- Dung môi:
+ Các dung môi dùng cho HPLC đều phải lọc qua màng lọc có kích thƣớc lỗ là 0,45µm hay 0,22µm. (trừ một dung môi mà sản xuất đã lọc trƣớc: acetonitril, methanol,…)
+ Dung môi là nƣớc hoặc hệ đệm trong nƣớc thì dùng màng lọc cellulose acetat
hay nitrat, hỗn hợp dung môi hữu cơ và nƣớc thì dùng màng lọc polyamid hay nylon, dung môi hữu cơ lọc qua màng lọc teflon.
2.3.2.2 Các thông số đặc trƣng trong sắc ký lỏng cao áp
- Thời gian chết (to): là thời gian cần thiết để pha động chạy qua hệ thống tách.
- Thời gian lƣu (tR): là thời gian cần thiết để từ khi chất đƣợc bơm vào cột cho đến khi đạt nồng độ cực đại trên detector.
- Thời gian lƣu thực (tR’): tR’ = (tR - to)
- Hệ số dung lƣợng (k’): k’ = tR/to – 1 . hệ số dung lƣợng tốt nhất là 1<k’<8
- Hệ số chọn lọc (α): α = KB/KA = k’B/k’A = tR’B/tR’A. B lƣu giữ mạnh hơn A nên
α > 1. Hệ số chọn lọc tốt nhất là 1,05 < α < 2.
- Số điã lý thuyết (N): N = 16×(tR/W)2 với W là chiều rộng đáy peak.
- N tốt nhất khi N gần bằng Nmax với Nmax = 4000 × (L/dr) với L là chiều dài cột (cm), dr là đƣờng kính hạt pha tĩnh (µm).
- Độ phân giải (R): độ phân giải giữa hai peak A và peak B đƣợc tính theo công thức: R = 2[(tR)B - (tR)A]/(WA + WB).
Theo DĐVN3, BP, USP30 thì R = 1,5 là hai peak tách nhau hoàn (chỉ xen phủ 0,3%). Vậy độ phân giải giữa hai peak tốt nhất là R ≥ 1,5.
- Hệ số đối xứng (AS): AS = Wx/2A. Hệ số đối xứng tốt nhất là 0,8<AS<1,2.
2.3.3 Định tính và định lƣợng bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp
2.3.3.1 Định tính
Nguyên tắc của phân tích định tính là: so sánh thời gian lƣu của các peak sắc ký trong mẫu phân tích với thời gian lƣu của các peak sắc ký trong mẫu chuẩn. Từ đó sẽ xác định trong mẫu phân tích có những chất nào, nếu chúng có thời gian lƣu giữ đúng nhƣ thời gian lƣu giữ của các peak trong mẫu chuẩn.
2.3.3.2 Định lƣợng
Nguyên tắc
Tất cả các phƣơng pháp định lƣợng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: nồng độ của chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích peak của nó.
Phƣơng pháp định lƣợng
Sau khi hòa tan thuốc, dung dịch hịa tan đƣợc lấy ra, đem lọc, pha lỗng (nếu cần), lọc qua màng lọc Milipore 0,45µm, tiến hành chạy sắc ký để định lƣợng.
Có 4 phƣơng pháp định lƣợng trong sắc ký: phƣơng pháp ngoại chuẩn, phƣơng pháp nội chuẩn, phƣơng pháp thêm chuẩn và phƣơng pháp chuẩn hóa diện tích.
Trong điều kiện tiến hành luận văn ở phòng Kiểm Nghiệm, định lƣợng tiến hành theo phƣơng pháp ngoại chuẩn.
Phƣơng pháp ngoại chuẩn
Phƣơng pháp ngoại chuẩn là phƣơng pháp định lƣợng cơ bản, trong đó cả hai mẫu chuẩn và thử đều đƣợc tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện.
So sánh diện tích (hoặc chiều cao) peak của mẫu thử với diện tích (hoặc chiều cao) peak của mẫu chuẩn sẽ tính đƣợc nồng độ của các chất trong mẫu thử.
Có thể sử dụng phƣơng pháp chuẩn hóa một điểm hoặc nhiều điểm
a. Chuẩn hóa một điểm: chọn nồng độ của mẫu chuẩn xấp xỉ nồng độ của mẫu
thử.
Tính nồng độ mẫu thử theo cơng thức:
Cx: nồng độ mẫu thử
Cs: nồng độ chất chuẩn
Sx: diện tích (hoặc chiều cao) peak của mẫu thử Ss: diện tích (hoặc chiều cao) peak của mẫu chuẩn
b. Chuẩn hóa nhiều điểm:
Chuẩn bị một dãy chuẩn với các nồng độ tăng dần rồi tiến hành sắc ký. Các đáp ứng thu đƣợc là các diện tích hoặc chiều cao peak ở mỗi điểm chuẩn.
Vẽ đồ thị chuẩn biểu diễn sự tƣơng quan giữa diện tích S (hoặc chiều cao H) của peak với nồng độ của chất chuẩn (C).
Cx= Cs
s x S S
Sử dụng đoạn tuyến tính của đƣờng chuẩn để tính tốn nồng độ của chất cần xác định có thể thực hiện việc tính tốn này theo hai cách:
Áp dữ kiện diện tích hoặc chiều cao peak của chất thử vào đƣờng chuẩn sẽ suy ra đƣợc nồng độ của nó.