2.2 PHƢƠNG PHÁP KIỂM TRA HÀN THE, NITRAT VÀ NITRIT
2.2.1.2 Phƣơng pháp Metyl borax
Nguyên tắc:
Khi có mặt của axit sunfanlic làm xúc tác, borax và methanol phản ứng với nhau tạo hợp chất trimetyl borax và khi đốt hợp chất này cho ngọn lửa màu xanh
Hình 11: Trimetyl borat cháy cho ngọn lửa màu xanh và công thức của trymetyl borax
2.2.1.3 Phƣơng pháp phenolphthalein[7][8]
Nguyên lý
Hàn the có phản ứng kiềm với phenolphthalein cho dung dịch màu hồng. Nếu cho dung dịch này tác dụng với glycerin trung tính, dung dịch sẽ chuyển thành axit, sẽ mất
B O O O H3C CH3 H3C
SVTH: Lê Hoàng Chỉnh 27
màu hồng, trở thành không màu (phản ứng axit với phenolphthalein do tạo thành axit glyxero boric có tính axit).
2.2.2 Kiểm tra Nitrat[1][3][7][8][11]
2.2.2.1. Phƣơng pháp thể tích
Nguyên lý
Ngƣời ta có thể xác định nitrat theo phƣơng pháp thể tích dựa trên phản ứng khử NO3 về các trạng thái oxi hố thấp hơn bằng các chất khử thích hợp. Sau đó tiến hành phép đo chuẩn độ (có thể sử dụng chuẩn độ trực tiếp hay chuẩn độ ngƣợc).
Với phép chuẩn độ ngƣợc thì một lƣợng chính xác dung dịch chuẩn 2
Fe đƣợc cho dƣ so với lƣợng cần thiết vào dung dịch mẫu. Sau đó lƣợng dƣ 2
Fe đƣợc chuẩn độ bằng dung dịch 2
7 2O
Cr với chất chỉ thị là ferroin.
Các phƣơng trình phản ứng xảy ra nhƣ sau:
Fe H NO 3 2 4 3 Phản ứng giữa 2
Fe và NO3xảy ra nhanh hơn khi đun nóng dung dịch và có mặt của lƣợng dƣ axit H2SO4 65%. Do NO sinh ra phản ứng với oxi khơng khí tạo thành các chất có khả năng bị khử hay bị oxi hố bởi 2
Fe nên trong quá trình phản ứng và chuẩn độ phải đƣợc tiến hành trong mơi trƣờng khí CO2. Điều này đƣợc thực bằng cách thêm một lƣợng nhỏ NaHCO3 trƣớc khi đun nóng và chuẩn độ.
2.2.2.2 Phƣơng pháp so màu:
Các phương pháp so màu cũng được dùng để xác định
3
NO dựa trên ba loại phản ứng sau:
Nitrat hóa các hợp chất phenolic.
Khử NO3 thành NO2 hoặc NH3 rồi xác định chúng theo phƣơng pháp thích hợp.
O H Fe NO3 32 2 CrO H Fe 14 2 2 2 72 6Fe32Cr37H2O
SVTH: Lê Hoàng Chỉnh 28
Oxi hóa các hợp chất hữu cơ có nhóm mang màu đặc trƣng. Trong đó, có các phƣơng pháp lên màu sau:
Phƣơng pháp lên màu với phenoldisunfonic. Phƣơng pháp lên màu với bruxin.
Phƣơng pháp lên màu với diphenylamin. Phƣơng pháp iod.
a. Phƣơng pháp lên màu với phenoldisunfonic
Nguyên lý: Nitrat kết hợp với axit phenoldisunfonic thành axit nitrophenol disunfonic màu vàng, màu sắc tăng lên do kiềm hóa NH4OHso sánh với một dung dịch chuẩn, ta có thể tính đƣợc lƣợng nitrat trong chất thử.
Phƣơng trình phản ứng:
Phản ứng phải thực hiện trong khan nƣớc, do đó phải cần thiết làm khơ mẫu thử và khi cho axit phenol disunfonic vào cặn cịn lại, thì nitrat chuyển thành HNO3 tạo điều kiện cho việc nitro hóa đƣợc tốt.
b. Phƣơng pháp lên màu với bruxin
Nguyên lý: Nitrat kết hợp với bruxin thành một phức chất màu vàng. So sánh với thang màu và từ đó tính ra hàm lƣợng nitrat trong 100 g thực phẩm.
c. Phƣơng pháp lên màu với diphenylamin
OH SO3H + HNO3 OH SO3H NO2 HO3S HO3S + H2O OH SO3H NO2 HO3S + 3NH4OH OH SO3H NO2 H4NO3S + 3H2O
SVTH: Lê Hoàng Chỉnh 29
Nguyên lý: - 3
NO cho với diphenylamin ở môi trƣờng H2SO4 một hợp chất màu xanh lơ. So sánh thang màu mẫu.
d. Phƣơng pháp iod
Nguyên lý: Trong mơi trƣờng axit acetic có mặt của kẽm (Zn) và kali iođua (KI), nitrat sẽ bị khử thành NO2 và kali iođua sẽ bị oxi hóa để giải phóng iod tự do. Iod giải phóng đƣợc phát hiện bằng màu xanh tím nhờ chỉ thị hồ tinh bột. Tùy theo hàm lƣợng nitrat có trong sản phẩm nhiều hay ít, iod giải phóng nhiều hay ít, nhanh hay chậm.
Đối chiếu với một mẫu chuẩn tiến hành song song trong những điều kiện nhƣ nhau, có hàm lƣợng nitrat bằng hàm lƣợng tối đa cho phép hiện nay là 500 mg/kg đối với lạp xƣởng, thịt chế biến, thịt muối, dăm bơng… thì thời gian bắt đầu xuất hiện màu xanh tím trong vịng 1 ÷ 2 phút và sau đó 5 phút màu xanh tím sẽ rõ nét, ổn định hồn tồn.
Phản ứng của quá trình diễn biến nhƣ sau:
CH3COOH + Zn (CH3COOH)2Zn + H2 H2 + KI HI + K HNO3 + HI NO2 + 4H2O + 2 1 I2 NO2 + H2O HNO2
2HNO2 + 2HI 2NO + 2H2O + I2 (tinh bột)
2.2.2.3 Phƣơng pháp dòng chảy (FIA)
FIA là một phƣơng pháp kĩ thuật phân tích động, trong đó phân tích ở dạng lỏng đƣợc bơm trực tiếp vào dịng chất mang chuyển động liên tục. Sau đó, mẫu đi đến vịng phản ứng, rồi trong vòng phản ứng chất phân tích sẽ phản ứng với thuốc thử có trong chất mang để tạo ra sản phẩm có thể phát hiện đƣợc theo một tính chất hóa lí nào đó của nó nhờ một dertector thích hợp. Các tính chất hóa lí có thể phát hiện đƣợc nhƣ:
Sự hấp thụ quang phân tử UV-VIS.
SVTH: Lê Hoàng Chỉnh 30
Tính chất huỳnh quang.
Sự thay đổi điện thế.
Để xác định nitrat bằng phƣơng pháp FIA ngƣời ta tiến hành hai thí nghiệm:
Hình 12: Mơ hình trong phƣơng pháp FIA.
Thí nghiệm 1: Xác định hàm lƣợng - 2
NO Trong môi trƣờng axit yếu, ion -
2
NO phản ứng với sunfanyl amin và N-etylendiamin một cách định lƣợng và tạo thành hỗn hợp điazo hấp thụ mạnh ở bƣớc sóng 540 nm. Nếu bơm mẫu phân tích vào FIA có dịng chất mang chứa thuốc thử trên thì có thể xác định đƣợc nồng độ -
2
NO trong mẫu nhờ dertector hấp thụ quang UV-VIS với bƣớc sóng là 540 nm. Thí nghiệm 2: Xác định tổng - 3 NO và - 2 NO .
Bằng cách lắp vào thêm vào hệ FIA một cột để khử ion - 2 NO về - 3 NO . Sau đó, xác định tổng hàm lƣợng - 2
NO nhƣ thí thí nghiệm một. Hiệu số kết quả của hai lần đo chính là hàm lƣợng nitrat.
2.2.2.4 Phƣơng pháp cực phổ
Trong mơi trƣờng chất điện li có điện tích cao nhƣ 3
La hay 2
Ba ,ion - 3
NO cho sóng cực phổ tại mức điện thế từ 1,1 đến 1,4 V.
Để xác định nitrit, ngƣời ta thƣờng dùng sóng xúc tác urani 2
2
UO . Trong mơi trƣờng tạo phức nhƣ nền Na2CO3 có nồng độ 0,1 M thì 2
2
UO chỉ cho một sóng định lƣợng có E(1/2)=0,9-1,1V phụ thuộc vào nồng độ nitrat.
SVTH: Lê Hoàng Chỉnh 31
Kolthoff và các cộng sự là những ngƣời đầu tiên nghiên cứu xác định - 3
NO bằng dòng cực phổ xúc tác. Các tác giả cho rằng nền HCl (0,1 M) chứa một lƣợng nhỏ urani acetat sự khử U(VI) xảy ra theo hai bƣớc:
U(VI) + e U(V)
U(V) + e U(III)
Tạo nên hai sóng cực phổ:
Sóng thứ nhất ứng với sự khử U(VI) xuống U(V) có thế bán sóng E(1/2)=-0,18V
Sóng thứ hai ứng với sự khử U(V) xuống U(III) có thế bán sóng E(1/2)=-0,94V
Khi có mặt của ion - 3
NO tùy chiều cao của sóng thứ hai tăng lên tuyến tính với nồng độ -
3
NO trong khoảng 5.10e-5- 4.10e-4 M
2.2.2.5 Phƣơng pháp đo khí
Hassan là ngƣời đầu tiên đƣa ra một phƣơng pháp đo khí đơn giản thích hợp cho việc xác định đồng thời nitrat và nitrit trong cùng một mẫu.
Theo ông, đầu tiên nitrit đƣợc phân hủy bằng Ure (CO(NH2)2) hoặc axit sunfamit
(HSO3NH2) để tạo ra khi N2 trong môi trƣờng axit yếu. Trong điều kiện này, nitrat không
tham gia phản ứng. Khí N2 tạo ra đƣợc đo bằng một trắc đạm rất nhỏ.
Các phản ứng xảy ra nhƣ sau:
2KNO2 + CO(NH2) + 2HCl 2N2 + CO2 + 3H2O + 2KCl
KNO2 + HSO3 N2 + KHSO4 + H2O
Sau đó, đun nóng dung dịch và tạo mơi trƣờng axit mạnh thì nitrat sẽ phản ứng tạo thành khí N2O:
2KNO3 + CO(NH2)2 + 2HCl 2N2O + CO2 + 3H2O + 2KCl
2KNO3 + HSO3NH2 + HCl N2O+ H2SO4 + H2O + KCl
SVTH: Lê Hoàng Chỉnh 32 2.2.2.6 Phƣơng pháp xác định tổng - 3 NO và - 2 NO Ngƣời ta có thể xác định tổng - 3 NO và - 2
NO trong cùng một mẫu bằng phƣơng pháp khá đơn giản là sử dụng hỗn hợp Cd-Cu.
Nguyên tắc của phƣơng pháp này nhƣ sau:
Ion - 3
NO bị khử thành ion - 2
NO với sự có mặt của Cd. Các hạt Cd đƣợc xử lý với dung dịch CuSO4, sau đó đƣợc nạp vào cột thủy tinh. Phản ứng tiến hành tốt nhất ở pH=6-8. Hiệu suất khử đạt 88-90%.
Ion - 2
NO đƣợc xác định nhờ phản ứng tạo màu azo hóa bằng α-naphtylamin và axit sunfanilic. Phức tạo thành có cƣờng độ màu lớn. Cực đại hấp thụ bƣớc sóng tại 520nm.
Phƣơng pháp này đƣợc dùng để phân tích - 3
NO với nồng độ nhỏ hơn 1ppm mà các phƣơng pháp không đủ nhạy để phát hiện.
2.2.3 Kiểm tra nitrit[1][3][7][8][11]
2.2.3.1 Phƣơng pháp thể tích
Phƣơng pháp này có thể xác định đƣợc nitrit dựa trên cơ sở oxi hóa nitrit thành nitrat khi dùng thuốc thử KMnO4. Điểm cuối của quá trình chuẩn độ đƣợc nhận biết khi xuất hiện màu hồng nhạt của KMnO4 (có thể áp dụng phƣơng pháp chuẩn độ trực tiếp hay chuẩn độ ngƣợc). Phƣơng trình chuẩn độ: 2 - 4 MnO + 5 - 2 NO + 6H+ 2Mn2+ + 5 - 3 NO + 3H2O
Tuy nhiên, trong môi trƣờng axit ion - 2
NO bị phân hủy thành NO và NO2 theo phƣơng trình phản ứng:
- 2
SVTH: Lê Hoàng Chỉnh 33 Do đó cần đảo ngƣợc thứ tự phản ứng (nhỏ từ từ dung dịch - 2 NO vào dung dịch - 4
MnO trong mơi trƣờng axit ). Phƣơng pháp này có độ nhạy khơng cao và tính chọn lựa kém vì trong dung dịch có nhiều ion có khả năng bị -
4
MnO oxi hóa.
Ví dụ: Nếu chuẩn độ chậm dung dịch nitrit đã đƣợc axit hóa bằng dung dịch KMnO4 thì sẽ thu đƣợc kết quả thấp do axit nitrơ khơng bền dễ bay hơi. Ngồi ra, oxi trong khơng khí cũng oxi hóa nitrit thành nitrat. Do đó, nên thêm chính xác dung dịch nitrit từ buret vào dung dịch KMnO4 đã đƣợc axit hóa cho đến khi mất màu dung dịch. Nhƣng ion -
2
NO
phản ứng chậm với - 4
MnO , do đó có thể xảy ra sự phân hủy - 2
NO trƣớc khi phản ứng với -
4
MnO .
2.2.3.2 Phƣơng pháp phân tích khối lƣợng
Nitrit có thể tạo thành muối khó tan với 2,4-diamino 6-oxypyridin là muối có tên sau: 2,4-diamino 5-nitrozo 6-oxypyrindin. Sấy khô muối ở nhiệt độ 120 - 140oC rồi xác định trọng lƣợng của muối. Phƣơng pháp này ít đƣợc nghiên cứu vì thời gian phân tích qua dài, khơng thích hợp khi cần phân tích nhanh. Ngồi ra, ngƣời ta còn xác định nitrit bằng phƣơng pháp gián tiếp dựa trên phản ứng:
3HNO2 + AgBrO3 AgBr + 3HNO3
Lọc lấy kết tủa AgBr, đem rửa bằng dung dịch H2SO4 (1:4) và sấy ở 85-90oC rồi đem cân. Từ trọng lƣợng AgBr kết tủa ta tính đƣợc -
2
NO có trong dung dịch. Phƣơng pháp này chỉ áp dụng với những mẫu chứa lƣợng lớn -
2
NO .
2.2.3.3 Phƣơng pháp phân tích cực phổ
Nitrit là anion có hoạt tính cực phổ. Khi xác định nitrit bằng phƣơng pháp cực phổ dùng nền LaCl3 và BaCl2 thì nitrit cho sóng cực phổ ở 1,2 V so với anot thủy ngân.
Nếu dùng nền là hỗn hợp đệm xitrat 2 M có pH = 2,5 thì giới hạn phát hiện là 0,225 ppm -
2
SVTH: Lê Hoàng Chỉnh 34
Nều dùng nền là hỗn hợp KCl 0,2 M + SCN 0,04 M + 2
Co 2.10-4 M ở pH = 1 – 2 thì sẽ có một pic cực phổ xung quanh vi phân rất rõ khi có mặt ion -
2
NO . Pic xuất hiện ở thế - 0,5 V (so với điện cực calomen bão hòa) và chiều cao pic tỉ lệ với nồng độ của ion -
2
NO .
Có thể xác định - 2
NO bằng cách chuyển nó thành diphenyl nitrosamin. Phản ứng đƣợc tiến hành trong môi trƣờng axit.
Khi xác định - 2
NO ngƣời ta thêm 5 ml dung dịch nền ( gồm 4,86 g KSCN và 17,2 ml HClO4 70% phần trăm trong 1 lít nƣớc cất), 1,25 ml diphenylamin ( hòa tan 0,44 g điphenylamin trong 400 ml rƣợu metylic thành một lít) và 20 ml mẫu. Điều chỉnh pH từ 1-2 bằng axit HClO4 nếu cần. Đuổi khơng khí bằng dịng khí nitơ, sau đó ghi phổ xung vi phân từ -0,2 đến -0,8 V. Thế đỉnh pic xuất hiện ở -0,52 V.
2.2.3.4 Phƣơng pháp sắc kí
Ion nitrit đƣợc phân tích bằng phƣơng pháp sắc kí lỏng cao áp với pha động là axit p-hydrobenroic 8 mM và Bis –Tris 3,2 mM. Hàm lƣợng nitrit có thể xác định đƣợc đến 10e-8M.
Ion nitrit cũng có thể xác định đƣợc cùng với các ion khác bằng phƣơng pháp sắc kí ion. Tuy nhiên giới hạn phƣơng pháp này là chỉ xác định đƣợc 0,1 mg -
2
NO /lít . Mẫu đƣợc bơm vào cột tách bằng van bơm mẫu, nhờ pha động thích hợp để qua cột tách. Tại đây các cấu tử trong hỗn hợp đƣợc tách khỏi nhau và xác định nhờ bộ detector thích hợp.
2.2.3.5 Phƣơng pháp phân tích dịng chảy
Trong mơi trƣờng axit yếu, ion - 2
NO phản ứng định lƣợng với thuốc thử sunfanylamit và 1-naphtyletylen diamin tao ra hợp chất màu azo hấp thụ quang tại bƣớc sóng 540 nm. Nếu bơm mẫu vào hệ FIA có dịng chất mang chứa thuốc thử nói trên thì có thể xác định đƣợc nồng độ của -
2
NO trong mẫu nhờ detector hấp thụ quang UV-VIS tại bƣớc sóng 540 nm.
SVTH: Lê Hoàng Chỉnh 35
2.2.3.6 Phƣơng pháp trắc quang
Nitrit xác định bằng phƣơng pháp trắc quang dựa trên cơ sở hình thành hợp chất màu azo. Nitrit phản ứng với amin thơm bậc một trong môi trƣờng axit tạo thành muối diazo ở giai đoạn trung gian, muối này khi tác dụng với hợp chất amin hay hydroxyl tạo thành hợp chất azo tƣơng ứng, thích hợp cho phƣơng pháp trắc quang.
Có các phƣơng pháp sau:
o Phƣơng pháp lên màu với axit sunfanilic và α-naphtylamin.
o Phƣơng pháp lên màu với axit sunfanilic và phenol.
a. Phƣơng pháp lên màu với axit sunfanilic và α-naphtylamin
Nguyên lý: Ở môi trƣờng axit, nitrit kết hợp với axit sunfanilic cho axit sunfanilic diazonium. Chất này kết hợp với α-naphtylamin thành axit α-naphtylamin azobenzen sunfonic màu đỏ. Phản ứng liên tiếp nhƣ sau:
b. Phƣơng pháp lên màu với axit sunfanilic và phenol:
Nguyên lý: Ở môi trƣờng axit, - 2
NO đƣợc giải phóng từ nitrit đƣợc diazo hóa axit sunfanilic. Chất diazo hình thành kết hợp với phenol, ở môi trƣờng có NH3, thành một phức chất có màu. So sánh với thang màu từ Co(NO3)2 + K2Cr2O7.
c. Phƣơng pháp hiện nhanh nitrit.
NaNO2 + HCOOCH3 NaCOOCH3 + HNO2
1.
2. HNO2 + HO3S NH2 HO3S N=NOH + H2O
axit sunfanilic axit sunfanilic diazonium
N=NOH
HO3S + NH2 HO3S N=N NH2
3.
-naphtylamin axit -naphtylamin azobenzen sunfonic
SVTH: Lê Hoàng Chỉnh 36
Nguyên lý: Do yêu cầu chỉ cần xác định (phát hiện) định tính nitrit có trong sản phẩm là có hay khơng, nên có thể áp dụng phƣơng pháp thử nitrit trong nƣớc uống theo Codex medicamentarius gallicus. Phƣơng pháp này giống hệt phƣơng pháp xác định nitrit trong TCVN-2658-1978, cũng dùng thuốc thử Griess nhƣng bỏ qua giai đoạn so màu bằng thang màu mà chỉ cần quan sát sự xuất hiện màu hồng có hay khơng sau khi cho thuốc thử vào sản phẩm, với mục đích chỉ để phát hiện định tính sự có mặt của nitrit mà thơi.
o Nguyên lý của phương pháp:
Ở pH = 2 đến pH = 2,5 nitrit sẽ diazo hóa axit sunfanilic và sau đó kết hợp với α–naphtylamin cho hợp chất naphtyamino azobenzen sulfonic có màu đỏ khơng bền (bền
ở 15o