trình ra rễ của hai giống mía ROC26 và BH1.
+ Mục đích của thí nghiệm: Xác định đ−ợc nồng độ thích hợp nhất của NAA để bổ sung vào môi tr−ờng hình thành rẽ sao cho số rẽ và chiều dài rẽ là tốt nhất. + Thí nghiệm đ−ợc tiến hành trong điều kiện tối −u về nhiệt độ, độ ẩm, pH, ánh sáng.
+ Công thức môi tr−ờng gồm: MS + 30 g/l đ−ờng saccharose + 6 g/l agar + NAA với nồng độ thay đổi từ 0mg/l đến 1,5mg/l.
+ Mẫu cấy trong bình tam giác 250ml với số l−ợng 50 cây x 30 bình.
+ Chỉ tiêu quan sát: Số rẽ/ cây, độ dài rẽ, số lá/số cây sau đó tính đ−ợc tỷ lệ rẽ tạo thành.
+ Công thức môi tr−ờng thích hợp sẽ đ−ợc sử dụng cho các thí nghiêm tiếp theọ
ị Nghiên cứu ảnh h−ởng của chất nền đến tỷ lệ sống cử cây trên v−ờn −ơm.
+ Mục đích của thí nghiệm: Tìm ra môi tr−ờng chứa các chất nền thích hợp để đ−a cây ra v−ờn −ơm với tỷ lệ sống là cao nhất.
+ Cây đ−ợc tiến hành làm thí nghiệm trong điều kiện tối −u về ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm, nồng độ oxị
+ Chỉ tiêu quan sát: Số cây/khóm, chiều cao cây, số lá/cây sau 10 , 20, 30 ngàỵ
+ Công thức thích hợp cây sẽ đ−ợc chọn để đ−a ra trồng hàng loạt trên đồng ruộng.
2.3.7. Thu thập và sử lí số liệu:
Để đánh giá và tìm đ−ợc môi tr−ờng tạo đa chồi và tái sinh chồi tốt nhất chúng
tôI sử dụng chỉ tiêu: Số chồi TB/ mẫu, hệ số nhân chồị
Để đánh giá khả năng ra rẽ chúng tôi sử dụng các chỉ tiêu sau: Số rẽ, số chồi ra rẽ hoàn chỉnh, tỷ lệ sống ngoài v−ờn −ơm.
∑ Số chồi tạo thành + Hệ số nhân =
∑ Số chồi đ−a vào (lần)
∑ Số mẫu tạo chồi (callus)
+ Tỷ lệ mẫu tạo chồi (callus) = ∑ Số mẫu cấy X 100% (%)
∑ Số chồi
+ Số chồi TB/mẫu = ∑ Số mẫu tạo chồi (chồi)
∑ Số chồi ra rễ + Tỷ lệ chồi ra rễ =
∑ Số chồi nuôi cấy X 100% (%)
∑ Số rễ
+ Số rễ TB = ∑ Số chồi ra rễ (rễ) n
∑ (xi-X)2 i =1
+ Sai số tiêu chuẩn m =
n
- Cỏc chỉ tiờu theo dừi ủược quan sỏt ủo ủếm thường xuyờn (10ngày/1lần) - Cỏc số liệu ủược tớnh toỏn theo phương phỏp phõn tớch thống kế toỏn học. Quỏ trỡnh xử lý số liệu ủược thực hiện trờn mỏy tớnh với ứng dụng Data Analysis của chương trỡnh Excel 5.0. Dựng hàm thống kờ Anova ủể phõn tớch phương sai một nhõn tố và hai nhõn tố với ba lần lặp.
Phần 3: KếT QUả Và THảO LUậN 3.1. Tạo nguyên liệu vô trùng từ cây mía:
Môi tr−ờng nuôi cấy mô tế bào có chứa đ−ờng, vitamin, muối khoáng, các chất điều hòa sinh tr−ởng. Đó cũng chính là môi tr−ờng thích hợp cho các loại nấm, vi khuẩn phát triển. Do tốc độ sinh tr−ởng và phát triển của nấm, vi khuẩn lớn hơn rất nhiều so với quá trình phân chia của tế bào thực vật. Nếu môi tr−ờng bị nhiễm một vài bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì chỉ trong 3-7 ngày thì toàn bộ môi tr−ờng và mẫu cây sẽ bị nhiễm. Để tạo đ−ợc mẫu sạch không bị nhiễm mốc, khuẩn thì mức độ vô trùng của mẫu cũng nh− của môi tr−ờng nuôi cấy phải đ−ợc tiến hành trong điều kiện nghiêm ngặt. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Với các nguồn vật liệu lấy từ đồng ruộng thì đa số phải qua quá trình khử mẫu hết sức nghiêm ngặt. Tuy nhiên, nguồn vật liệu ban đầu dùng để nuôi cấy mía là các chồi đỉnh, chồi nách, nõn lá non nằm sát đỉnh sinh tr−ởng. Các nguồn vật liệu này đ−ợc bao bọc bởi rất nhiều các bẹ lá nên có thể đảm bảo dến 98% là hoàn toàn vô trùng nếu thực hiện các thao tác chính xác.
Để dảm bảo vô trùng đ−ợc tuyệt đối thì tr−ớc khi bóc các bẹ lá cần phải lau sạch ngọn mía bằng cồn 70. Các thao tác khi vào mẫu phải nhanh, chính xác, thiết bị phải đ−ợc vô trùng nghiêm ngặt. Các nguồn nguyên liệu này đ−ợc cắt và cấy trực tiếp lên môi tr−ờng MS có bổ sung 30g/l đ−ờng và 6g/l agar mà không cần phải khử trùng.
3.2. Nghiên cứu khả năng tạo chồi của hai giống mía ROC26 và BH1.
Môi tr−ờng MS đ−ợc Murashige và Skoog (1962) nghiên cứu và chứng minh là môi tr−ờng có đầy đủ các thành phần chất dinh d−ỡng cơ bản cho nuôi cấy cây ban đầụ Để tiến hành quy trình nhân nhanh bằng in vitro nhằm tạo ra hàng loạt cây
mía có đặc điểm sinh tr−ởng, phát triển giống nhau từ nguồn nguyên liệu ban đầu thì việc tìm hiểu, thăm dò về khả năng hình thành chồi từ các đỉnh chồi, chồi nách là rất cần thiết. Xuất phát từ yêu cầu trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu khả năng tạo chồi của hai giống mía ROC26 và BH1.
Giống Loại chồi đ−a vào Số mẫu tạo thành Số chồi Số chồi nhiễm Số chồi chết Chồi đỉnh 50 57 1 2 Bh1 Chồi nách 50 52 2 3 Chồi đỉnh 50 54 1 2 Roc26 Chồi nách 50 50 3 2
Từ kết quả thí nghiệm trên cho thấy với cùng một số l−ợng mẫu, môi tr−ờng, điều kiện nuôi cấy nh−ng ở giống khác nhau thì khả năng tạo chồi là khác nhaụ Với mỗi loại chồi đỉnh, chồi ngọn đ−a vào nghiên cứu thì khả năng tạo chồi cũng khác nhaụ
Giống mía BH1 với số l−ợng mẫu đ−a vào là 50 ở chồi đỉnh cho 57 chồi mới tạo thành, chồi nách cho 52 chồi trung bình thì 1 chồi ta đ−ợc 1 chồi mớị Số chồi nhiễm ở chồi đỉnh là 1chồi, chồi chết là 2 chồi, chồi nách có số nhiễm nhiều hơn là 2 số chết là 3. Mẫu nhiễm có thể do bình nuôi cấy ch−a đảm bảo, nắp bình rửa ch−a sạch…Mẫu chết có thể do mẫu còn đau khi bị cắt sâu hay panh, kéo còn nóng… Đối với giống ROC26 cũng với số l−ợng mẫu vào là 54 nh−ng số chồi tạo thành thì nhỏ hơn giống BH1. Với chồi đỉnh thì chồi mới tạo thành là 54, chồi cách cho chồi mới tạo thành là 52. Số chồi nhiễm và chết ở chồi đỉnh là 3, chồi nách là 5. Nhìn chung thì khả năng tạo chồi của giống ROC26 đạt cao hơn giống BH1. Với ca hai giống thì khả năng tạo chồi là t−ơng đối cao trung bình từ một chồi đ−a vào ta thu đ−ợc một chồi mới sau 3 tuần nuôi cấỵ Tỷ lệ mẫu nhiễm và chết chỉ chiếm khoảng 16% nh− vậy thì tỷ lệ vào mẫu thành công là 80%. Với tỷ lệ này thỉ khả năng vào mẫu rất có tính thực thị Hai giống mía này đ−ợc đ−a vào bằng con đ−ờng nuôi cấy mô là hoàn toàn có thể.
3.3. Nghiên cứu ảnh h−ởng của 2,4-D ở các nồng độ khác nhau kết hợp với 0,1mg/l IBẠ
Cùng với việc đ−a mẫu vào bằng chồi đỉnh, chồi ngọn thì chúng tôi còn đ−a vào bằng nõn lá non nằm ở sát đỉnh sinh tr−ởng. Lát cắt lá non thông qua quá trình tạo callus để tạo cụm chồị Lát cắt lá non sau khi cắt sẽ đ−ợc đ−a vào môi tr−ờng tạo callus. Eklof và cộng sự (1997) đ, nghiên chứng minh IBA và 2,4-D là hai chất kích thích thuộc nhóm Auxin có tác dụng tạo callus. Đồng thời khi bổ sung kết hợp giữa IBA và 2,4-D thì khả năng tạo callus cao hơn hẳn. Tuy nhiên thì ở thí nghiệm của ông cho thấy với nồng độ của IBA v−ợt quá 0,2mg/l thì gây ức chế sự tạo callus. Chúng tôi chọn làm thí nghiệm với nồng độ của IBA cố định bằng 0,1mg/l kết hợp với nồng độ 2,4-D thay đổi để tìm nồng độ 2,4-D thích hợp cho quá trình tạo callus.(20)
Từ vai trò của 2,4-D và IBA chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh h−ởng của 2,4-D kết hợp với 0,1mg/l IBA tới quá trình phát sinh mô sẹo (callus) của hai giống mía ROC26 và BH1 để tìm ra nồng độ nào là nồng độ thích hợp nhất cho quá trình hình thành mô sẹọ
Bảng 2. ảnh h−ởng của 2,4-D ở các nồng độ khác nhau kết hợp với 0,1 mg/l IBA lên quá trình phát sinh mô sẹo ở lát cắt lá non của hai giống mía ROC26 và BH1.
Sau 4 tuần nuôi cấy (Tính theo tỷ lệ
%)
Sau 8 tuần nuôi cấy (Tính theo tỷ lệ %) CTMT Nồng độ 2,4D (mg/l) Nồng độ IBA (mg/l) Số mẫu cấy Roc26 Bh1 Roc26 Bh1 Td1 0 0,1 50 3 5 6 8 Td2 0,1 0,1 50 37 43 40 6 Td3 0,2 0,1 50 60 66 67 69 Td4 0,3 0,1 50 75 81 85 89 Td5 0,4 0,1 50 33 35 40 40 Td6 0,5 0,1 50 35 36 40 42 Td7 1 0,1 50 16 18 20 20
0 20 40 60 80 100 Tỷ lệ % 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 1 Nồng ủộ 2,4-D ROC26 BH1 0 20 40 60 80 100 Tỷ lệ % 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 1 Nồng ủộ 2,4-D ROC26 BH1
Từ kết quả cho thấy nồng độ 2,4-D ảnh h−ởng rất lớn tới quá trình hình thành callus. Khi môi tr−ờng đối chứng không có 2,4-D thì tỷ lệ tạo callus rất thấp d−ờng nh− là không. Nh−ng khi bổ sung 2,4-D với nồng độ thấp 0,1mg/l thì số callus tạo thành đ, tăng lên 37% với giống ROC26 43% với giống BH1 sau 4 tuần nuôi cấỵ Còn sau 8 tuần nuôi cấy thì tỷ lệ tạo callus tiếp tục tăng nh−ng ít giống ROC26 là 40%, giống BH1 là 45% vì khi này callus đòi hỏi phải chuyển sang môi tr−ờng tái sinh để hình thành chồị Nếu để lâu thì sẽ tạo rễ nhiều và callus bị đen.
Với nồng độ cuả 2,4-D là 0,2 thì tỷ lệ hình thành callus tăng khá cao lên tới 60% với giống ROC26, 66% với giống BH1 sau 4 tuần nuôi cấỵ Sau 8 tuần nuôi
Biểu đồ 3: ảnh h−ởng của 2,4-D lên quá trình phát sinh mô sẹo ở giống mía ROC26 và BH1 sau 4 tuần.
Biểu đô 4: ảnh h−ởng của 2,4-D lên quá trình phát sinh mô sẹo ở giống mía ROC26 và BH1 sau 8 tuần.
cấy thì tỷ lệ tạo callus là 67% với giống ROC26, 69% với giống BH1. ở nồng độ này nhìn chung tỷ lệ tạo callus là t−ơng đối caọ
Khi nồng đô 2,4-D là 0,3 thì tỷ lệ tạo callus đạt cao nhất 75% ở giống ROC26, 81% ở giống BH1 sau 4 tuần nuôi cấỵ Vẫn nh− các nồng độ khác sau 8 tuần nuôi cấy tỷ lệ tạo callus tăng ít 85% ở giống ROC26 và 89% ở giống BH1. Khi nồng độ 2,4-D tăng từ 0,4mg/l đến 1 thì tỷ lệ tạo callus không tăng mà giảm xuống trung bình 28% ở giống ROC26, 29% ở giống BH1 sau 4 tuần nuôi câỵSau 8 tuần thì ở giống ROC26 trung bình là 33%, giống BH1 trung bình là 34%. Do lúc này nồng độ 2,4-D lớn gây phản ứng ng−ợc lại ức chế quá trình tạo callus, tạo rẽ đen nhiều và gây môi đục môi tr−ờng.
Vậy với nồng độ 2,4-D là 0,3mg/l kết hợp với 0,1mg/l IBA là thích hợp nhất cho quá trình hình thành callus đạt 89% ở giống BH1 và 85% ở giống ROC26 sau 8 tuần nuôi cấỵ
Callus hình thành sau 4-8
ảnh 1: Callus hình thành từ 4-8
tuần của giống ROC26 ảnh 2: Callus sau khi chuyển sang môi tr−ờng tái sinh của ROC26
ảnh 3: Callus sau 4-8 tuần của giống BH1
ảnh4:Callus sau khi chuyển sang môi tr−ờng tái sinh của giống BH1
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.4. Nghiên cứu ảnh h−ởng của BAP ở các nồng độ khác nhau kết hợp với 0,2mg/l Kinetin lên quá trình tái sinh chồi từ callus của hai giống mía ROC26 và BH1.
Callus hình thành đ−ợc chuyển sang môi tr−ờng tái sinh để tạo cụm chồị Môi tr−ờng tái sinh có bổ sung BAP, Kinetin đây là hai chất kích thích sinh tr−ởng thuộc nhóm Cytokinin đ, đ−ợc các nhà khoa học trong n−ớc cũng nh− trên thế giới chứng minh là có tác dụng tạo chồi mạnh bắt đầu từ những năm 1930-1950. Cho đến những năm 1960 tới nay thì nhóm chất Cytokinin chính thức đ−ợc đ−a vào nuôi cấy mô với vai trò hết sức quan trọng trong quá trình tái sinh chồị Davenpoort và cộng sự đ, chứng minh Kinetin đ−ợc thí nghiệm trên các loại thực vật khác thì đều cho kết quả chồi tái sinh tốt ở nồng độ 0,2mg/l. Do vậy chúng tôi quyết định nghiên cứu thí nghiệm với nồng độ Kinetin không thay đổi trong suốt quá trình thí nghiệm là 0,2mg/l, BAP thay đổi nồng độ từ 0mg/l tới 2,5 mg/l. Để tìm hiểu xem trong điều kiện cố định nồng độ Kinetin thì nồng độ nào của BAP là bao nhiêu sẽ cho khả năng tạo chồi của hai giống mía là cao nhất chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh h−ởng của BAP ở các nồng độ khác nhau kết hợp với 0,2mg/l Kinetin lên quá trình tái sinh chồi từ callus.
Bảng 4 : Nghiên cứu ảnh h−ởng của BAP ở các nồng độ khác nhau kết hợp với 0,2mg/l Kinetin lên quá trình tái sinh chồi từ callus của hai giống mía ROC26 và BH1 sau 3 tuần nuôi cấỵ
ROC 26 BH1 CT MT Nồng độ BAP
(mg/l) Nồng độ Kinetin Số mẫu cấy thu đ−ợc Số chồi Hệ số nhân thu đ−ợc Số chồi Hệ số nhân
B1 0 0 150 520 3,4 650 4,3 B2 0,5 0,2 150 690 4,6 820 5,4 B3 1 0,2 150 721 4,8 840 5,6 B4 1,5 0,2 150 975 6,5 1.005 6,7 B5 2,0 0,2 150 650 5,0 870 5,8 B6 2,5 0,2 150 642 4,2 825 5,5
0 1 2 3 4 5 6 7 Hệ số nhõn chồi 0 0.5 1 1.5 2 2.5 Nồng ủộ BAP ROC26 BH1
Từ kết quả thí nghiệm trên ta nhận thấy ở môi tr−ờng đối chứng với nồng độ BAP là 0mg/l thì quá trình phát sinh chồi có sảy ra nh−ng với hệ số nhân thấp. Hệ số nhân giống ROC26 là 3,4, giống BH1 là 4,3.
Khi nồng độ BAP tăng từ 0,5 mg/l đến 1mg/l thì chúng tôi nhận thấy ảnh h−ởng của BAP lên hệ số nhân chồi là t−ơng đối rõ rệt. Hệ số nhân tăng lên trung bình là 4,7 ở giống ROC26 và 5,5 ở giống BH1.
Nồng độ của BAP lên tới 1,5 thì hệ số nhân chồi đạt Max. Hệ số nhân đạt 6,5 ở giống ROC26, đạt 6,7 ở giống BH1. Một −u điểm của cây mía là khi nuôi cấy mô cho hệ số nhân cao khá caọ Hệ số nhân chồi lên tới gần 7 đây là một con số cao hơn hết so với các cây đ−ợc đ−a vào nuôi cấy mô tế bàọ Hệ số nhân có ý nghĩa rất lớn trong quá trình tạo hàng loạt các cây có đặc điểm sinh tr−ởng, phát triển giống nhaụ
Tuy nồng độ BAP tiếp tục tăng từ 2mg/l đến 2,5mg/l nh−ng hệ số nhân chồi lại không tăng nữa mà giảm xuống chỉ còn trung bình là 4,6 ở giống ROC26 và 5,6 ở giống BH1. Hiên t−ợng này sảy ra nguyên nhân là do nồng độ BAP cao đ, làm ức chế tới hệ số nhân chồi của hai giống míạ Nồng độ BAP cao còn làm cho cụm chồi của hai giống mía có các biểu hiện khác nh− sùi to và không rõ chồi non.
Vây với nồng độ BAP là 1,5 kết hợp với 0,2mg/l Kinetin thì cho hệ số nhân chồi là cao nhất đạt 6,5 với giống ROC26 và 6,7 với giống BH1.
Biểu đồ 4: ảnh h−ởng của BAP kết hợp 0,2 Kinetin lên hệ số nhân chồi của hai giống mía ROC26 và BH1
3.5. Nghiên cứu ảnh h−ởng của n−ớc dừa đến sự hình thành chồi từ callus của hai giống mía ROC26 và BH1.
Công bố đầu tiên về việc sử dụng n−ớc dừa trong nuôi cấy mô đ−ợc nhà khoa học Van Overbeek và cộng sự của ông tìm rạ Sau đó thì tác dụng tích cực của n−ớc dừa đ, đ−ợc nhiều nhà khoa học khác chứng nhận. N−ớc dừa là hợp chất tự nhiên chứa nhiều chất khoáng, vitamin, hợp chất kích thích sinh tr−ởng thuộc nhóm Cytokinin có tác dụng kích thích hình thành chồị Đây là thành phần không thể thiếu trong quá trình tạo chồi và cụm chồi từ callus. Để biết đ−ợc trong 1l môi tr−ờng nuôi cấy cần bổ sung bao nhiêu % n−ớc dừa chúng tôi tiến hành nghiên cứu