Nội dung nghiên cứu - 2071834- 123docz.net

Nội dung nghiên cứu bao gồm :

– Khảo sát nhiệt độ và nồng độ pectin bổ sung vào dung dịch enzyme bromelain thô sau khi ly tâm sau thời gian bảo quản 4 ngày.

– Khảo sát các chế độ sấy khác nhau đến hoạt tính và hoạt tính riêng của enzyme bromelain trích ly từ vỏ khóm. Chọn chế độ sấy và nồng độ maltodexrin bổ sung thích hợp nhất bằng phương pháp sấy phun.

– Khảo sát nhiệt độ bảo quản enzyme bromelain ở dạng sấy phun sau khi chọn nhiệt độ và nồng độ maltodextrin bổ sung sau 7 ngày bảo quản.

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU P

Phhưươơnngg ttiiệnện nngghhiiêênn ccứuứu

3.1.1 Địa điểm, thời gian nghiên cứu

- Địa điểm thực hiện: phịng thí nghiệm Bộ mơn Công Nghệ Thực Phẩm, khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ.

- Thời gian thực hiện: Từ 03/01/2011 đến 22/04/2011

3.1.2 Nguyên liệu

Vỏ khóm được lấy từ công ty cổ phần chế biến thực phẩm xuất khẩu Miền Tây, khu công nghiệp Cái Sơn – Hàng Bàng, TP Cần Thơ.

3.1.3 Hóa chất thí nghiệm

- Casein (Trung Quốc)

- L - Cysteine hydrochlorid – monohydrate (Trung Quốc) - Cồn 96o

- Coomassie brilliant blue (CBB) - Acid phosphoric (H3PO4) - Natri hydroxit (NaOH)

- Trichloroacetic acid (TCA) (Trung Quốc)

- Disodium hydro phosphate (Na2HPO4.12H2O), (Trung Quốc) - Acid citric (Trung Quốc)

- Pectin (Trung Quốc)

- Maltodextrin (Trung Quốc)

3.1.4 Thiết bị thí nghiệm

- Máy ly tâm lạnh - Máy sấy phun

- Thiết bị ủ nhiệt (Water Bath)

- Máy đo quang phổ (Spectrophotometer) - Cuvette thạch anh, Cuvette nhựa

- Máy đo pH

- Máy đo độ nhớt

- Micropipette, pipette, nhiệt kế - Máy xay sinh tố

- Tủ lạnh, tủ đông và một số dụng cụ khác

3.2 Phương pháp thí nghiệm

3.2.1 Phương pháp trích ly enzyme thơ từ vỏ khóm

Vỏ khóm từ công ty đem về được chọn lựa để loại vỏ chín hồn tồn và enzyme bromelain được thu nhận theo sơ đồ

Hììnnhh 1100:: SSơơ đồđồ ququyy ttrrììnnhh trtríícchh llyy eennzzyymmee bbrroommeellaaiinn vvỏỏ (t(thhơơ))

Bảo quản Kết tủa Sản phẩm Sấy phun Bảo quản Vỏ khóm Làm sạch Nghiền ép Lọc Bã Ly tâm lạnh, 6000 RPM, 20 phút Dịch trong Dịch trong Ly tâm lạnh (10.000 RPM, 20 phút) Tủa cồn (-16oC, 4 giờ)

(Nguồn: Lại Thị Ngọc Hà, 2009)

3.2.2 Phương pháp xác định hoạt tính của enzyme bromelain

Hoạt tính enzyme bromelain trong các nội dung nghiên cứu được xác định dựa trên sự thủy phân protein casein của enzyme có trong dung dịch, hoạt tính được đánh giá bằng lượng tyrosine sinh ra (phương pháp Kunitz, xem phụ lục).

3.2.3 Xác định hàm lượng protein của enzyme bromelain bằng Coomassie Brillant Blue – G250 (phương pháp Bradford)

Phương pháp Bradford là cách xác định hàm lượng protein có trong dung dịch được xác định dựa trên phản ứng tạo màu giữa protein và thuốc thử Coomassie brilliant blue. Hỗn hợp phản ứng được đo độ hấp thụ ở bước sóng 595nm và dựa vào đường chuẩn của protein tinh khiết ta có hàm lượng protein của mẫu nghiên cứu. (phương pháp Bradford, xem phụ lục).

3.3 Bố trí thí nghiệm

3.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, nồng độ pectin bổ sung đến hoạt tính của enzyme bromelain theo thời gian bảo quản. đến hoạt tính của enzyme bromelain theo thời gian bảo quản.

e. i. Mục đích

Tìm ra nhiệt độ và nồng độ pectin bổ sung vào dung dịch enzyme bromelain thô sau khi ly tâm sau thời gian bảo quản 7 ngày.

f. ii. Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí với ba nhân tố hồn tồn ngẫu nhiên với hai lần lặp lại. Nhân tố A: Nhiệt độ

A1: 4oC A2: -16oC

Nhân tố B: Nồng độ pectin bổ sung B0: 0,0%

B1: 0,1% B2: 0,2% B3: 0,3%

Nhân tố C: Thời gian bảo quản C0: 0 ngày

C3: 3 ngày C4: 4 ngày

Tổng số mẫu thí nghiệm: 2x4x5x2 (lần lặp lại) = 80 mẫu

g. iii. Tiến trình thí nghiệm

Chuẩn bị dịch vỏ khóm xanh. Các mẫu được tiến hành như cách bố trí trên. Theo thời gian bảo quản mẫu thí nghiệm được kiểm tra đặc tính vật lý ( màu sắc, độ kết lắng), đo độ nhớt, đo hoạt tính của enzyme bằng phương pháp Kunitz (phụ lục) với cơ chất là casein điều kiện thí nghiệm pH =7, nhiệt độ 37oC.

3.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ và nồng độ maltodextrin

bổ sung lên enzyme bromelain bằng phương pháp sấy phun.

h. i. Mục đích

i. Tìm nhiệt độ và nồng độ maltodextrin ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme bromelain bằng phương pháp sấy phun.

j. ii. Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên với 2 nhân tố: Nhân tố D: Nhiệt độ

D1: 85oC D2:95oC D3: 105oC Nhân tố E: Nồng độ maltodextrin E1: 15%

E2: 20%

Thí nghiệm được lặp lại 2 lần.

Tổng số mẫu thí nghiệm: 3x2x2 = 12 mẫu

k. iii. Tiến trình thí nghiệm

Tiến hành thí nghiệm như cách đã bố trí. Các mẫu thí nghiệm sau thời gian sấy đo hoạt tính bằng phương pháp Kunitz và xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford.

3.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme

bromelain trích ly bằng phương pháp sấy phun theo thời gian bảo quản.

l. i. Mục đích

m. Tìm nhiệt độ bảo quản enzyme bromelain thơ ở dạng sấy phun sau 7 ngày bảo quản.

n. ii. Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí với hai nhân tố, 2 lần lặp lại Nhân tố F: Nhiệt độ

Thường Lạnh (4oC)

Nhân tố G: Thời gian

G0: Ngày 0 G1: Ngày 1 G2: Ngày 2 G3: Ngày 3 G4: Ngày 4 G5: Ngày 5 G6: Ngày 6 G7: Ngày 7 Ứng với mỗi nghiệm thức thời gian là một mẫu thử, lập lại 2 lần. o. Tổng số mẫu thí nghiệm: 2x8x2 (số lần lập lại)= 32 mẫu

p. iii. Tiến trình thí nghiệm

Sau thời gian bảo quản mẫu thí nghiệm được kiểm tra hoạt tính bằng phương pháp Kunitz.

CHHƯƯƠƠNNGG 22 CCHHƯƯƠƠNNGG 44 KKẾTẾT QQUUẢẢ VVÀÀ TTHHẢẢOO LLUUẬẬNN

4.1 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ và nồng độ pectin bổ sung đến enzyme bromelain trích ly từ vỏ khóm theo thời gian bảo quản. bromelain trích ly từ vỏ khóm theo thời gian bảo quản.

Để nghiên cứu enzyme bromelain trong dung dịch khóm tươi trích ly từ vỏ khóm, đầu tiên chuẩn bị nguyên liệu vỏ khóm để tiến hành trích ly lấy dịch. Vỏ khóm sau khi lấy về từ nhà máy được lựa chọn lấy vỏ khóm xanh có độ chín 0% - 0,25%, vì độ chín này hoạt tính enzyme bromelain được trích ly là cao nhất 3,975 TU/ml, theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Hồng Nhung và Hồ Chí Cơng (2010). Sau đó tiến hành trích ly lấy dịch khóm như quy trình (hình 10). Sau khi thu được dịch chiết từ vỏ khóm ta chuẩn bị mẫu để khảo sát điều kiện bảo quản, bảo quản ở 4oC và -16oC ứng với mỗi nhiệt độ ta bổ sung pectin với các nồng độ là 0,0%, 0,1%, 0,2%, 0,3%. Thí nghiệm khảo sát điều kiện bảo quản tối ưu nhất mà không làm thay đổi lớn đến đặc tính của bromelain trong dung dịch. Vì vậy, vấn đề đặt ra là cần tiến hành khảo sát phương pháp bảo quản enzyme trong điều kiện nào là tốt nhất về nhiệt độ hay nồng độ pectin bổ sung để hạn chế tối thiểu sự biến đổi hoạt tính của bromelain trong dung dịch khóm.

Hììnnhh 1111:: NNgguuyyêên n lliiệệuu vvàà ddịịcchh kkhhóómm đđểể bbảảoo qquuảảnn

Thí nghiệm tiến hành khảo sát ở hai điều kiện bảo quản là bảo quản lạnh ở nhiệt độ 4oC và bảo quản ở nhiệt độ -16oC. Mẫu được đem phân tích hoạt tính enzyme theo phương pháp Kunitz, đồng thời được đánh giá cảm quan về các đặc tính vật lý, có sự so sánh giữa các mẫu. Sự thay đổi hoạt tính của enzyme bromelain theo nhiệt độ và nồng độ pectin bổ sung kết quả thu được như sau:

Bảng 3: Hoạt tính bromelain theo nhiệt độ và nồng độ pectin bổ sung Nhiệt độ (o C) 0,0% 0,1% 0,2% 0,3% Trung bình 4 1,97 1,95 1,91 1,87 1,92a -16 3,62 3,72 3,68 4,08 3,77b Trung bình 2,79a 2,83ab 2,79a 2,97b

Kết quả thể hiện là hoạt tính enzyme theo đơn vị Tu/ml. Số liệu trong bảng là giá trị trung bình của 2 lần lặp lại

Các chữ cái thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các giá trị trung bình (ở cùng hàng hoặc cột) ở mức ý nghĩa 5%.

Qua kết qua thu được ở bảng 3 cho thấy so sánh giữa ở 4oC và -16oC thì bromelain bảo quản ở -16oC (3,77 TU/ml) hoạt tính tốt hơn so với bảo quản 4oC (1,92 TU/ml). Kết quả cịn cho thấy khơng có sự khác biệt giữa các nồng độ pectin bổ sung.

Bảng 4: Hoạt tính bromelain ở 4oC theo nồng độ pectin bổ sung và thời gian bảo quản

Nồng độ pectin Thời gian (ngày) 0,0% 0,1% 0,2% 0,3% 0 4,06d 3,94c 3,96d 3,89d 1 3,35c 3,74c 3,52cd 3,34d 2 1,15b 1,02b 0,93c 1,36c 3 0,74a 0,55a 0,78b 0,44b 4 0,55a 0,49a 0,39a 0,31a

Kết quả thể hiện là hoạt tính enzyme theo đơn vị Tu/ml.

Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê ởđộ tin cậy 95%

Bảng 5: Hoạt tính bromelain ở -16o

C theo nồng độ pectin bổ sung và thời gian bảo quản

Nồng độ pectin Thời gian (ngày) 0,0% 0,1% 0,2% 0,3% 0 4,47c 4,21d 4,17c 4,17bc 1 3,67b 3,37c 4,11c 3,58a 2 3,53ab 4,49bc 3,77bc 4,54c 3 3,52ab 3,33b 3,36ab 4,33c 4 2,93a 2,79a 2,98a 3,82ab

Kết quả thể hiện là hoạt tính enzyme theo đơn vị Tu/ml.

Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê ở độ tin cậy 95%

Từ kết quả ở bảng 4 và bảng 5 cho thấy các mẫu dung dịch chứa enzyme được bảo quản trong điều kiện lạnh và lạnh đơng có hoạt tính enzyme vẫn còn ổn định sau ngày đầu, đến ngày thứ hai thì hoạt tính bromelain bảo quản ở 4oC thay đổi rõ rệt theo xu hướng giảm khá mạnh cịn bảo quản ở nhiệt độ -16oC thì hoạt tính vẫn cịn cao. Đến ngày thứ 3 và thứ 4 bảo quản ở nhiệt độ 4oC thì hoạt tính giảm dần theo thời gian nhưng đối với mẫu bảo quản ở điều kiện -16oC hoạt tính của bromelain trong dung dịch vẫn còn cao, thể hiện qua giá trị hoạt tính thu được khơng thay đổi nhiều trong suốt thời gian tồn trữ. Xét về nhân tố nhiệt độ bảo quản, theo kết quả

cao sau thời gian bảo quản 4 ngày. Enzyme ở điều kiện bảo quản này có thể sử dụng tốt cho nghiên cứu trong thời gian dài. Điều này có thể giải thích ở nhiệt độ -16oC 86% nước trong dung dịch chứa enzyme bị đóng băng, phần lớn hoạt động của vi sinh bị ức chế, enzyme không hoạt động được tránh hiện tượng tự phân của chúng. Vì thế, sau rã đơng mẫu có thể duy trì được hoạt tính của bomelain gần như ban đầu. Các nghiên cứu về sự ổn định của enzyme cũng cho thấy, lạnh đông nhanh ở nhiệt độ nhỏ hơn -20oC (tốt nhất là -70oC hay lạnh đông bằng Nitơ lỏng) là chế độ tối ưu nhằm duy trì hoạt tính của enzyme (Copeland, 2000).

Các pectin đều là những chất keo háo nước nên có khả năng hydrat hóa cao nhờ sự gắn các phân tử nước vào nhóm hydroxyl của chuỗi polymethyl galacturonic. Ngoài ra, trong phân tử pectin có mang điện tích âm nên chúng có khả năng đẩy lẫn nhau có khả năng làm giãn mạch và làm tăng độ nhớt của dung dịch. Khi làm giảm độ tích điện và hydrat hóa sẽ làm cho sợi pectin xích lại gần nhau và tương tác với nhau tạo nên một mạng lưới ba chiều rắn chứa pha lỏng ở bên trong. Chính nhờ tính chất này của pectin nên ta bổ sung pectin nhằm tạo gel làm giảm sự di chuyển của enzyme bromelain trong dung dịch nhằm tránh sự tự phân của của nó trong thời gian bảo quản. Kết quả ở bảng 4 và bảng 5 pectin hầu như khơng có tác dụng ngăn sự giảm hoạt tính của bomelain trong quá trình bảo quản. Ở 4oC, pectin khơng có tác dụng mà có tác dụng ngược lại so với mẫu không bổ sung pectin. Có thể kết luận bổ sung pectin 0,3% có hiệu quả để bảo quản bromelain ở dạng lỏng nhưng bomelain được bảo quản tốt ở nhiệt độ -16oC.

Bảng 6: Độ nhớt của dung dịch chứa bromelain theo nhiệt độ và nồng độ pectin bổ sung

Nhiệt độ (oC) 0,0% 0,1% 0,2% 0,3% Trung bình 4 6,16 6,71 7,25 8,15 7,00a

-16 6,35 6,87 7,42 9,05 7,43a

Trung bình 6,26a 6,79ab 7,21c 8,60d

Kết quả thể hiện là độ nhớt enzyme theo đơn vị cP.

Các chữ cái thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các nghiệm thức ở mức ý nghĩa 5%. Số liệu trong bảng là giá trị trung bình của 2 lần lặp lại

Qua kết quả ở bảng 6 cho thấy độ nhớt có sự khác biệt giữa các nồng độ pectin bổ sung, bổ sung pectin với nồng độ càng cao thì đồng thời độ nhớt của dung dịch khóm cũng tăng nhưng không khác biệt ở nhiệt độ 4oC và -16oC.

Bảng 7: Độ nhớt của dung dịch chứa bromelain ở 4oC theo nồng độ pectin bổ sung theo thời gian bảo quản

Nồng độ pectin Thời gian (ngày) 0,0% 0,1% 0,2% 0,3% 0 8,34b 9,87b 9,87b 12,45b 1 5,55a 6,09a 6,57a 7,32a 2 5,76a 6,18a 6,36a 7,08a 3 5,61a 5,79a 5,91a 7,80a 4 5,52a 5,61a 6,30a 6,09a

Kết quả thể hiện là độ nhớt của dung dịch khóm theo đơn vị cP.

Các số liệu trong bảng là kết quả trung bình của 2 lần lặp lại. Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột dọc biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê ở độ tin cậy 95%

Bảng 8: Độ nhớt của dung dịch chứa bromelain ở -16o

C theo nồng độ pectin bổ sung theo thời gian bảo quản

Nồng độ pectin Thời gian (ngày) 0,0% 0,1% 0,2% 0,3% 0 9,99b 10,62b 11,73a 17,61b 1 5,40ab 5,85a 6,0a 6,69a 2 5,52ab 6,69ab 6,78a 7,23a 3 4,92a 5,67a 6,45a 6,69a 4 5,94ab 5,55a 6,15a 7,05a

Kết quả thể hiện là độ nhớt của dung dịch khóm theo đơn vị cP.

Về đặc tính vật lí, mẫu dung dịch khóm tươi chứa enzyme bromelain quả sau ly tâm ban đầu có trạng thái trong, màu vàng sáng đặc trưng của dung dịch khóm, khơng vẩn đục, khơng có mùi lạ. Sau những khoảng thời gian bảo quản mẫu ở hai điều kiện trên, nhận thấy các mẫu dung dịch có sự khác biệt ở nhiều mặt. Mẫu được bảo quản ở điều kiện -16oC, sau các thời gian bảo quản 4 ngày, dung dịch sau rã đông vẫn giữ được trạng thái và màu sắc như ban đầu, không mùi lạ, bị vẩn đục do sự lắng tụ của pectin nằm ở phía dưới của đáy cốc và nồng độ pectin càng cao thì sự lắng tụ càng nhiều. Mẫu được bảo quản ở điều kiện 4oC, sau 4 ngày bảo quản mẫu có màu vàng sậm, hơi có mùi lạ, bị vẫn đục và bị kết lắng thể hiện khá rõ và tăng dần theo nồng độ pectin bổ sung.

H Hììnnhh 1122:: MMẫẫuu bbaann đđầầuu H Hììnnhh 1133:: BBảảoo qquuảảnn ởở 44ooC C H Hììnnhh 1144:: BBảảoo qquuảảnn ởở --1166ooCC

Từ các kết quả đã khảo sát có thể kết luận: nên sử dụng dung dịch khóm chứa enzyme bromelain bảo q uản ở n h iệt đ ộ - 1 6oC , vì nhiệt độ này bromelain thay đổi ít so với ban đầu về hoạt tính bromelain cũng như về trạng thái, màu sắc.

a) 0,0% b) 0,1% c) 0,2%