L Ờ IC ẢM ƠN
2.5. Phương pháp xử lý số liệu:
Số liệu được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± sai số chuẩn. Số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel. Ảnh hưởng của chất bảo quản, tỷ lệ pha loãng và kháng sinh đến hoạt lực của tinh trùng được phân tích phương sai một yếu tố (One-way ANOVA) bằng phần mềm SPSS 16.0.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Ảnh hưởng của các chất bảo quản khác nhau lên thời gian bảo quản tinh trùng:
Hoạt lực của tinh trùng cá chép bảo quản trong 0,3 M glucose, 0,6 M sucrose, (Common carp sperm extender) CCSE-1, CCSE-2 và CCSE-3 được thể hiện thông qua Hình 3.1.
Hình 3.1: Hoạt lực của tinh trùng (%) trong 5 chất bảo quản khác nhau 0,3 M glucose, 0,6 M sucrose, CCSE-1, CCSE-2 và CCSE-3 (Common Carp Solution Extender) được bảo quản ở 4oC. Control: không pha loãng. Các chữ cái khác
nhau trên mỗi cột trong cùng một ngày thể hiện sự sai khác có ý nghĩa thống kê của hoạt lực tinh trùng giữa các ngày kiểm tra (P<0,05).
Nhận xét: Tinh trùng được bảo quản trong CCSE-2 có hoạt lực tốt nhất so với CCSE-1, CCSE-3, 0,6 M sucrose và 0,3 M glucose. Tinh trùng bảo quản trong
CCSE-2 có thể sống đến ngày thứ 17, trong khi đó khi bảo quản trong CCSE-1, CCSE-3, 0,6 M sucrose và 0,3 M glucose lần lượt là 11, 9 và 7 ngày.
Qua phân tích phương sai một yếu tố (One-way ANOVA) ta thấy hoạt lực của tinh trùng có sự sai khác chưa đáng kể giữa các extender sau ngày thứ nhất, cụ thể: trong 2 extender 0,3 M glucose và 0,6 M sucrose không có sự sai khác nhưng lại sai khác so với lô tinh trùng bảo quản trong CCSE-1, CCSE-2 và CCSE-3, 2 nhóm này cũng có sai khác so với lô đối chứng. Sau 3 ngày bảo quản thì hoạt lực của tinh trùng trong các extender gần như đã có sự sai khác rõ rệt chỉ có nhóm CCSE-1 và CCSE-2 là không có sự sai khác nhưng đến ngày thứ 5 thì đã có sự sai khác hoàn toàn giữa 5 extender và so với lô đối chứng. Tuy nhiên, tinh trùng được bảo quản trong extender CCSE-2 có hoạt lực tốt nhất và thời gian sống dài nhất, kéo dài đến 17 ngày.
Chất bảo quản là môi trường đệm giúp pha loãng tinh dịch và để có được lượng tinh trùng pha loãng lớn trong sinh sản nhân tạo [50]. Do đó, việc sử dụng chất bảo quản trong quá trình bảo quản lạnh tinh trùng là rất cần thiết. Việc lựa chọn chất bảo quản thích hợp rất quan trọng, thành phần của chất bảo quản dựa trên thành phần có trong tinh dịch cá.
0,3 M glucose được sử dụng để bảo quản tinh trùng của đa số các loài cá nước ngọt, chẳng hạn đối với tinh trùng cá hồi Abant (Salmo trutta abanticus) khi bảo quản trong 0,3 M glucose có hoạt lực tốt hơn (65,0±3,9%) khi bảo quản trong Ringer Solution (44,0±4,9%) [38], tinh trùng cá chép kính (Ctenopharyngodon idella) bảo quản trong 0,3 M glucose có hoạt lực tốt hơn trong 1% NaCl và hỗn hợp 75 mM NaCl, 70 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 20 mM Tris (Modified ionic solution) [24]. Trong khi đó, tinh trùng cá chép (Cyprinus carpio) theo kết quả nghiên cứu này khi bảo quản trong CCSE-2 có hoạt lực tốt hơn so với 0,3 M glucose. Đối với tinh trùng của cá đù vàng (Larimichthys polyactis) khi bảo quản trong ASP (Artificial Seminal Plasma) có thể sống được 14 ngày và trong marine fish Ringer’s solution được 10 ngày [42]. Như vậy, ở các loài cá khác nhau thì chất bảo quản cũng khác nhau.
3.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ pha loãng đến thời gian bảo quản tinh trùng:
Hoạt lực của tinh trùng cá chép ở các tỷ lệ pha loãng 1:1, 1:3, 1:5 khi bảo quản trong CCSE-2 được thể hiện thông qua Hình 3.2.
Hình 3.2. Hoạt lực của tinh trùng (%) với các tỷ lệ pha loãng khác nhau trong CCSE-2 bảo quản trong tủ lạnh ở 4oC. Control: không pha loãng. Các chữ cái
khác nhau trên mỗi cột trong cùng một ngày thể hiện sự sai khác có ý nghĩa thống kê của hoạt lực tinh trùng giữa các ngày kiểm tra (P<0,05)
Nhận xét: Qua đồ thị ta thấy tinh trùng bảo quản ở tỷ lệ 1:3 cho hoạt lực tốt nhất kéo dài thời gian sống đến 17 ngày và ngắn nhất là ở tỷ lệ 1:5 chỉ được 9 ngày.
Sau khi phân tích phương sai một yếu tố (One-way ANOVA) ta thấy sau 1 ngày bảo quản hoạt lực của tinh trùng trong CCSE-2 tỷ lệ 1:1 và 1:3 không có sự sai khác, trong khi đó lại sai khác so với tỷ lệ 1:5 và lô đối chứng. Đến ngày thứ 3 thì hoạt lực của tinh trong CCSE-2 ở các tỷ lệ đều có sự sai khác hoàn toàn với nhau
và so với lô đối chứng. Tuy nhiên, hoạt lực của tinh trùng bảo quản ở tỷ lệ 1:3 có hoạt lực và thời gian sống tốt nhất, kéo dài đến ngày thứ 17.
Theo nghiên cứu của Le và ctv [42] tinh trùng cá đù vàng (Larimichthys
polyactis) bảo quản ở tỷ lệ 1:3 cho thời gian sống lâu nhất (14 ngày), trong khi đó ở tỷ lệ 1:1 (10 ngày) và tỷ lệ 1:5 (12 ngày). Đối với tinh trùng cá tuyết Đại Tây Dương (Gadus morhua), cá tuyết chấm đen (Melanogrammus aeglefinus) và cá mướp vân (Osmerus mordax) tỷ lệ pha loãng 1:3 tốt hơn so với các tỷ lệ 1:1, 1:2, 1:5 và 1:10 [32]. Ở tinh trùng cá da trơn châu Phi (Clarias gariepinus) tỷ lệ 1:5 thì tốt hơn so với tỷ lệ 1:3 hay 1:10 [34]. Như vậy, từng loài cá khác nhau thì bảo quản ở các tỷ lệ khác nhau.
3.3. Ảnh hưởng của việc bổ sung kháng sinh lên thời gian bảo quản tinh trùng:
Hoạt lực của tinh trùng bảo quản trong CCSE-2 khi bổ sung kết hợp 2 kháng sinh ở nồng độ 25 ppm penicillin + 25 ppm streptomycin ở tỷ lệ 1:3 được thể hiện ở hình 3.3.
Hình 3.3. Hoạt lực của tinh trùng (%) bảo quản trong tủ lạnh ở 4oC khi bổ sung kết hợp 25ppm penicillin+25ppm streptomycin. Control: không pha
loãng. Các chữ cái khác nhau trên mỗi cột trong cùng một ngày thể hiện sự sai
khác có ý nghĩa thống kê của hoạt lực tinh trùng giữa các ngày kiểm tra (P<0,05) Nhận xét: Từ biểu đồ trên ta thấy tinh trùng bảo quản trong CCSE-2 ở tỷ lệ 1:3 có bổ sung thêm kháng sinh có hoạt lực và thời gian sống tốt nhất (29 ngày) so với không bổ sung kháng sinh (17 ngày).
Qua phân tích phương sai một yếu tố (One-way ANOVA) thấy được sau khi thứ nhất và ngày thứ 3 hoạt lực của tinh trùng khi được bổ sung thêm kháng sinh và không bổ sung kháng sinh không có sự khai khác nhưng sai khác so với lô đối chứng; sau 5 ngày bảo quản thì đã có sự sai khác hoàn toàn ở các lô thí nghiệm cũng như so với lô đối chứng. Tuy nhiên, tinh trùng được bảo quản khi bổ sung thêm kháng sinh vẫn cho hoạt lực và thời gian sống tốt nhất (29 ngày).
Việc bổ sung kháng sinh đối với tinh trùng không pha loãng hoặc pha loãng đều cải thiện được thời gian lưu trữ, việc bổ sung này cho thấy đây là yếu tố quan trọng trong lưu trữ lạnh tinh trùng [21, 23]. Chất kháng sinh rất cần thiết để kéo dài thời gian bảo quản tinh trùng vì nó ngăn chặn sự sinh trưởng của vi khuẩn khi tinh dịch bị ô nhiễm bởi các chất bài tiết [26, 27].
The o một số nghiên cứu, khi bổ sung 50 IU/penicillin+50 µg/ml streptomycin cho tinh trùng cá chép không pha loãng thì khả năng vận động và thụ tinh được duy trì hơn 18 ngày ở 4oC, khi kiểm tra các mẫu tinh có chất lượng kém thì khả năng thụ tinh ít hơn 6 ngày [56]. Với cùng nồng độ đó sử dụng cho tinh trùng cá tuyết Đại Tây Dương (Gadus morhua) và cá tuyết chấm đen (Melanogrammus aeglefinus) [32]. Đối với cá hồi Đại Tây Dương (Salmo salar) nồng độ kháng sinh cao hơn (125 IU/ml penicillin+125 µg/ml streptomycin) không gây độc cho tinh trùng [61] và nồng độ này cũng có thể cải thiện thời gian lưu trữ đối với cá chép. Việc lưu trữ tinh trùng cá thìa (Polyodon spathula) khi bổ sung 5000IU/penicillin+5mg/ml streptomycin cho khả năng thụ tinh 73% sau 25 ngày bảo quản và có thể duy trì khả năng vận động đến ngày 56 [25]. Ở cá da trơn châu Phi (Clarias gariepinus) khi bổ sung 25-50 IU/ml penicillin+25-50 µg/ml streptomycin không cải thiện được chất lượng tinh trùng trong quá trình lưu trữ ngắn hạn (4 ngày) và với lượng 100 IU/ml penicillin+100
µg/ml streptomycin gây độc cho các tế bào trong khi đó khi bổ sung 1mg/ml gentamycin sulfate có thể cải thiện khả năng vận động của tinh trùng được lưu trữ. Trong cùng 1 loài, có thể cải thiện thời gian lưu trữ từ 3-8 ngày khi kết hợp 2 kháng sinh trên với lượng 100 IU penicillin+100 µg/ml streptomycin và 0,25 µg/ml antimycotic amphotericin [29]. Đối với tinh trùng cá đù vàng (Larimichthys
polyactis) thì khi khi sử dụng 600ppm gentamycin hoặc 200ppm neomycin cho thời gian bảo quản lên 26 ngày [42].
Tóm lại, tinh trùng có hoạt lực tốt nhất nếu được bảo quản trong các điều kiện tối ưu: bảo quản trong chất bảo quản CCSE-2 ở tỷ lệ pha loãng 1:3 và được bổ sung thêm 25 ppm penicillin+25 ppm streptomycin.
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 4.1. Kết luận:
Qua thí nghiệm bảo quản tinh trùng cá chép trong tủ lạnh ở 4oC, kết quả thu được như sau:
- Tinh trùng được bảo quản trong CCSE-2 cho thời gian sống của tinh trùng dài nhất lên đến 17 ngày và ngắn nhất trong 0,3 M glucose và 0,6 M sucrose chỉ sống được 7 ngày.
- Đối với thí nghiệm tỉ lệ pha loãng thì tinh trùng được bảo quản trong CCSE-2 ở tỉ lệ 1:3 cho thời gian hoạt lực lâu nhất 17 ngày, trong khi đóở tỉ lệ 1:5 là ngắn nhất 9 ngày.
- Khi bổ sung thêm 25 ppm pencillin+25 ppm streptomycin khi bảo quản tinh trùng cá chép trong CCSE-2 ở tỉ lệ 1:3 kéo dài thời gian sống của tinh trùng lên đến 29 ngày.
4.2. Đề xuất ý kiến:
Qua thí nghiệm ta thấy tỷ lệ sống và thời gian hoạt lực của tinh trùng cá chép thay đổi theo thời gian bảo quản, do đó chất lượng tinh trùng cũng thay đổi. Chất lượng tinh trùng được xác định chính xác bằng tỷ lệ thụ tinh [33, 41, 43, 47]. Tuy nhiên, trong thời gian thực hiện đề tài cá chép cái không sinh sản tự nhiên cho đến khi thí nghiệm kết thúc. Do đó, đối với các nghiên cứu sau này nên tiến hành cho thụ tinh nhằm đánh giá được chất lượng tinh trùng một cách chính xác hơn.
Các yếu tố chính ảnh hưởng đến quá trình bảo quản lạnh tinh trùng cá chép nói riêng và động vật thuỷ sản nói chung gồm: chất bảo quản, tỷ lệ pha loãng, nhiệt độ và kháng sinh. Vì vậy, việc lựa chọn chất bảo quản thích hợp là “chìa khoá” thành công trong bảo quản lạnh tinh trùng [42]. Trong nghiên cứu này, tôi đã tiến hành bảo quản trong 5 chất bảo quản: 0,3 M glucose, 0,6 M sucrose, CCSE-1, CCSE-2 và CCSE-3, kết quả tốt nhất đạt được khi sử dụng CCSE-2 ở tỷ lệ 1:3 (17 ngày). Cần
có những nghiên cứu bảo quản tinh trùng cá chép trong các chất bảo quản khác để kéo dài thời gian bảo quản hơn.
Oxy rất cần thiết cho việc duy trì khả năng hoạt hoá của tế bào [42]. Trong thí nghiệm này, việc bảo quản tinh trùng trong điều kiện được cung cấp oxy chưa được thực hiện do lượng tinh dịch không đủ dẫn đến tỷ lệ sống và thời gian hoạt lực của tinh trùng giảm do thiếu oxy. Do đó, cần có nghiên cứu cụ thể hơn để kiểm tra ảnh hưởng của oxy đến tỷ lệ sống và thời gian bảo quản tinh trùng cá chép.
Nhiệt độ cũng là một yếu tố chính ảnh hưởng đến quá trình bảo quản tinh trùng, nhiệt độ được sử dụng phổ biến là từ 0-4oC. Nhiệt độ thấp sẽ làm giảm sự sinh trưởng của vi khuẩn, điều này giải thích vì sao nhiệt độ thấp hơn 6oC tốt hơn so với nhiệt độ cao hơn [23]. Trong thí nghiệm này, tinh trùng cá chép chỉ được bảo quản ở 4oC, vì vậy để có thể xác định được nhiệt độ nào là thích hợp nhất để bảo quản thì cần có nhiều thí nghiệm nghiên cứu bảo quản ở 0oC, 2oC và 6oC để so sánh với kết quả của thí nghiệm trên.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Hồ Thu Cúc. (1996). Tổ chức học - Phôi sinh học. Tài liệu lưu hành nội bộ. 2. Hồ Kim Điệp, Trần Thị Thuý Hà, Đặng Thị Tuyết Mai, Phạm Anh Tuấn và
Trần Vũ Hùng. (2002). Báo cáo tổng kết đề tài bảo quản tinh cá. Viện nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản I.
3. Lưu Thị Dung và Phạm Quốc Hùng. (2005). Bài giảng mô phôi học thuỷ sản.
NXB Nông nghiệp thành phố Hồ Chí Minh: p. 47-49.
4. Thông Thị Ánh Hằng. (2003). Báo cáo tốt nghiệp "Bước đầu nghiên cứu và bảo quản tinh trùng cá chép (Cyprinus carpio L.) trong nitơ lỏng (-196oC). Trường Đại học Nha Trang.
5. Nguyễn Văn Hảo và Ngô Sỹ Vân. (2001). Cá nước ngọt Việt Nam (tập 1) Họ cá chép Cyprinidae. NXB Nông nghiệp.
6. Bùi Lai, Nguyễn Quốc Khang, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Quang Long và Mai Đình Yên. (1985). Cơ sở sinh lý sinh thái cá. Nhà xuất bản Nông nghiệp Hà Nội.
7. Vũ Thị Loan. (2007). Báo cáo tốt nghiệp "Nghiên cứu bảo quản tinh trùng cá trê đen (Clarias fuscus) trong nitơ lỏng (-196oC). Trường Đại học Nha Trang. 8. Đàm Bá Long. (2006). Luận văn thạc sỹ "Nghiên cứu bảo quản tinh trùng cá mè
trắng (Hypopthalmichthys molitrix) trong Nitơ lỏng (-196oC)". Trường Đại học Nha Trang.
9. Trịnh Thị Nguyên. (2007). Báo cáo tốt nghiệp "Nghiên cứu bảo quản tinh trùng cá chép (Cyprinus carpio) trong nitơ lỏng. Trường Đại học Nha Trang.
10. Tô Hoàng Nhàn. (2004). Báo cáo tốt nghiệp "Nghiên cứu và bước đầu bảo quản tinh trùng cá chép (Cyprinus carpio L.) trong nitơ lỏng. Trường Đại học Nha Trang.
11. Võ Ngọc Thám. (2011). Bài giảng sản xuất giống cá nước ngọt. Tài liệu lưu hành nội bộ.
12. Nguyễn Minh Thành, Trịnh Quốc Trọng, Hoàng Quang Bảo và Nguyễn Thị Hồng Vân. (2001-2003). Bảo quản tinh cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) dài hạn bằng nitơ lỏng. Viện nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản II.
13. Phan Thị Thảo. (2005). Nghiên cứu bảo quản tinh trùng cá chép Cyprinus carpoi trong nitơ lỏng. Trung tâm quốc gia giống thuỷ sản nước ngọt miền Bắc, Gia Lộc, Hải Dương.
14. Nguyễn Văn Tính. (2006). Báo cáo tốt nghiệp "Nghiên cứu bảo quản tinh trùng cá trê đen (Clarias fuscus) trong tủ lạnh và nitơ lỏng. Trường Đại học Nha Trang. 15. Nguyễn Tấn Trịnh, Hà Ký, Bùi Đình Chung và Trần Mai Thiên. (1996). Nguồn
lợi thuỷ sản Việt Nam. NXB Nông Nghiệp.
16. Dương Tuấn. (1981). Sinh lý học động vật và cá. Tài liệu lưu hành nội bộ: p. 310-314.
17. Mai Đình Yên. (1983). Các loài cá kinh tế miền Bắc Việt Nam. NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội.
Tiếng Anh
18. Billard, R. (1998). Carp; Fish-culture. Chichester and New York.
19. Billard, R., Cosson, G., Perchec, G. and Linhart, O. (1995). Biology of sperm and artificial reproduction in carp. Aquaculture, 129: p. 95-112.
20. Billard, R., Cosson, J., Crim, L.W. and Suquet, M. (1995). Sperm physi-ology and quality, in Broods-tock Management and Egg and Larval Quality, Bromage, N., Roberts R (eds), Editor Blackwell, Oxford. p. 25- 52.
21. Billard, R., Cosson, J., Noveiri, S.B. and Pourkazemi, M. (2004). Cryopreservation and short-term storage of sturgeon sperm, a review.
Aquaculture, 236: p. 1-9.
22. Billard, R., Marcel, J. and Matei, D. (1981). Survie in vitro et post mortem des gametes de truite fario (Salmo trutta fario). Can J Zool, 59: p. 29.
23. Bobe, J. and Labbe, C. (2009). Chilled storage of sperm and eggs, in Methods in Reproductive Aquaculture: Marine and Freshwater Species, Cabrita, E., Robles, V. and Herráez, P., Editors. CRC Press, Taylor Francis Group. p. 219-235.
24. Bozkurt., Y., Ogretmen., F. and Secer., F.S. (2009). Effect of Different Extenders and Storage Periods on Motility and Fertilization Success of Grass Carp (Ctenopharyngodon idella) Sperm During Spawning Season. Tarim Bilimleri Dergisi, 15: p. 277-284.
25. Brown, G.G. and Mims, S.D. (1995). Storage, transportation, and fertility of undiluted and diluted paddlefish milt. Prog Fish Cult, 57: p. 64.
26. Chang, Y.J., Chang, Y.J., Lim, H.K., Lee, J.K. and Park, Y.J. (2002). Cold storage of milt from four species of flatfish. J. Fish. Sci. Tech., 5: p. 64-74. 27. Chao, N.H., Tsai, H.P. and Liao, I.C. (1992). Short- and long-term
cryopreservation of sperm and sperm suspension of the grouper Epinephelus malabaricus. Asian Fish. Sci., 5: p. 103-116.
28. Chereguini, O., Cal, R.M., Dreanno, C., Ogier de Baulny, B., Suquet, M. and Maisse, G. (1997). Short-term storage and cryopreservation of turbot (Scophthalmus maximus) sperm. Aquat Living Resour, 10: p. 251.
29. Christensen, J.M. and Tiersch, T.R. (1996). Refrigerated storage of channel catfish sperm. J World Aquacult Soc, 27: p. 340.