2.1. Cấu trúc gene phân đoạn (gene phân mảnh)
Một gene ở Eukaryot có cấu trúc bao gồm đoạn tăng cường (enhancer) đoạn khởi động (promotor), intron và kẽ nhau, cuối cùng là đoạn kết thúc. hoá
Sequences) (IS) xen vào và làm gián đoạn các đoạn mã hoá (Coding Sequences)
được gọi là exon.
Hình 2.1. Cấu trúc gene phân đoạn ở Eukaryot
Những gene có cấu trúc gồm exo được gọi là gene khảm (mosaic gene). Hiện nay, chưa rõ chức năng của intron, tuy nhiên có giả thuyết rằng, intron có vai trị như là các khoảng trống xen giữa các exon tạo thuận lợi cho sự tái tổ hợp giữa các exon.
Thí nghiệm của Pierre Chambon (Pháp) phát hiện cấu trúc của exon - intron của gene ovalbumine gà. Ovalbumine là protein lòng trắng trứng. gồm một chuỗi polipeptit có 386 axit amin (tập hợp trong ống dẫn trứng ở thời kì gà mái đẻ trứng).
Ngoài việc tách mARN của ovalbumine, sử dụng enzyme sao mã ngược tạo ra các bản sao của mARN sợi đơn được gọi là cADN và tạo thành cADN sợi kép. So sánh ADN hệ gene nhân với cADN khi giải trình tự cho phép phát hiện ra intron và exon. Kết quả ovalbumine trứng gà có 7 intron, 8 exon.
2.2. Phương pháp phát hiện các đoạn intron và exon
2.2.1. Phương pháp so sánh trình tự gene và trình tự cADN
Bước 1:
1. Tách chiết ADN hệ gene.
2. Phân lập gene bằng kĩ thuật PCR hay enzyme cắt hạn chế. 3. Tạo dòng ADN tái tổ hợp, nhân dòng và tách dòng gene. 4. Giải trình tự gene.
Bước 2:
1. Tách mARN trong tế bào chất (hàm lượng mARN rất lớn, mARN của ovalbumine chiếm tới 50% ARN trong các tế bào này).
2. Sử dụng enzyme sao mã ngược tổng hợp cARN. 3. Giải trình tự cARN.
Bước 3: So sánh trình tự ADN hệ gene với trình tự cADN xác định được
các đoạn intron và exon.
2.2.2. Phương pháp lai phân tử
và kiểm tra bằng kính hiển vi điện tử.
1. Tách ADN hệ gene và mARN tế bào chất. 2. Phân lập gene.
3. Lai phân tử giữa ADN và mARN sẽ xác định được intron và exon. Vấn đề đặt ra là khi phiên mã tổng hợp mARN thì các đoạn khơng mã hố intron có được sao khơng ? Người ta thấy bản sao của ADN có cả exon và intron
đó chính là tiền mARN (Pre-mARN), cịn gọi là ARN khơng đồng nhất trong
nhân (hn-ARN: heteroge nevusnucliar ARN). Loại hn-ARN chỉ được phát hiện ở sinh vật nhân chuẩn.