3.1. SỰ BIẾN ĐỘNG CÁC THÔNG SỐ TRONG KHOANG ANOT
3.1.1. Sự thay đổi về mật độ tế bào trong khoang Anot
Nghiên cứu sự biến động của các chủng vi khuẩn khác nhau trong khoang anot được thực hiện với hai chủng vi khuẩn là Shewanella putrefacien SP200 và Shewanella sp HN41. Khoang anot này được nói với khoang catot hiếu khí chứa CuCl2 5mM thơng qua điện cực than chì.
Hình 0.3. Sự biến động của mật độ tế bào vi khuẩn Shewanella
Thí nghiệm với các hệ MFC cho thấy mật độ vi khuẩn Shewanella
(chủng SP200 và HN41) trong mơi trường ở khoang anot có sự thay đổi. Mật độ tế bào tăng lên đến gần 0,18 và 0,12 lần lượt đối với các hệ chứa SP200 và HN41 ở ngày thứ 5, sau đó giảm dần sau một tuần thí nghiệm. Mật độ OD tại anot ở thí nghiệm hệ chủng vi khuẩn SP200 trong 2 ngày đầu thí nghiệm khơng thay đổi
nhiều, từ ngày thứ 3 trở đi thì lại biến động tăng lên rõ rệt. Sau 7 ngày thí nghiệm mật độ OD tăng lên thêm khoảng 25% so với ban đầu. Đối với hệ chứa HN41 cũng có sự biến động về mật độ OD nhưng khá nhỏ, từ ngày đầu đến ngày thứ 7 tăng khoảng 16%, điều này co thấy sự phát triển khá ổn định của vi khuẩn. Đối với hệ đối chứng mật độ OD hầu như không thay đổi và xung quanh giá trị ban đầu. Kết thúc thí nghiệm khi tháo bỏ hệ, nhận thấy có lớp màng sinh học hình thành trên vách ngăn ngăn cách khoang anot với mơi trường bên ngồi. Như vậy, vi khuẩn có thể tăng sinh và hình thành lớp màng sinh học trên vách ngăn chứ khơng di chuyển trong mơi trường ni
Theo thí nghiệm khác thì khi thu hạt nano từ dung dịch trong điều kiện yếm khí có sử dụng vi khuẩn Shewanella HN41 cho thấy sự giảm mật độ tế bào OD là do vi khuẩn HN41 có mặt để phản ứng và khử kim loại chứ khơng có phản ứng nào khác xảy ra [35]. Như vậy, trong khoang anot đã có sự sinh trưởng của các tế bào vi khuẩn mặc dù khoang anot không được bổ sung chất nhận điện tử vào môi trường.
3.1.2. Tốc độ tiêu thụ lactate trong khoang anot
Sự biến thiên về nồng độ lactate trong các hệ MFC sau 7 ngày thí nghiệm được trình bày trong hình sau:
Hình 0.4. Sự biến động của hàm lượng lactate trong khoang anot
Có thể thấy rằng nồng độ lactate tại anot đối với 2 hệ MFC có sử dụng chủng vi khuẩn SP200 và HN41 giảm nhanh trong những ngày đầu tiến hành thí nghiệm, và giảm sâu nhất ở ngày thứ 5 do hết cơ chất, sang ngày thứ 7 có bổ sung cơ chất thì lượng cơ chất tăng lên gần bằng giá trị ban đầu. Trong khi đó, nồng độ lactate tại anot trong thí nghiệm đối chứng khơng có vi khuẩn hầu như không biến đổi trong suốt thời gian thí nghiệm, điều này chứng tỏ lactate tại anot đã bị phân hủy yếm khí hồn tồn bởi vi khuẩn. Cũng theo nghiên cứu khác cho thấy pin nhiên liệu vi sinh vật khi sử dụng chủng vi khuẩn
Shewanella trong pin nhiên liệu MFC thì việc giảm nồng độ lactate là do việc
sử dụng và chuyển hóa của vi khuẩn [36].
Lactate là một chất nền quan trọng vừa cung cấp năng lượng cho vi khuẩn vừa là chất cho điện tử trong hệ pin. Tại khoang anot, vi khuẩn
Shewanella đã sử dụng lactate cho q trình hơ hấp kị khí, chuyển điện tử đến
điện cực than chì, dịng điện tử này đã được chuyển ra ngoài khoang điện cực âm. Mật độ tế bào trong môi trường giảm xuống ngay cả khi bổ sung cơ chất vào thời điểm
ngày thứ 5 khi lượng cơ chất giảm xuống gần 0 nhất, khơng có nghĩa là tế bào vi khuẩn khơng sinh trưởng.
Kết thúc thí nghiệm, nhận thấy các tế bào vi khuẩn hình thành biofilm trên bề mặt màng ngăn anot, như vậy vi khuẩn có thể tăng sinh và hình thành lớp màng sinh học trên vách ngăn chứ không di chuyển di chuyển trong mơi trường ni, điều này giải thích vì sao OD tăng ít trong mơi trường mặc dù vẫn được bổ sung cơ chất lactate. Lactat là một chất nền quan trọng vừa cung cấp năng lượng cho vi khuẩn sử dụng vừa là chất cho điện tử trong BES. Tại khoang anot, vi khuẩn Shewanella sp. HN-41 sử dụng lactat cho q trình hơ hấp kị khí. Phản ứng phân hủy lactate xảy ra theo phương trình:
CH3CH2OCOO- + H2O CH3COO- + CO2 + 4e- + 4H+ [37]
Điện tử sinh ra sau đó được vận chuyển trực tiếp từ màng ngồi của vi khuẩn đến điện cực, theo thế chênh lệch oxy hóa khử dẫn ra ngoài để đến catot.
Sự thay đổi pH trong khoang anot cũng được nghiên cứu, q trình oxi hóa lactate trong khoang điện cực âm sản sinh proton H+, điều này giải thích cho sự suy giảm pH trong môi trương anot, pH của môi trường ban đầu trong các khoang anot do sử dụng đệm HEPES dao động trong khoảng 7,7 xuống 7,4 sau 7 ngày thí nghiệm đồng thời sau đó ổn định ở 7,5.
Hình 0.5. Sự biến động của pH trong môi trường khoang anot
Tốc độ giảm pH của hai hệ vi khuẩn cũng tương đối đồng đều, hiện tượng này xuất hiện trong phản ứng phân hủy yếm khí lactate. Ở hệ MFC của chủng SP 200 giảm khoảng 24% trong khi đó pH trong hệ chủng HN41 giảm khoảng 10%, như vậy tại thời điểm ban đầu lactate bị phân hủy và chuyển hóa thành H+ ở hệ SP200 nhiều hơn HN41. Khả năng sinh trưởng của vi khuẩn
Shewanella trong các hệ thống với pH thay đổi từ pH 6-9 khơng có sự thay đổi đáng kể. Tuy nhiên, cơ chất lactat bị tiêu thụ hết sau 6 ngày thí nghiệm, đã được bổ sung hàng tuần, tuy vậy mật độ OD vi khuẩn vẫn giảm nhẹ trong các tuần thí nghiệm tiếp theo. Nguyên nhân là do vi khuẩn tăng sinh hình thành lớp màng sinh học trên vách ngăn cao su (ngăn cách khoang anot với môi trường bên ngồi) nhưng khơng di chuyển vào mơi trường.
3.2. SỰ BIẾN ĐỘNG CÁC THÔNG SỐ TRONG KHOANG CATOT
3.2.1. Sự suy giảm nồng độ ion Cu2+ trong dung dịch catot
Kết quả phân tích nồng độ ion đồng tại khoang catot (hình 3.4) cho thấy trong một tuần đầu thí nghiệm, nồng độ dung dịch của 2 hệ có sự thay đổi rõ rệt. Ở ngày thứ 7 nồng độ ion đồng giảm xuống khoảng 18% đối với hệ sử dụng
chủng vi khuẩn HN41 so với hệ đối chứng từ 4,9 mM xuống xấp xỉ 4 mM. Trong khi đó tại hệ sử dụng chủng SP200, nồng độ ion Cu2+ chỉ giảm khoảng 7% từ 4,8 mM xuống 4,5 mM ở ngày thí nghiệm thứ 7.
Hình 0.6. Sự biến động của hàm lượng ion Cu2+ trong khoang catot Quan sát hai hệ MFC trong 7 ngày thí nghiệm cho thấy, ở ngày thứ 3 của
thí nghiệm đã xuất hiện kết tủa đồng trong hệ sử dụng chủng HN41. Điều này cũng phù hợp với sự thay đổi pH trong anot hay nói cách khác dịng điện dịch chuyển từ anot ở hệ HN41 tốt hơn. Như vậy, tốc độ sản xuất vật liệu đồng của hệ HN41 cao hơn so với hệ SP200. Trên điện cực than chì, hạt nano kết tủa thành lớp màng mỏng màu xanh da trời và có ánh kim của các hạt nano đồng.
Từ kết quả của các thí nghiệm trên có thể nhận thấy catot có vai trị quan trọng đối với hiệu suất giải phóng năng lượng ở anot và nó cũng phải có thế oxi hóa khử cao để kết hợp với các proton trong sự hình thành sản phẩm ở khoang catot. Hệ MFC hai khoang thí nghiệm có ưu điểm là dễ dàng thu hồi vật liệu sau khi thí nghiệm, do nếu chỉ có một khoang thì việc tiếp xúc giữa vi sinh vật và vật liệu tạo thành trong hệ sẽ gây khó khăn cho việc làm sạch vật liệu. Hơn nữa quy mô anot nhỏ ảnh hưởng tới cường độ dòng điện sinh ra trong MFC, do
đó ảnh hưởng tới phản ứng sinh ra kết tủa nano đồng trong khoang catot cũng như sự sụt giảm ion đồng trong khoang diễn ra chậm. Tao và cs (2011) đã tách ion đồng ra khỏi môi trường nước ở điện cực dương, đã cơng bố hệ MFC có khả năng loại bỏ ion đồng lên đến 100 mM Cu2+ với hiệu suất 96% sau 15 ngày dưới dạng Cu2O và Cu [38].
Từ kết quả của các thí nghiệm trên, nhóm nghiên cứu nhận thấy khơng có sự hình thành sản phẩm của Cu trong điều kiện catot kị khí. Điều này được giải thích: do sự chênh lệch thế oxi hóa khử giữa anot và catot. Để giải phóng năng lượng trao đổi chất, vi sinh vật vận chuyển electron từ cơ chất tại một điện thế thấp (axetat, lactat,…) thông qua chuỗi vận chuyển electron tới chất nhận electron cuối cùng (oxi, Mn2+,…) tại một điện thế cao hơn. Catot có vai trị quan trọng đối với hiệu suất giải phóng năng lượng ở anot và nó cũng phải có thế oxi hóa khử cao để kết hợp với các proton trong sự hình thành sản phẩm ở khoang catot. Ở hệ hiếu khí, sự có mặt của oxi đã làm tăng thế oxi hóa khử ở cực dương của pin vi sinh vật, do đó 32 làm tăng tốc độ vận chuyển electron qua màng tế bào (EET) của vi khuẩn tới điện cực, kết quả làm tăng tốc độ phản ứng tạo thành sản phẩm trong khoang catot.
Tuy nhiên, hệ MFC hai khoang thí nghiệm có ưu điểm là dễ dàng thu hồi vật liệu sau thí nghiệm, do việc tiếp xúc giữa vi sinh vật và vật liệu tạo thành trong MFC một khoang gây khó khăn cho việc làm sạch vật liệu. Hơn nữa, quy mơ anot nhỏ ảnh hưởng tới cường độ dịng điện sinh ra trong MFC, do đó ảnh hưởng tới phản ứng sinh nano đồng trong khoang catot, cũng như sự sụt giảm nồng độ ion Cu2+ trong khoang. Trong đề tài này , các chủng
Shewanella trong hệ pin chỉ loại bỏ được ca nhất khoảng 18% với chủng HN41 sau 7 ngày. Việc loại bỏ được ion đồng có trong khoang thí nghiệm MFC cịn có ý nghĩa thực tiễn cao trong việc ứng dụng thiết kế này trong xử lý kim loại nặng có trong nước thải ơ nhiễm kim loại. Lớp kết tủa trong khoang được phân tích đặc trưng bề mặt, hình dạng và kích thước hạt bằng phương pháp chụp ảnh SEM.
3.2.2. Đặc trưng về hình thái, cấu trúc và tính chất của vật liệu nano đồng thu được
Kết quả phân tích hiển vi điện tử quét SEM và hiển vi điện tử truyền qua TEM của hạt nano đồng thu được từ hai hệ MFC như sau:
Hình 0.7. Ảnh hiển vi điện tử quét (A,B) của vật liệu trên bề mặt than chì của
hệ cấy chủng SP200 và ảnh hiển vi điện tử quét (C,D) của vật liệu trên bề mặt than chì có chủng HN41
Quan sát hình thái học cho thấy: Các hạt nano đồng đều có cấu tạo khá đồng đều về mặt kích thước và phân tán khá tốt trong dung dịch. Kết quả hình trên cho thấy phần lớn kết tủa dạng hình cầu có kich thước khoảng 1,2 micromet đối với vật liệu từ cả hai hệ pin nhiên liệu vi sinh vật khơng mạch ngồi sử dụng vi khuẩn Shewanella.
Đồng thời, ảnh SEM cũng cho thấy các hạt nano đồng với kích thước khoảng 80 nm có hiện tượng gắn kết lại với nhau. Vật liệu nano trong hệ sử
dụng chủng HN41 kết tủa trên bề mặt điện cực dày, gồ ghề hơn so với kết tủa trên bề mặt điện cực hệ sử dụng chủng SP200. Và trong hệ đối chứng, không nhận thấy kết tủa sau 7 ngày thí nghiệm cả trên điện cực than chì cũng như trong mơi trường ở điện cực dương. Kích thước là một trong những yếu tố quan trọng quyết định khả năng xâm nhập qua màng tế bào của vật liệu nano cũng như tạo ra các đặc tính khác biệt của vật liệu so với dạng.
Thông thường, theo cơ chế nhập bào, để được hấp thụ vật liệu nano cần phải liên kết đủ với các thụ thể và cơ quan thụ cảm bề mặt nhằm tạo ra sự giảm cục bộ mức năng lượng tự do Gibbs trên màng tế bào. Vì vậy, những hạt nano có kích thước nhỏ cần ít các thụ thể để liên kết hơn, do đó dễ dàng qua màng tế bào và tích tụ tại các bào quan nhiều hơn các vật liệu có kích thước lớn [39– 41]. Vật liệu nano đồng thu được sau 7 ngày thí nghiệm thu được ở điện cực sau đó được đem xác định về thành phần nguyên tố và trạng thái của đồng bằng phân tích ESD và phổ nhiễu xạ tia X.
Phổ tán xạ năng lượng ESD là rất cần thiết để xem xét sự có mặt của các ngun tố được hình thành trong khoang điện cực dương trong vật liệu nano thu được ở khoang điện cực dương.
Hình 0.8. Ảnh ESD của vật liệu trên bề mặt điện cực than chì của hệ cấy với
chủng SP200
Hình 0.9. Ảnh ESD của vật liệu trên bề mặt điện cực than chì của hệ cấy với
Kết quả trên cho thấy ngồi ngun tố đồng cịn có sự xuất hiện của oxi (Hình 3.6, 3.7). Như vậy ở điện cực than chì có thể xảy ra phản ứng oxi hóa khử như sau:
Cu2+ + e- + OH-Cu(OH-)
Hình 0.10. Phổ nhiễu xạ tia X (XRD) của vật liệu nano đồng thu được
Bên cạnh đó các nguyên tố Clo và Cacbon có nguồn gốc từ điện cực và từ mơi trường ở điện cực dương, vì vậy dựa theo phương trình phản ứng trên, ở khoang điện cực dương phản ứng oxi hóa khử ion Cu2+ và OH- khi điện tử electron từ khoang anot chuyển sang và khử oxi trong môi trường ở điện cực dương thành gốc OH- và thành dạng đồng hydroxit, điều này cũng được thấy khi phân tích phổ năng lượng tia X.
Để khẳng định kết quả về cấu trúc vật liệu đã thu được, trong nghiên cứu này sử dụng phương pháp nhiễu xạ tia X đánh giá một cách chi tiết dạng tinh thể. Giản đồ phổ nhiễu xạ tia X (XRD) cho thấy có sự xuất hiện của các
cực đại nhiễu xạ trong phạm vi góc 2θ = 20 – 60 độ. Các đỉnh cực đại của phổ nhiễu xạ tia X tương ứng với định cực đại của vật liệu đồng ở dạng hỗn hợp tinh thể Paratacamite và Atacamite (Hình 3.8).
3.3. ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ ỨC CHẾ CỦA NANO ĐỒNG ĐẾN HAI LOẠI
VI KHUẨN XANTHOMONAS AXONOPODIS VÀ RALSTONIA
SOLANACEARUM
3.3.1. Hiệu quả ức chế của nano Đồng đến vi khuẩn Xanthomonas
axonopodis
Để tìm hiểu khả năng ức chế vi khuẩn của nano đồng ở các mức nồng độ khác nhau, tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của nano đồng lên quá trình phát triển của vi khuẩn Xanthomonas axonopodis cấy trên đĩa thạch. Hình 3.9 là hình ảnh chụp đĩa thạch được cấy vi khuẩn sau 24h nhỏ nano đồng trong các lỗ trên đĩa ở các mức nồng độ 10/25/50/100/200ppm.
Hình 0.11. Đĩa thạch thử tính kháng khuẩn của nano đồng đối với vi khuẩn Xanthomonas axonopodis
Quan sát sau thời gian 24h dung dịch nano đồng khuếch tán ra xung quanh từ nơi có nồng độ cao đến nơi có nồng độ thấp ở xung quanh. Hình 3.9
cho thấy ảnh hưởng của nước và etylen glycol đến quá trình phát triển của vi khuẩn cho thấy hầu như là không ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi khuẩn, do khơng thấy xuất hiện vịng kháng. Đối với các lỗ thạch nhỏ dung dịch nano đồng cũng tương tự không thấy xất hiện vòng kháng, điều này chứng tỏ đối với vi khuẩn Xanthomonas axonopodis thì nano đồng khơng thể hiện được tính kháng của mình.
Hình 0.12. Hiển vi điện tử quét tế bào vi khuẩn Xanthomonas axonopodis sau
24h
Hơn nữa, ảnh chụp SEM cho thấy tế bào vi khuẩn Xanthomonas
axonopodis không bị phá vỡ bởi nano đồng cho dù ở nồng độ nào, tế bào vi
khuẩn vẫn cịn ngun vẹn, vi khuẩn hình que và thấy rõ được màng tế bào (Hình 3.10). Vỏ tế bào là tuyến phòng thủ đầu tiên giữa vi khuẩn và tác nhân kháng. Thông thường, các bước ban đầu quyết định kết quả của nhiễm khuẩn hoặc hệ thống miễn dịch phụ thuộc vào cấu trúc và thành phần của bề mặt tế bào vi khuẩn.
Một trong những phân tử bề mặt vi khuẩn được nghiên cứu là