao cỏ mật được pha trong nước cất, cho chuột uống với lượng 1,0 ml/100g.
Chuột được uống cao cỏ mật trong 4 ngày liền. Ngày thứ 4, sau khi uống thuốc 30 phỳt, gõy viờm chõn chuột bằng carragenin.
Cỏc thuốc chuẩn (prednisolon, indometacin) được uống 1 lần lỳc 30 phỳt trước khi gõy viờm.
Gõy viờm chõn chuột bằng cỏc carragenin 1% (pha trong nước muối sinh lý) với liều 0,05 ml/ chõn chuột, tiờm vào gan bàn chõn sau, bờn phải của chuột
Đo thể tớch chõn chuột đến khớp cổ chõn bằng dụng cụ chuyờn biệt (mỏy Plethysmometer) vào cỏc thời điểm ngay sau khi gõy viờm và sau khi gõy viờm 3h, 6h và 24h.
Độ tăng thể tớch chõn chuột được tớnh theo cụng thức :
UV( %) = = x 100
Trong đú : V0 : Thể tớch chõn chuột ngay sau khi gõy viờm
Vt : Thể tớch chõn chuột tại thời điểm t (3h, 6h, 24h sau khi gõy viờm) Tỏc dụng chống viờm cấp của thuốc được đỏnh giỏ bằng khả năng ức chế phản
ứng phự.
3.3.3.6. Nghiờn cứu tỏc dụng chống viờm mạn
Tiến hành theo phương phỏp Ducrot R., Julou L (1965). Chuột cống trắng được chia ngẫu nhiờn thành 4 lụ: Lụ 1 (Csh) : Uống nước cất với thể tớch 1,0 ml/100g Lụ 2 (chứng dương ) : Uống indometacin 1,5 mg/kg.
Lụ 3 : Uống cao cỏ mật liều 3,0 g/kg. Lụ 4 : Uống cao cỏ mật liều 6,0 g/kg.
Gõy viờm cho chuột bằng cỏch cấy vào dưới da gỏy của chuột sợi amian trọng lượng 30 ± 1 mg (tiệt trựng 160oC / 2h) đó nhỳng vào carragenin 1%.
0 0
V V V t −
Sau khi cấy amian, chuột được uống thuốc trong 5 ngày liền . Ngày thứ 6, gõy mờ chuột bằng ether, búc tỏch khối u hạt, sấy ở nhiệt độ 60oC / 90 phỳt. Cõn
So sỏnh trọng lượng trung bỡnh của khối u hạt (đó trừ trọng lượng amian) giữa cỏc lụ uống thuốc và lụ chứng. Tỏc dụng chống viờm được biểu thị bằng tỉ lệ % giảm trọng lượng khối u.
3.3.3.7 Nghiờn cứu độc tớnh cấp
Độc tớnh cấp được xỏc định theo phương phỏp Litchfield-Wilcoxon: Chuột nhắt trắng cú trọng lượng 20 ± 2g được chia thành nhiều lụ, mỗi lụ 10 con. Cho chuột uống cao cỏ mật với liều tăng dần từ liều cao nhất khụng gõy chết chuột đến liều thấp nhất gõy chết 100% số chuột. Chuột được nhịn ăn 12 giờ trước khi uống thuốc nhưng vẫn được uống đủ nước. Theo dừi số chuột chết trong 72 giờ đầu và tỡnh trạng chung của chuột (ăn uống, hoạt động nhưđi lại, leo trốo, hoạt động bài tiết ...) trong suốt 7 ngày sau khi uống thuốc. Nếu chuột chết, mổ chuột để đỏnh giỏ tổn thương mụ bệnh học của cỏc cơ quan.
3.3.3.8.Nghiờn cứu độc tớnh bỏn trường diễn
Thỏ trắng cú trọng lượng 2 ± 0,2kg được chia thành 3 lụ, mỗi lụ 10 con, mỗi con nhốt riờng một chuồng.
- Lụ chứng uống nước cất 5ml/kg/ngày
- Lụ trị 1 uống cao cỏ mật liều tương đương 1,2g dược liệu /kg/ngày - Lụ trị 2 uống cao cỏ mật liều tương đương 4,8g dược liệu /kg/ngày.
Thỏ được uống thuốc 30 ngày liền, mỗi ngày một lần vào buổi sỏng. Theo dừi cỏc chỉ tiờu sau trong quỏ trỡnh nghiờn cứu
- Tỡnh trạng chung, thể trọng của thỏ.
- Đỏnh giỏ chức năng gan thụng qua định lượng một số enzym và chất chuyển húa trong mỏu.
+ Hoạt độ AST, ALT (Định lượng theo phương phỏp Reitman-Frankel) [3] + Nồng độ libirubin toàn phần (Định lượng theo phương phỏp đo mật độ quang) + Hàm lượng albumin (Định lượng theo phương phỏp đo mật độ quang) [30] + Nồng độ cholesterol (Định lượng theo phương phỏp so màu, phản ứng lờn màu của Libermann-Burchadard, Salkowski) [30].
- Đỏnh giỏ chức năng thận thụng qua định lượng creatinin trong huyết thanh (
Định lượng theo phương phỏp so màu của Jaffe ) [30].
- Đỏnh giỏ chức phận tạo mỏu thụng qua một số chỉ tiờu như số lượng hồng cầu, thể tớch trung bỡnh hồng cấu, hàm lượng Hemoglobin, hematocrid, số lượng bạch
bỏn tự động Screen master của hóng Hospitex diagnostics. Cỏc thụng số này được xỏc định tại 3 thời điểm trước uống thuốc và sau 15 ngày, 30 ngày uống thuốc.
- Mụ bệnh học: Sau 30 ngày uống thuốc, tất cả thỏ được mổđể quan sỏt đại thể
toàn bộ cỏc cơ quan. Kiểm tra ngẫu nhiờn cấu trỳc vi thể của gan, thận của 30% số
thỏở mỗi lụ sau đợt nghiờn cứu.
3.3.3.9. Phương phỏp xử lý kết quả
Tất cả cỏc số liệu nghiờn cứu được xử lý thống kờ y học theo phương phỏp T- TEST STUDENT.
Sự khỏc biệt cú ý nghĩa thống kờ khi P < 0,05.
Quy ước trong phần kết quả: Số liệu được biểu diễn dưới dạng X± SE. * : So với lụ chứng sinh học (lụ 1)
+ : So với lụ chứng bệnh lý (lụ 2) * hoặc + : P < 0,05 * * hoặc + + : P < 0,01 * * * hoặc ++ + : P < 0,001
4. KẾT QUẢ NGHIấN CỨU 4.1. Kết quả nghiờn cứu về thực vật.
4.1.1. Xỏc định tờn khoa học
* Thu thập mẫu
Để cú thể xỏc định đỳng loài Cỏ mật nghiờn cứu là Eriochloa ramosa ( Retz.) Hack., chỳng tụi đó thu 10 mẫu thực vật cú tờn là Cỏ mật để phõn loại. Việc thu mẫu được được tiến hành tại cỏc địa phương như huyện Từ Liờm, Thanh Trỡ, Đụng Anh, Gia Lõm - Hà Nội và huyện Mờ Linh- Vĩnh Phỳc. Việc xỏc định đỳng loài sẽ giỳp cho việc thu đỳng nguyờn liệu phục vụ nghiờn cứu. Trong số các mẫu thu thập đ−ợc gọi là Cỏ mật, chúng tôi đã xác định đ−ợc mẫu cú đặc điểm hỡnh thỏi, cỏc đặc điểm vi phẫu thõn cõy và bột của cỏc phần trờn mặt đất của cõy như sau:
*Đặc điểm hỡnh thỏi thực vật
Hỡnh 4.1. Ảnh cõy cỏ mật (Eriochloa ramosa (Retz.) Hack., Poaceae)
Cõy thảo mọc thành bụi dầy, cao 0,3 đến 1,5m, thõn phự ở mắt và cú lụng. Rễ chựm, mọc dầy đặc. Lỏ mọc so le, hỡnh dải, đầu nhọn, phiến hẹp, khụng cú lụng, dài 8-15cm, bẹ lỏ xũe rụng, lưỡi bẹ ngắn, cú lụng. Hoa tự hỡnh bụng kộp, phõn nhỏnh cao
hoa lưỡng tớnh, dẹt, màu xỏm, 3 nhị chỉ nhị hỡnh sợi, bầu thuụn dẹt, cú hai vũi nhụy, nỳm nhụy màu hung đen. Quả nằm trong mày hoa, gốc nhọn, tự ở đầu, nhẵn, dẹt cú vũi tồn tại.
* Đặc điểm giải phẫu
- Vi phẫu thõn cõy : Mặt cắt thõn hỡnh gần trũn, dưới kớnh hiển vi từ ngoài vào trong thấy: Biểu bỡ là một hàng tế bào hỡnh trũn nhỏ, thành tế bào húa gỗ nhiều. Sỏt dưới biểu bỡ là 1-3 hàng tế bào trụ bỡ cú thành tế bào húa gỗ nhiều, mụ mềm vỏ, cấu tạo bởi cỏc tế bào hỡnh đa giỏc trũn thành mỏng, mang cỏc đỏm khuyết tế bào cú kớch thước lớn. Vũng trụ trong gồm nhiều bú libe-gỗ xếp lộn xộn thành 3 vũng trong mụ mềm ruột, mỗi bú libe-gỗ cấu tạo bởi 3-4 mạch gỗ lớn xếp xen kẽ với lớp libe kộm phỏt triển và được bao xung quanh bởi một vũng tế bào sợi húa gỗ nhiều; hai vũng libe-gỗ phớa ngoài xếp sớt nhau và được ngăn cỏch bởi một vũng tế bào sợi liờn tục, cỏc bú libe-gỗ ngoài cựng cú kớch thước nhỏ hơn. Mụ mềm ruột là cỏc tế bào hỡnh đa giỏc hay gần trũn, kớch thước lớn, thành mỏng, phớa trong cựng thường bị khuyết hay rỗng ruột (Hỡnh 4. 2).
Hình 4. 2: ảnh một phần vi phẫu thân Cỏ mật (Eriochloa ramosa (Retz.) Hack., Poaceae)
- Đặc điểm bột
Bột cú màu vàng nõu, mựi thơm dược liệu. Soi dưới kớnh hiển vi thấy nhiều mảnh biểu bỡ cấu tạo bởi cỏc tế bào hỡnh chữ nhật cú thành dày (1, 2, 3), mảnh biểu bỡ mang lỗ khớ (1). Mảnh mụ mềm (4) cấu tạo bởi cỏc tế bào hỡnh đa giỏc dai, thành mỏng. Sợi (5) thường tập trung thành bú lớn. Mảnh biểu bỡ phiến lỏ mang mạch xoắn (9) và mạch hỡnh vạch (8). Rất nhiều hạt phấn hoa (6) hỡnh trũn, cú đường kớch khoảng 20-26àm, mảnh cỏch hoa cú nhiều gai nhọn (7). (Hỡnh 4.3)
Hình 4.3: ảnh một số đặc điểm bột Cỏ mật (Eriochloa ramosa (Retz.) Hack., Poaceae)
Căn cứ vào cỏc đặc diểm hỡnh thỏi và giải phẫu, đối chiếu với cỏc tài liệu [3],[27]xỏc định tờn khoa học của mẫu Cỏ mật trờn là Eriochloa procera ( Retz.) C.Hubb 1930 (CCVN, 3:831)- Agrostis procera Retz. 1786.- Milium ramosum Retz. 1971.-Eriochloa ramosa (Retz.) Hack. 1906 ( FGI,7 : 408; CCI: 339), non Kutze ( 1981)- Cỏ mật.
4.1.2. Đặc điểm sinh học và phõn bố
- Đặc điểm sinh học: Cõy sống hàng năm, sinh trưởng và đẻ nhỏnh vào mựa xuõn và mựa hạ. Đõy là thời điểm cõy đạt sinh khối lớn nhất trong năm. Từ thỏng 9 đến thỏng 12, cõy ra hoa, kết hạt và tàn lụi vào thỏng 1 năm sau. Tuy nhiờn ở những nơi đất thường xuyờn ẩm ướt và mầu mỡ, cõy chỉ khụ, lụi ở phần trờn ngọn. Phần thõn và gốc vẫn tồn tại để tiếp tục sinh trưởng và phỏt triển vào năm sau. Thụng thường quả chớn vào thỏng 11-12. Quả chớn ớt rụng mà thường khụ hộo theo phần ngọn để cựng gục xuống đất. Sau một thời gian ngắn, hạt rời khỏi bụng và chỡm trong đất. Vào mựa xuõn, hạt nảy mầm và phỏt triển cho một thế hệ mới.
- Phõn bố: Cõy cỏ mật phõn bố rộng rói ở hầu hết cỏc tỉnh vựng trung du và đồng bằng nước ta. Cõy sống khỏ phổ biến trờn ruộng bỏ hoang, bói trống, bói cỏ ven đường, ven mương mỏng hoặc ven ao hồ ở hầu hết cỏc xó trong cỏc huyện Đụng Anh, Gia Lõm, Thanh Trỡ, Từ Liờm- Hà Nội, Mờ linh- Vĩnh Phỳc...
4.2. Kết quả nghiờn cứu thành phần húa học
4.2.1. Định tớnh cỏc thành phần húa học
* Định tớnh cỏc thành phần húa học bằng cỏc phản ứng húa học
Dược liệu được chiết với cỏc dung mụi khỏc nhau để làm cỏc phản ứng định tớnh. Dược liệu chiết bằng ether dầu để định tớnh chất bộo, phytosterol và carotenoid, chiết bằng ethanol đểđịnh tớnh flavonoid, coumarin và alcaloid, chiết bằng nước dểđịnh tớnh đường khử, acid hữu cơ, tanin, saponin, anthraglycosid, flavonoid, acid amin, và glycosid tim. Kết quảđược ghi ở bảng 4.1
Bảng 4.1. Kết quảđịnh tớnh một số thành phần hoỏ học trong cỏ mật
Nhúm chất Phản ứng Kết quả Sơ bộ kết luận
Chất bộo Dịch chiết để lại vết mờ trờn giấy - Khụng cú
Sterol P.ư Liberman + Cú
Tinh dầu Cắn cú mựi thơm - Khụng cú
Carotenoid Cắn cụ đặc của dịch chiết cho màu
Flavonoid - P.ư với kiềm +Với hơi amoniac + Với dd NaOH 10% - P.ư Cyanidin - P.ư với dd FeCl3 5% - P.ư với dd AlCl3 ++ + +++ + cú Đường khử P.ư với TT Feling + + + Cú Acid hữu cơ P.ư với dd Na2CO3 + + Cú Tanin - P.ư với dd FeCl3 5% - P.ư với dd gelatin +++ + Cú
Acid amin Phản ứng với dd ninhydrin cú màu xanh tớm +++ Cú
Saponin P.ư tạo bọt +++ Cú
Anthranoid DGịạch chin lớp ether mờ, thờm dd NaOH ết nước lắc với ether mờ. lắc nhẹ cú màu tớm ở phõn lớp - Khụng cú Alcaloid - P.ư với TTMayer - P.ư với TTMunier - P.ư với TTBouchardatt - P.ư với TTAcid picric - ++ +++ - Cú Glycosid tim - P.ư Baljet - P.ư Xanthidrol - - Khụng cú * Định tớnh cỏc thành phần hoỏ học bằng phương phỏp sắc ký lớp mỏng, kết quả thể hiện trờn SK đồở hỡnh 4.4
Hệ dung mụi triển khai SKLM
Hệ dm1 : Ethyl acetat : acid acetic : acid formic : nước 10 : 1: 1 :2 Hệ dm2 :N propanol : ethyl acetat : acid acetic khan : nước 4 :3: 1: 2
Thuốc thử
1.Acid boric 10% : acid oxalic 10% 2: 1 2.Natural produc ( NP )/ PEG 4000 3. α Naphthol-acid sulfuric
4. Ninhydrin/acid acetic/ n.butanol Kết quả
- Sắc ký đồ thể hiện kết quả dương tớnh với cỏc thuốc thử phỏt hiện flavonoid gồm cú : Hỡnh 4.4A ( Hệ dm1,TT1 ), hỡnh 4.4B (Hệ dm1,TT2)
- Sắc ký đồ thể hiện kết quả dương tớnh với cỏc thuốc thử phỏt hiện đường: Hỡnh 4.4C ( Hệ dm2,TT3 ).
- Sắc ký đồ thể hiện kết quả dương tớnh với cỏc thuốc thử phỏt hiện acid amin : Hỡnh 4. 4D ( Hệ dm2,TT4 ).
Hỡnh 4. 4: Sắc ký đồ của một số nhúm chất cú trong thành phần hoỏ học Cỏ mật
( dlC : Cỏ mật chiết bằng ethanol, dlN : Cỏ mật chiết bằng nước )
4.2.2. Định lượng cỏc thành phần húa học trong cao nước và cao cồn cỏ mật
Kết quả định tớnh thành phần húa học trong cỏ mật bằng SKLM cho thấy cú flavonoid, đường, acid amin. Cỏc thành phần này đều cú trong dịch chiết cồn và dịch
chiết nước. Tuy nhiờn khi nghiờn cứu sàng lọc tỏc dụng bảo vệ gan của hai loại dịch chiết này cho thấy cao nước cú tỏc dụng tốt hơn. Kết quả này cho thấy mặc dự cỏc thành phần húa học đó định tớnh là giống nhau song cú thể tỷ lệ của chỳng trong cao nước và cao cồn khỏc nhau nờn tỏc dụng bảo vệ gan của cao nước mạnh hơn. Để cú thể