2.2.4.1. Đặc điểm hình thái
Quan sát màu sắc của hệ sợi khí sinh
Dựa theo tài liệu của ISP, Gause và cộng sự (1983), xác định màu sắc của HSKS dựa vào bảng màu của Tresner và Bakus. Căn cứ vào màu sắc HSKS của các chủng mới phân lập để phân thành các nhóm màu theo Gause và cộng sự: White (W) nhóm trắng, Gray (Gy) nhóm xám, Red (R) nhóm đỏ, Yellow (Y) nhóm vàng, Green (Gn) nhóm xanh...
Quan sát màu sắc của hệ sợi cơ chất
Màu sắc của HSCC được xác định qua quan sát trực tiếp trên môi trường thạch đĩa hoặc thạch nghiêng và mô tả theo thang màu chuẩn của Bondarsev (1953), Tresner và cộng sự (1961).
Quan sát cuống sinh bào tử
Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường Gause - I có găm lamen nghiêng 450 trên bề mặt môi trường. Sau 7 - 9 ngày nuôi ở nhiệt độ phòng lấy ra quan sát hình dạng chuỗi sinh bào tử trên lamen dưới kính hiển vi quang học. Chuỗi sinh bào tử có các dạng thẳng hay hơi lượn sóng ký hiệu là RF (Rectiflexibiles), hình móc câu hay hình xoắn không hoàn toàn ký hiệu là RA (Retinaculiaperti) và xoắn hoàn toàn ký hiệu là S (Spirales) [33], [35], [41]. Quan sát bề mặt bào tử
Dùng màng cacbon đặt trực tiếp lên bề mặt khuẩn ty khí sinh có bào tử, sau đó quan sát và chụp ảnh dưới kính hiển vi điện tử quét. Bào tử có các hình dạng: tròn, ovan, elíp, hình que [33].
Bề mặt bào tử xạ khuẩn có các dạng: Nhẵn ký hiệu là Sm (Smooth), dạng mụn cóc ký hiệu là Wa (Warty), dạng gai ký hiệu là Sp (Spiny) và dạng tóc ký hiệu là Ha (Hairy).
-31-
2.2.4.2. Đặc điểm nuôi cấy
Màu sắc khuẩn ty khí sinh, khuẩn ty cơ chất và sắc tố tan
Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường: Gause - I, Gause - II, ISP - 1, ISP - 2, ISP - 3, ISP - 4, ISP - 5, ISP - 6, ISP - 7 ở nhiệt độ phòng. Sau 7, 14, 21 ngày lấy ra quan sát màu sắc KTKS, KTCC và sắc tố tiết ra môi trường [33], [37].
Sự hình thành sắc tố melanin
Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường ISP - 6 ở nhiệt độ phòng. Bắt đầu quan sát màu của môi trường sau 24 giờ cho đến ngày thứ 14. Nếu sinh melanin, màu của môi trường sẽ chuyển từ màu vàng nhạt sang màu nâu đậm cho đến màu đen [33].
2.2.4.3. Đặc điểm sinh lý - sinh hóa
Khả năng sinh enzym ngoại bào
- Chiết dịch enzym
Thu enzym từ môi trường lỏng: xạ khuẩn sau khi được nuôi trên môi trường Gause II dịch thể sẽ được lọc bỏ sinh khối hoặc ly tâm ở 5000 vòng/ phút trong 15 phút, chiết dịch trong thì thu được enzym thô.
- Xác định hoạt tính các enzym ngoại bào bằng phương pháp khuếch tán trên thạch với một trong các nguồn cơ chất sau:
- Tinh bột tan (xác định hoạt tính amylaza) - Cazein (xác định hoạt tính proteaza) - CMC (xác định hoạt tính endoglucanaza).
Chuẩn bị môi trường cơ chất - thạch gồm: 20g thạch + 2 - 10g cơ chất, pha môi trường trong 1000 ml nước. Thanh trùng ở 1 atm trong 30 phút. Đổ môi trường vào các đĩa Petri sao cho bề dày lớp thạch khoảng 3 mm. Dùng khoan nút chai đục lỗ (d = 10 mm) trên lớp thạch cách nhau 40 mm. Nhỏ 0,2 ml dung dịch enzym cần thử và 0,2 ml nước làm đối chứng, để ở tủ lạnh 40C
-32-
Hoạt tính enzym được xác định bằng giá trị D - d (mm). Sau khi nhuộm màu đỏ Công gô (cơ chất CMC), axit tricloaxetic (cơ chất casein) và thuốc thử Lugol (cơ chất tinh bột). Vùng cơ chất bị phân giải không bắt màu ở xung quanh lỗ thạch.
Khả năng chịu muối
Cấy xạ khuẩn trên môi trường thạch nghiêng ISP - 1 có bổ sung thêm NaCl với các nồng độ 0,5; 3; 7; 9; 11; 12 (%). Sau 7 - 10 ngày lấy ra quan sát sự sinh trưởng.
Khảnăng sử dụng các nguồn cacbon
Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường ISP - 9 có bổ sung 1% các nguồn đường: Glucoza, maltoza, fructoza, lactoza, sacaroza....
Cách làm: Cân 1g đường, thanh trùng bằng đèn UV rồi bổ sung vào 100ml môi trường ISP - 9 còn nóng. Lắc cho tan đường rồi đổ vào đĩa Petri và nuôi cấy xạ khuẩn ở nhiệt độ 28 -300C, sau 14 ngày quan sát sự sinh trưởng của các chủng và so sánh với đối chứng [33].
Trong đó môi trường có glucoza được coi là đối chứng dương (+) và môi trường không có đường được coi là đối chứng âm (-).
- Nếu xạ khuẩn sinh trưởng mạnh bằng hoặc kém hơn đối chứng dương một ít: có khả năng sử dụng loại đường đó. ký hiệu là (+).
- Nếu xạ khuẩn sinh trưởng mạnh hơn đối chứng dương, ký hiệu là (++). - Nếu xạ khuẩn sinh trưởng bằng đối chứng âm hoặc không mọc: không có khả năng sử dụng loại đường đó, ký hiệu là (-).
- Nếu xạ khuẩn sinh trưởng tốt hơn đối chứng âm một ít nhưng kém hơn đối chứng dương nhiều, ký hiệu là (±).
2.2.5. Lên men tạo kháng sinh
2.2.5.1. Lựa chọn môi trường lên men thích hợp
-33-
A - 4, A - 4H, A - 9, ISP - 4, Gause - I và Gause - II. Sau 96 giờ nuôi cấy trên máy lắc 220 vòng/ phút ở nhiệt độ phòng. Xác định HTKS trong dịch lên men (phương pháp đục lỗ) và sinh khối (phương pháp khoanh giấy lọc) để chọn ra môi trường cơ bản phù hợp cho những nghiên cứu tiếp theo [34].
2.2.5.2. Ảnh hưởng của nguồn cacbon
Bổ sung nguồn cacbon (%): Tinh bột tan 1 và 2; glucoza - 1,5; lactoza - 1,5; sacaroza - 1,5; rỉ đường - 1,5; vào hỗn hợp dung dịch muối (dung dịch muối A) đã bổ sung 0,2 % (NH4)2SO4.
Bổ sung giống và lên men trên máy lắc tròn với tốc độ 220 vòng/ phút. Sau 96 giờ lên men xác định HTKS trong dịch lên men bằng phương pháp đục lỗ thạch.
2.2.5.3. Ảnh hưởng của nguồn Nitơ
Bổ sung nguồn Nitơ (%): Cao nấm men, bột đậu tương, (NH4)2SO4 và KNO3 vào hỗn hợp dung dịch muối đã bổ sung thêm 1,5% glucoza. Sau đó bổ sung giống rồi lên men và thử HTKS bằng phương pháp đục lỗ.
2.2.6. Các phƣơng pháp sinh học phân tử trong phân lập gen 16S - rRNA 2.2.6.1. Tách chiết DNA của xạ khuẩn bằng đệm CTAB 2.2.6.1. Tách chiết DNA của xạ khuẩn bằng đệm CTAB
Nguyên tắc:
Phá vỡ thành tế bào của xạ khuẩn nhờ lyzozym. Loại bỏ protein khỏi DNA nhờ các enzym protease K. Phân tách các thành phần của tế bào sau khi phá vỡ thành hai pha nhờ dung dịch đệm chlorofom: isoamyl alcohol (24:1): pha trên chứa cặn tế bào, pha dưới chứa axit nucleic. Sau cùng, DNA được tủa bằng ethanol tuyệt đối (đã được làm lạnh - 22), được làm khô và hòa tan trong đệm TE [39].
Tiến hành:
-34-
Hòa tan cặn tế bào trong 0,8 ml TE 25S, lắc đều bằng vontex. Bổ sung 40 µl lysozym, ủ ở 370C trong 90 phút (nồng độ cuối cùng của lysozym là 2mg/ ml).
Bổ sung 10 µl protease K, mix đều, thêm 60 µl 10% SDS, đảo nhẹ, ủ 1giờ ở nhiệt độ 550C (nồng độ cuối cùng của protease K là 0,18mg/ml, SDS là 0,5%).
Bổ sung 150 µl NaCl 5M, mix đều. Sau đó bổ sung 130 µl CTAB, mix đều, ủ 10 phút ở 550
C.
Đặt ở nhiệt độ phòng 5 phút, chia đều ra 2 ống eppendorf mới. Sau đó bổ sung vào mỗi ống 700 µl chlorofom/ isoamyl alcohol, mix đều 15 phút. Ly tâm 9000 vòng/phút trong 20 phút để tách pha.
Chuyển dịch pha trên sang các eppendorf mới và bổ sung 0,6V isopropanol, đảo nhẹ. Đặt trong tủ - 200C trong 30 - 40 phút. Ly tâm 9000 vòng/phút, rửa tủa bằng etanol 70%. Hòa tan DNA trong 100 µl TE.
2.2.6.2. Khuếch đại gen rRNA - 16S bằng phản ứng PCR Nguyên tắc:
PCR là phản ứng trùng hợp, cho phép khuếch đại một đoạn DNA cụ thể lên hàng triệu lần nhờ sự xúc tác của DNA polymerase chịu nhiệt. Enzym này có khả năng hoạt động ở nhiệt độ cao. Sự hoạt động của enzym được kiểm soát của một chu kỳ nhiệt xác định. Đoạn DNA được tổng hợp được giới hạn về mặt kích thước bởi một cặp mồi đặc hiệu.
Cặp mồi được sử dụng trong nghiên cứu có trình tự là:
Trình tự mồi: Mồi xuôi 27 5' - agagtttgatcctggctcag - 3' 27- 47 Mồi ngược 1525 5'
- aaaggaggtgatccagcc - 3' 1525 -1507
-35- Thành phần phản ứng Chu kỳ nhiệt H2O 17,1µl Buffer (10X) 2,5µl dNTP (2,5mM) 2µl Primer 1 (10pml) 1µl Primer 2 (10pml) 1µl ADN khuôn 1µl Enzyme Taq 0,4µl 940C 3 phút 940C 1 phút 640C 1 phút 720C 1 phút 30 giây 40C ∞ Tổng 25µl
2.2.5.3. Phương pháp điện di trên gel agarose
Phương pháp điện di trên gel agrose được sử dụng để kiểm tra DNA plasmid, kiểm tra các phân đoạn DNA được nhân bằng kỹ thuật PCR và kiểm tra kết quả cắt giới hạn. Phương pháp này được chia làm một số bước như sau:
- Chuẩn bị gel agarose: cân một lượng agarose tương ứng (tùy theo nồng độ gel yêu cầu) vào trong dung dịch 100ml TAE 1X. Đun sôi bằng lò vi sóng, để nguội xuống khoảng 500C rồi đổ dung dịch vào bản gel đã cài sẵn lược. Sau khoảng 30 phút, đặt bản gel vào bể điện di và đổ dung dịch điện di TAE ngập bản gel.
- Tra mẫu: lấy 1 - 2 g DNA pha loãng trong 16 l đệm TE, sau đó bổ sung 4 l dye mầu. Một lượng DNA maker tương ứng cũng được tra vào bản gel trước khi điện di.
-Điện di: Điện di tại hiệu điện thế không đổi 100V trong khoảng 20 - 30 phút. Quan sát sự di động của DNA từ cực âm sang cực dương thông qua dye mầu.
-36-
- Nhuộm bản gel: Bản gel sau điện di được ngâm vào dung dịch thuốc nhuộm EtBr nồng độ 2 g/ml trong khoảng 10 phút, lắc nhẹ trên máy lắc, sau đó soi gel trên đèn UV và chụp ảnh bằng máy chụp gel của hãng Bio - Rad.
2.2.7. Phương pháp xử lý số liệu
Kết quả nghiên cứu được chúng tôi xử lý theo phương pháp thống kê sinh học trên phần mềm Excel.
-37-
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập và thuần khiết các chủng nấm gây bệnh trên chè
Từ các mẫu chè bị bệnh thu thập ở các khu vực khác nhau của tỉnh Thái Nguyên, chúng tôi đã phân lập và thuần khiết được 3 chủng nấm được ký hiệu là CT - 1A, CT - 2E và CT - 5X.
Các chủng nấm phân lập được đều có đặc điểm chung là: các sợi nấm đều không có màu sắc, sợi nấm có vách ngăn (hình 3.1). Mỗi chủng nấm được phân lập từ một mẫu chè có biểu hiện bệnh khác nhau. Kết quả được trình bày trên bảng 3.1.
Bảng 3.1. Đặc điểm một số mẫu chè làm nguồn phân lập các chủng nấm Ký hiệu chủng nấm Nguồn phân lập Biểu hiện bệnh CT - 1A Lá chè non Trên bề mặt lá và mép lá có nhiều đốm nâu CT - 2E Lá chè non
Vết bệnh có màu nâu sẫm, lúc đầu chỉ có chấm nhỏ màu đen, sau đó lan ra khắp lá.
CT - 5X Lá chè non Các lá bị xoăn, trên mặt lá có thể bị
nhăn.
Sau khi được tinh sạch, 3 chủng nấm trên được giữ trong ống thạch nghiêng trên môi trường Czapek và được sử dụng làm VSV kiểm định để tuyển chọn xạ khuẩn sau này.
-38-
Chủng CT - 1A Chủng CT - 2E
Chủng CT - 5X
Hình 3.1. Ba chủng nấm phân lập từ các mẫu chè bị bệnh 3.2. Phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn
3.2.1. Hoạt tính kháng nấm của các chủng xạ khuẩn
Từ các mẫu đất lấy ở độ sâu 5 - 10 cm tại các địa điểm khác nhau thuộc tỉnh Thái Nguyên, chúng tôi đã phân lập và thuần khiết được 80 chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces. Sau khi thử HTKS theo phương pháp khuếch tán trên thạch với 3 chủng nấm CT - 1A, CT - 2E, CT - 5X, chúng tôi đã tuyển chọn sơ bộ được 30 chủng trong tổng số 80 chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm ở các mức độ khác nhau, chiếm tỷ lệ 37,5%. So sánh với tỷ lệ chủng xạ khuẩn kháng nấm gây bệnh đạo ôn đã công bố trước đây cùa Lê Gia Hy và cộng sự [18], tỷ lệ chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm gây bệnh trên chè của chúng tôi có phần cao hơn.
-39-
Bảng 3.2. Xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm theo nhóm màu Nhóm màu xạ khuẩn Các chủng có HTKN Tỷ lệ chủng có HTKN so với tổng số (%) Số lượng Tỷ lệ(%) Trắng (Allbus) 11 36,7 13,7 Xám (Griseus) 8 26,7 10,0 Xanh (Azeureus) 7 23,3 8,6 Hồng (Roseus) 2 6,7 2,6 Nâu (Chromogenes) 1 3,3 1,3 Lục (Viridis) 1 3,3 1,3 Tổng cộng 30 100 37,5
Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm phân chia theo nhóm màu của Shirling và Gottlieb [37]. Kết quả được thể hiện trên bảng 3.2 và hình 3.2.
-40-
Kết quả trên bảng 3.2 cho thấy: số lượng chủng có hoạt tính nhiều nhất là nhóm trắng chiếm 36,7%, sau đó là nhóm xám - 26,7%, nhóm xanh - 25,3%, nhóm hồng - 6,7% và ít nhất là các nhóm nâu và lục đều chiếm 3,3%. Kết quả này của chúng tôi cũng phù hợp với những nghiên cứu của một số tác giả trước đây [14],[18].
Đồng thời chúng tôi cũng nhận thấy khả năng đối kháng của các chủng xạ khuẩn với 3 chủng nấm gây bệnh trên chè có sự khác nhau (bảng 3.3).
Bảng 3. 3. Tính đối kháng của xạ khuẩn với 3 chủng nấm gây bệnh trên chè Chủng XK có HTKN 3 chủng nấm gây bệnh chè CT - 1A CT - 2E CT - 5X Kháng cả 3 chủng Số lượng 9 16 13 4 Tỷ lệ (%) 30 53 43 13,3 Trong tổng số 30 chủng có hoạt tính kháng nấm, số chủng kháng nấm CT - 2E là cao nhất, có 16 chủng (chiếm 53% ), tiếp theo là số chủng kháng nấm CT - 5X, có 13 chủng (chiếm 43%) và ít nhất là chủng kháng nấm CT - 1A có 9 chủng (chiếm 30%).
-41-
Đáng chú ý trong số đó, có 4 chủng có khả năng kháng được cả 3 chủng nấm, chiếm tỷ lệ 13,3%, các chủng còn lại phần lớn chỉ kháng được 1 đến 2 chủng nấm. Tỷ lệ các chủng kháng nấm được thể hiện trên hình 3.3.
3.2.2. Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có HTKN cao
Sau khi đã tuyển chọn sơ bộ được 30 chủng có hoạt tính kháng nấm, chúng tôi đã chọn ra 2 chủng có hoạt tính kháng nấm mạnh nhất được ký hiệu là: Đ1 và R2. Ở bước này, các chủng được nuôi lắc trong môi trường dịch thể ISP - 4 để thu dịch nuôi cấy. Kết quả kiểm tra hoạt tính của dịch nuôi cấy theo phương pháp đục lỗ với các chủng nấm như trên được thể hiện trên bảng 3.4 và hình 3.4.
Bảng 3. 4. Hoạt tính kháng nấm của 3 chủng xạ khuẩn Chủng xạ khuẩn Hoạt tính kháng nấm (D- d, mm) CT - 1A CT - 2E CT - 5X Đ1 12 14 15 R2 12 16 17
Kết quả trên bảng 3.4 cho thấy: mặc dù cả 2 chủng xạ khuẩn lựa chọn đều vẫn giữ được hoạt tính kháng nấm, song mức độ kháng đối với các chủng nấm có sự khác nhau. Khả năng kháng nấm CT - 1A của cả 2 chủng xạ khuẩn đều yếu nhất và khả năng kháng chủng CT - 5X của 2 chủng xạ khuẩn là cao nhất.
Chúng tôi tiếp tục tiến hành nghiên cứu các đặc điểm sinh học và phân loại của 2 chủng xạ khuẩn Đ1 và R2. Hai chủng xạ khuẩn này thuộc hai nhóm màu khác nhau. Chủng Đ1 thuộc nhóm màu trắng và chủng R2 thuộc nhóm màu nâu.
-42-
VSV kiểm định: CT - 5X VSV kiểm định: CT - 2E
Hình 3.4. Hoạt tính kháng nấm của 2 chủng xạ khuẩn lựa chọn 3.3. Đặc điểm sinh học và đặc điểm phân loại của 2 chủng XK Đ1 và R2
3.3.1. Đặc điểm hình thái
Chủng R2 có cuống sinh bào tử dạng xoắn, bề mặt bào tử có dạng gai.