Sambrook, Russell [47].
Bƣớc 1: Thu sinh khối tế bào bằng cách lấy dịch nuôi cấy chuyển vào
ống li tâm rồi li tâm với vận tốc 6.000 vòng/phút ở 4o
C trong 10 phút.
Bƣớc 2: Hòa tan mẫu trong 400 µl đệm lysis rồi lắc kỹ cho tan tủa. Bƣớc 3: Bổ sung 50 µl lysozym và ủ ở 37o
C trong 30 phút.
Bƣớc 4: Bổ sung 20 µl protease K rồi ủ ở 56o
Bƣớc 5: Bổ sung phenol (tỷ lệ 1:1 v/v), lắc đều và ly tâm 12.000
vòng/phút trong 15 phút ở 4o C.
Bƣớc 6: Hút pha trên chuyển sang eppendorf mới, bổ sung CI (24:1)
với tỷ lệ 1:1 v/v, lắc nhẹ sau đó ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4o C.
Bƣớc 7: Hút pha trên chuyển sang eppendorf mới và tủa DNA bằng
cồn tuyệt đối, giữ ở -20oC trong khoảng 2-3 giờ.
Bƣớc 8: Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4o
C, thu tủa DNA.
Bƣớc 9: Rửa tủa bằng cồn 70 %, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4o C
Bƣớc 10: Làm khô tủa và hòa tan tủa trong nước khử ion vô trùng
2.4.4.2. Nhân đoạn gen bằng phương pháp PCR
Phương pháp PCR do Kary Mullis và cộng sự phát minh năm 1985. Phương pháp này tạo ra bước nhảy vọt trong kỹ thuật sinh học phân tử và được sử dụng phổ biến đến nay. Phương pháp này cho phép nhân lên số lượng lớn đoạn gen cần thiết trong thời gian ngắn.
Để thực hiện được phản ứng PCR cần có các nguyên liệu chính là đoạn DNA khuôn, cặp mồi đặc hiệu, enzyme DNA polymerase, các nucleotide tự do, máy PCR v.v. * Thành phần phản ứng: Buffer Taq 10X 2,5 µl MgCl2 25 mM 3,0 µl dNTPs 2,5 mM 2.5 µl Mồi xuôi 20 µM 1 µl Mồi ngược 20 µM 1 µl
Taq DNA polymerase (5 U/µl) 0,2 µl
H2O 13,3 µl
DNA khuôn 1,5 µl
Đối với nhân đoạn gen mã hóa 16S rRNA sử dụng cặp mồi 27F và 1492R thì chu trình nhiệt cho phản ứng PCR như sau:
Bƣớc 1 95oC trong 5 phút
Bƣớc 2 94oC trong 1 phút
Bƣớc 3 55oC trong 1 phút
Bƣớc 4 72o
C trong 2 phút
Bƣớc 5 Lặp lại 35 chu kỳ từ bước 2 đến bước 4
Bƣớc 6 72oC trong 7 phút
Bƣớc 7 4o
C bảo quản mẫu
Trong trường hợp nhân đoạn gen mã hóa catechol 2,3-dioxygenase sử dụng cặp mồi C23OF và C23OR với chu trình nhiệt dưới đây:
Bƣớc 1 94oC trong 7 phút
Bƣớc 2 94oC trong 1 phút
Bƣớc 3 55oC trong 1 phút
Bƣớc 4 72o
C trong 1 phút
Bƣớc 5 Lặp lại 35 chu kỳ từ bước 2 đến bước 4
Bƣớc 6 72oC trong 10 phút
Bƣớc 7 4o
C bảo quản mẫu
2.4.4.3. Quy trình biến nạp và chọn dòng
Biến nạp: bộ Kit TA Cloning(R) của hãng InvitrogenTM
(Mỹ) đã được sử dụng cho quá trình biến nạp.
Nguyên tắc: Đoạn DNA cần thiết nhân lên trong phản ứng PCR được sử dụng để gắn vào vector PCR 2.1 tạo thành vector mang đoạn gen 16S rRNA.
* Thành phần phản ứng:
Dung dịch đệm 1,0 µl
Vector pCR2.1 1,5 µl
Sản phẩm PCR (đoạn DNA cần thiết) 1,2 µl
Enzyme T4 ligase 1,0 µl
Nước 5,3 µl
Tổng thể tích 10 µl
Phản ứng gắn đoạn DNA cần thiết vào vector được thực hiện trong điều kiện nhiệt độ 14o
C, thời gian 18 giờ. Sau đó sản phẩm này được biến nạp vào tế bào khả biến (vi khuẩn E. coli INV F’).
* Quy trình biến nạp:
Bƣớc 1: Lấy 4 µl vector tái tổ hợp ở trên cho vào ống đựng tế bào khả
biến E. coli INV F’ rồi ủ trên đá 30 phút.
Bƣớc 2: Sốc nhiệt 42oC trong thời gian 45 giây.
Bƣớc 3: Đặt ống tế bào lên đá trong 2 phút.
Bƣớc 4: Thêm 250 µl SOC vào ống đựng tế bào rồi đem nuôi ở tủ lắc
37oC trong khoảng 1 giờ.
Bƣớc 5: Hút dịch nuôi gạt trên đĩa môi trường LB có bổ sung 50 mg/l
ampicilin, và 50 mg/ml X-Gal. Sau đó nuôi ở 37oC trong khoảng 16-18 giờ. Chọn các dòng khuẩn lạc màu trắng và một dòng khuẩn lạc màu xanh nuôi trên môi trường LB dịch. Trên môi trường LB có X-gal những khuẩn lạc màu trắng là những cá thể có thể mang DNA plasmid đã gắn đoạn DNA ngoại lai, những khuẩn lạc màu xanh là những cá thể không đính đoạn DNA plasmid và DNA ngoại lai.
* Quy trình tách chiết DNA plasmid:
Bƣớc 1: Thu sinh khối tế bào bằng cách ly tâm dịch nuôi 6.000
Bƣớc 2: Bổ sung 100 µl Sol I rồi vontex kỹ cho tan hết tủa. Bƣớc 3: Thêm 200 µl Sol II và đảo nhẹ, ủ đá khoảng 5 phút. Bƣớc 4: Bổ sung 150 µl Sol III, đảo đều rồi ủ đá 10 phút.
Bƣớc 5: Bổ sung C:I theo tỷ lệ 1:1 v/v, lắc đều rồi ly tâm 12.000
vòng/phút trong 10 phút.
Bƣớc 6: Hút pha trên chuyển sang ống mới và thêm 500 µl isopropanol
100 % tủa DNA, để khoảng 2-3 giờ.
Bƣớc 7: Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút.để thu tủa.
Bƣớc 8: Rửa tủa bằng cồn 70 %, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10
phút.
Bƣớc 10: Làm khô tủa bằng cách ly tâm khô, sau đó tủa được hòa tan
trong nước khử ion.
* Phản ứng cắt vector tái tổ hợp bằng enzym e EcoRI:
*Thành phần phản ứng:
Đệm EcoRI 10X 2,0 µl
Enzyme cắt EcoRI (5 U/µl) 0,2 µl
RNase (1 mg/ml) 0,5 µl
H2O 15,3 µl
DNA plasmid 2,0 µl
Tổng thể tích 20 µl
Trộn đều các thành phần phản ứng với nhau rồi đặt ống phản ứng vào bể ổn nhiệt ở 37o
C trong 16 giờ.
2.4.4.4. Phương pháp xác định trình tự gen bằng máy tự động
Xác định trình tự hai đoạn gen mã hóa 16S rRNA và catechol 2,3- dioxygenase của vi khuẩn BQN31 trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 3.100 Avant Genetic Analyzer tự động theo phương pháp của Sanger. Trình
tự hai đoạn gen 16S rRNA và đoạn gen mã hóa catechol 2,3-dioxygenase của vi khuẩn BQN31 được đăng ký trên GenBank.
2.4.4.5. Phương pháp xây dựng cây phát sinh chủng loại
Sử dụng chương trình Blast so sánh mức độ tương đồng giữa trình tự các đoạn gen mã hóa 16S rRNA, gen mã hóa catechol 2,3-dioxygenase của vi khuẩn BQN31 với các trình tự gen liên quan trên ngân hàng gen. Tiếp theo, sử dụng phần mềm Clustal X, NJ để xây dựng cây phát sinh chủng loại đoạn gen mã hóa 16S rRNA, gen mã hóa catechol 2,3-dioxygenase của vi khuẩn BQN31 và các đoạn gen đại diện.
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng phát triển trên môi trƣờng chứa PAH trƣờng chứa PAH
Từ mẫu ban đầu, vi sinh vật sử dụng PAH được phân lập theo phương pháp làm giàu trên môi trường muối khoáng chứa các nguồn PAH như nguồn cacbon và năng lượng duy nhất. VSV sử dụng PAH trong mẫu nước nhiễm dầu không đa dạng, trên mỗi loại PAH chỉ có từ 1 đến 4 loại khuẩn lạc, trong đó loại vi khuẩn có mầu trắng, trơn, lồi bóng và nhỏ chiếm ưu thế (Bảng 3.1). Khả năng phát triển của vi khuẩn được đánh giá sơ bộ bằng sự thay đổi mầu môi trường.
Bảng 3.1: Số lượng vi khuẩn phân lập được trên môi trường khoáng có bổ sung các hợp chất PAH Môi trường chứa
PAH và hỗn hợp PAH Số lượng vi khuẩn phân lập
Phenanthrene 5
Anthracene 4
Fluorene + Fluoranthene 1
Pyrene + Chrysene 3
Naphthalene 2
Các số liệu trong bảng 3.1 cho thấy, từ mẫu làm giàu vi sinh vật trên hai nguồn phenanthrene và anthracene có số lượng vi khuẩn phân lập được nhiều nhất. Tổng số 15 chủng vi khuẩn có khả năng phát triển tốt trên môi trường chứa các nguồn PAH khác nhau đã được phân lập và được ký hiệu từ BQN20-BQN34. Trong số 15 chủng vi khuẩn này, 4 chủng vi khuẩn BQN30, BQN31, BQN32, BQN33 có khả năng phát triển mạnh hơn cả trên nguồn phenanthrene (Hình 3.1).
Môi trường trong các bình nuôi cấy vi khuẩn và các PAH có mầu vàng nâu. Trong số 15 chủng vi khuẩn, chủng BQN31 phân hủy phenanthrene mạnh nhất, môi trường đổi màu chỉ sau 32 giờ nuôi cấy. Các chủng vi khuẩn còn lại chuyển hóa ở mức độ yếu hơn, sinh khối vi sinh vật ít hơn, môi trường không đổi mầu hoặc đổi màu sau nhiều ngày.
Hình thái khuẩn lạc của 4 chủng vi khuẩn sử dụng phenanthrene mạnh được trình bày tóm tắt ở Bảng 3.2. BQN30 BQN31 BQN32 BQN33 K K K K
Hình 3.1: Khả năng phân hủy phenanthrene của 4 chủng BQN30, BQN31, BQN32, BQN33
Bảng 3.2. Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn
Chủng vi khuẩn Đặc điểm khuẩn lạc trên môi trường muối khoáng chứa phenanthrene
BQN30 Tròn, trơn, trắng trong
BQN31 Tròn, trơn, bóng, lồi, trắng đục, ánh xanh
BQN32 Tròn, trơn, ánh vàng
BQN33 Tròn, trơn, bóng, ánh xanh
Trong số các chủng vi khuẩn kể trên, chủng vi khuẩn BQN31 có khuẩn lạc to, mọc dầy, dịch nuôi cấy chuyển màu nhanh hơn những chủng khác. Do đó, chủng BQN31 đã được chọn để nghiên cứu và xác định khả năng phân hủy PAH.
Sự tồn tại của các vi khuẩn bản địa sử dụng các loại PAH khác nhau cho thấy tiềm năng lớn trong việc áp dụng thành công công nghệ phân hủy sinh học xử lý ô nhiễm dầu và PAH.
3.2. Đặc điểm hình thái và tế bào của chủng vi khuẩn BQN31
Chủng vi khuẩn BQN31 được nuôi cấy trên môi trường muối khoáng bổ sung phenanthrene, nuôi ở nhiệt độ 30o
C. Khuẩn lạc chủng BQN31 sau 3-5 ngày nuôi cấy có hình tròn, trắng, trơn, lồi, bóng, có ánh xanh, kích thước khoảng 1-2 mm (Hình 3.2). Chủng BQN31 thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, tế bào hình que, bề mặt tương đối nhẵn và kích thước khoảng 0,29 - 0,5 m x 0,95 - 1,1 m (Hình 3.3).
Hình 3.2: Hình thái khuẩn lạc chủng vi khuẩn BQN31
Hình 3.3: Hình thái tế bào vi khuẩn BQN31
(Quan sát trên kính hiển vi điện tử quét JEOL 5410 LV với độ phóng đại
15.000 lần)
3.3. Khả năng sử dụng các loại PAH của chủng vi khuẩn BQN31
Trong môi trường tự nhiên, các PAH thường tồn tại ở dạng hỗn hợp và rất độc. Do đó, việc đánh giá khả năng phân hủy PAH bởi các chủng vi sinh vật bản địa có ý nghĩa rất quan trọng trong quá trình làm sạch ô nhiễm dầu nói chung và PAH nói riêng.
Sau 5 ngày nuôi lắc trên môi trường khoáng bổ sung các PAH khác nhau, mầu của môi trường chứa các vi sinh vật thay đổi rõ rệt, môi trường chuyển màu nâu vàng. Đặc biệt, trong các bình nuôi cấy chứa phenanthrene và naphthalene môi trường đục hơn và có nhiều sinh khối hơn (Bảng 3.3).
Bảng 3.3: Phổ UV đo khả năng phân hủy các PAH của chủng BQN31
Nguồn PAH Phổ UV Hình ảnh minh họa
Phenanthrene
Naphthalene
Hiệu quả sử dụng một số loại PAH của chủng BQN31 được trình bày trong bảng 3.4.
ĐC
BQN31
ĐC
Bảng 3.4: Khả năng sử dụng các PAH khác nhau của chủng BQN31 Các PAH Hiệu suất
phân hủy (%) Màu môi trường nuôi cấy Ghi chú
Phenanthrene 60,24 vàng nâu
Fluorene 18,52 vàng nhạt
Fluoranthene vàng chanh không phân tích
Pyrene 18,75 nâu nhạt, ánh vàng
Naphthalen 69,38 màu vàng
Anthracene 25,9 màu nâu
Kết quả ở bảng 3.4 cho thấy, chủng BQN31 sử dụng tất cả các PAH thử nghiệm. Đối với mỗi loại PAH, màu môi trường nuôi cấy có sự thay đổi khác nhau. Dựa trên kết quả phân tích, sau 5 ngày nuôi lắc ở nhiệt độ 30oC và 200 vòng/phút, chủng BQN31 có khả năng sử dụng 69,38% naphthalene, 60,24% phenanthrene, 18,52% fluorene, 25,9% anthracene và 18,75% pyrene với nồng độ ban đầu là 100 ppm mỗi loại PAH. Khả năng phân hủy của chủng BQN31 với naphthalen là cao nhất và fluorene là thấp nhất. Kết quả này chứng tỏ với các PAH ít vòng thì khả năng bị phân hủy sinh học càng mạnh.
Trên thế giới, đã có nhiều công trình nghiên cứu về khả năng phân hủy các loại PAH của các chủng vi sinh vật. Weissenfels và cộng sự (1991) đã công bố chủng Alcaligenes denitrficans WW1 phân hủy fluoranthene với tốc độ 300 mg/l mỗi ngày, đồng thời chủng này sử dụng các loại PAH khác như pyrene, benzo(a)anthracene theo cơ chế đồng trao đổi chất [53]. Chủng
Mycobacterium sp. PYR-1 phân hủy 74% hỗn hợp PAH gồm phenanthrene, anthracene, fluoranthene, pyrene, chrysene và benzo(a)pyrene sau 7 ngày nuôi cấy. Trong đó 95% fluoranthren bị loại bỏ sau 24h nuôi cấy, tuy nhiên nồng độ ban đầu chỉ có 17 mg/l [21]. Hai chủng Cycloclasticus N3 và W của Gelsenbrecht và cộng sự không sử dụng được PAH cao phân tử như fluoranthene, pyrene và chrysene như là nguồn carbon và năng lượng duy
nhất, tuy nhiên theo cơ chế đồng trao đổi chất chủng Cycloclasticus N3 có thể phân huỷ khoảng 50% các PAH cao phân tử trên với nồng độ ban đầu 1ppm khi bổ sung 10ppm phenanthrene sau 7 ngày [12].
Hiện nay, có nhiều công bố kết quả nghiên cứu về khả năng phân hủy fluoranthene và pyrene như là nguồn cacbon và năng lượng duy nhất của các chủng xạ khuẩn thuộc các chi Gordonia, Mycrobacterium [36] . Theo nghiên cứu của Lors và cộng sự về xử lý sinh học mẫu đất nhiễm PAH từ một khu vực công nghiệp ở miền Bắc nước Pháp tại phòng thí nghiệm với 3 loại hỗn hợp cơ chất PAH gồm các PAH có 3 hoặc 4 vòng thơm cùng với 16 loại PAH (theo quy định của UEPA - Hoa Kỳ) cho kết quả loại bỏ lần lượt là 96%, 80% và 80%, sau 245 ngày [19]. Chủng Rhodococcus sp. được phân lập từ mẫu trầm tích có khả năng phân hủy 53% anthracene sau 24h ở nồng độ 3µg/ml [21].
Xue-Jing Zheng và cộng sự đã nghiên cứu khả năng chuyển hoá sinh học của tập đoàn vi sinh vật hiếu khí có trong bùn cống, bổ sung chất hoạt động bề mặt tween 80 cho hiệu quả loại bỏ PAH trên 95% đối với PAH chứa 3 vòng thơm và tăng tốc độ loại bỏ PAH chứa 4 vòng thơm sau 21 ngày [57]. Cũng bổ sung tween 80 (0,5%), Dhenain và cộng sự đã cho thấy khả năng loại bỏ từ 35 – 50% benzo(a)anthracene, benzo(a)pyrene, benzo(b)fluoranthene, benzo(j)fluoranthene, benzo(k)fluoranthene, fluoranthene trong bùn đen của công nghiệp nhôm [13].
Ở Việt Nam, chủng vi khuẩn Sphingomonas yanoikuyae MXL-9 phân lập từ cặn dầu thô mỏ Bạch Hổ có khả năng phân hủy 64,5% phenanthrene và 61,4% anthracene sau 7 ngày nuôi cấy với nồng độ ban đầu là 12mg/l [8]. Hoàng Thị Mỹ Hạnh và cộng sự (2003) đã phân lập và nghiên cứu khả năng sử dụng PAH của chủng nấm Aspergillus sp. FVX5 phân lập từ thí nghiệm xử lý làm sạch cặn dầu thô của tàu Chí Linh. Chủng nấm này có khả năng phân
hủy 266,69 mg/l phenanthrene, 33,34 mg/l anthracene, 19,16 mg/l fluoranthene sau 7 ngày nuôi cấy ở điều kiện 37oC [2]. Sau 7 ngày nuôi lắc trên môi trường khoáng có bổ sung glucose, hai chủng xạ khuẩn XKDN12 và XKDN13 phân lập từ đất nhiễm chất độc hoá học có khả năng sử dụng PAH, 32,72% và 45,05% với phenanthrene, 39,01% và 52,22% với anthracene, 23,32% và 41,41% với fluoranthen [7].
Chủng vi khuẩn Chromobacterium sp. BPQ1 phân lập từ nước thải nhiễm dầu ở công ty xăng dầu B12, Quảng Ninh có thể sử dụng phenanthrene và fluorene [5]. Trong một nghiên cứu khác, chủng vi khuẩn KCP8 phân lập tại Khe Chè có khả năng phân hủy hỗn hợp PAH (phenanthrene, anthracene và fluoranthene). Sau 7 ngày nuôi lắc chủng KCP8 phân hủy 76,12% hỗn hợp PAH, trong đó khả năng phân hủy phenanthrene trong hỗn hợp là 79,96%, anthracene là 71,09% và fluoranthene là 41,01% [4].
So sánh với các kết quả đã công bố trên thế giới và Việt Nam, cho thấy rằng, chủng vi khuẩn BQN31 có khả năng phân hủy trung bình các PAH đã công bố. Tuy nhiên, khả năng sử dụng nhiều loại PAH khác nhau chứng tỏ vai trò nhất định của chủng vi khuẩn này trong nước thải nhiễm dầu ở khu vực Quảng Ninh. Chủng này có thể được sử dụng để xây dựng tập đoàn giống vi sinh vật sử dụng trong quá trình làm sạch ô nhiễm PAH ở các điều kiện có kiểm soát.
3.4. Xác định trình tự đoạn gen mã hóa 16S rRNA của chủng BQN31
3.4.1. Tách chiết DNA tổng số và nhân đoạn gen mã hóa 16S rRNA bằng kỹ thuật PCR
Tách chiết và làm sạch DNA tổng số vi khuẩn là khâu quan trọng vì chất lượng của DNA sẽ ảnh hưởng đến hiệu quả của các thí nghiệm tiếp theo.