3. Hóa chất và thiết bị dụng cụ thí nghiệm
2.5. Định tính dịch chiết với thuốc thử ancaloit
Lấy 5g bột rễ dừa cạn cho vào bình nón nút mài, làm ẩm bột bằng NH3 đặc trong 30 phút. Thêm 25ml CHCl3, lắc kĩ trong 30 phút. Lọc vào bình gạn, chiết 3 lần bằng dung dịch HCl 2%. Lấy dịch chiết axit để làm các phản ứng định tính sau:
Lấy 2 ống nghiệm, cho vào mỗi ống 1ml dịch chiết - Ống 1: Thêm 2 giọt thuốc thử Mayer
- Ống 2: Thêm 2 giọt thuốc thử Wagner
2.6. Khảo sát các điều kiện chiết tách tối ƣu các hợp chất trong rễ dừa cạn hoa trắng
2.6.1. Chọn dung môi chiết
Việc lựa chọn dung môi chiết là dựa vào sự quan sát màu sắc dịch chiết và sử dụng phương pháp đo quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS.
Tiến hành khảo sát lựa chọn dung môi chiết với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, clorofom, dung dịch hỗn hợp C2H5OH 96% và HCl 2% (4:1), nước cất.
- Chuẩn bị 4 bình tam giác nút mài đã rửa sạch và sấy khô. - Cân khoảng 5g bột rễ dừa cạn hoa trắng cho vào mỗi bình.
- Thêm vào các bình tam giác, mỗi bình 50ml lần lượt các dung môi: n-hexan, clorofom, dung dịch hỗn hợp C2H5OH 96% và HCl 2% (4:1), nước cất
- Ngâm trong 5 ngày ở điều kiện thường, sau đó lọc lấy dịch chiết. Quan sát sự thay đổi màu sắc của các dịch chiết và tiến hành đo UV-VIS ta thu được giá trị mật độ quang của các mẫu trong các dung môi khác nhau.
Từ kết quả trên lựa chọn dung môi thích hợp để hiệu suất chiết tách là cao nhất.
2.6.2. Khảo sát tỉ lệ rắn –lỏng tối ưu
Sau khi lựa chọn được dung môi thích hợp, tiến hành chiết tách các hợp chất trong rễ dừa cạn hoa trắng bằng phương pháp chiết soxhlet.
Mỗi lần khảo sát cân khoảng 10g bột rễ dừa cạn hoa trắng và chiết lần lượt với các thể tích dung môi là 100ml, 120ml, 140ml, 160ml ở nhiệt độ khoảng 650
C.
Dịch chiết thu được tiến hành đuổi dung môi bằng dụng cụ chiết soxhlet. Lượng dung môi còn lại trong dịch chiết để cho bay hơi tự nhiên, ta thu được cắn, cân lấy khối lượng cắn của mỗi mẫu.
Từ kết quả thu được ta chọn thể tích dung môi tối ưu cho quá trình chiết tách.
2.6.3. Khảo sát thời gian chiết tối ưu
Thí nghiệm này xác định thời gian cho quá trình chiết tách tối ưu để thu được hàm lượng các chất trong rễ dừa cạn hoa trắng cao nhất với tỉ lệ rắn - lỏng ở thí nghiệm trên mà tiêu tốn ít thời gian, công sức.
Để khảo sát thời gian chiết tách tối ưu, chúng tôi cố định các thông số khảo sát như: dung môi chiết, mẫu bột rễ dừa cạn, khối lượng bột, nhiệt độ.
Cân khoảng 10g bột rễ dừa cạn cho mỗi lần khảo sát. Tiến hành chiết soxhlet với thể tích dung môi tối ưu ở thí nghiệm trên trong các koảng thời gian lần lượt là 4h, 6h, 8h, 10h và xác định lượng cắn thu được của mỗi lần khảo sát tương tự như thí nghiệm khảo sát tỉ lệ rắn – lỏng.
Từ kết quả thu được ta chọn thời gian cho quá trình chiết tách tối ưu.
2.7. Xác định thành phần các hợp chất trong rễ dừa cạn hoa trắng bằng phƣơng pháp chiết soxhlet
Cân khoảng 10g bột rễ dừa cạn, tiến hành tẩm bột bằng NH3 25% và để yên trong 1 giờ.
Gói bột đã tẩm NH3 trong giấy lọc và cho vào bình chiết soxhlet. Tiến hành chiết với dung dịch cloroform theo tỉ lệ rắn – lỏng và theo thời gian chiết tối ưu đã khảo sát.
Dịch chiết thu được tiến hành thu hồi dung môi còn 1/3 thể tích rồi đem đo GC-MS để xác định thành phần hóa học trong dịch chiết.
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả xác định một số chỉ tiêu hóa lí của rễ dừa cạn hoa trắng
3.1.1. Độ ẩm của rễ đừa cạn hoa trắng
Bột rễ dừa cạn hoa trắng được đem xác định độ ẩm. Số lượng mẫu được lấy để xác định là 3 mẫu. Độ ẩm của mỗi mẫu là hiệu số khối lượng giữa khối lượng của mẫu trước và sau khi sấy. Độ ẩm của rễ là độ ẩm trung bình của 3 mẫu.
Kết quả khảo sát độ ẩm của rễ dừa cạn hoa trắng được trình bày qua bảng 3.1
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát độ ẩm trong rễ dừa cạn hoa trắng
STT m1 m2 m3 W (%) WTB (%) 1 108,800 5,002 113,216 11,72 12,11 2 105,285 5,004 109,688 12,01 3 104,075 5,001 108,446 12,60 Trong đó:
m1 : Khối lượng của chén sứ, (g)
m2 : Khối lượng của bột rễ dừa cạn ,(g)
m3 : Khối lượng chén sứ và bột rễ dừa cạn sau khi sấy,(g) W : Độ ẩm của mỗi mẫu, (%)
WTB : Độ ẩm trung bình ,(%)
Nhận xét: Từ số liệu thu được ở bảng 3.1 ta có: Độ ẩm trung bình trong rễ dừa cạn
hoa trắng là 12,11%
3.1.2. Xác định hàm lượng hữu cơ trong rễ dừa cạn hoa trắng
Từ 3 mẫu bột rễ dừa cạn đã xác định độ ẩm ở trên, tiến hành nung ở 5000C cho đến khi tro có màu trắng xám. Làm nguội trong bình hút ẩm rồi tiến hành cân khối lượng. Quá trình nung kết thúc khi khối lượng cân giữa hai lần cân cuối cùng là không đổi.
Kết quả khảo sát hàm lượng hữu cơ của rễ dừa cạn hoa trắng được trình bày qua bảng 3.2
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát hàm lượng hữu cơ của rễ dừa cạn hoa trắng
STT m1 m2 m4 Tro(%) TroTB(%) HTB (%) 1 108,800 5,002 109,086 5,72 5,79 82,1 2 105,285 5,004 105,569 5,68 3 104,075 5,001 104,374 5,98 Trong đó:
m1 : khối lượng của chén sứ, (g) m2 : khối lượng của bột rễ dừa cạn ,(g)
m4 : khối lượng chén sứ và bột rễ dừa cạn sau khi tro hóa,(g) HTB : Hàm lượng hữu cơ trung bình, (%)
Nhận xét: Hàm lượng hữu cơ trung bình trong rễ dừa c ạn hoa trắng là 82,1%.
Hàm lượng tro trung bình là 5,79% . Trong thành phần của tro vô cơ có
thể chứa hàm lượng của một số kim loại như Ca, Mg, Fe, Cu...
3.1.3. Xác định hàm lượng một số kim loại trong rễ dừa cạn hoa trắng
Bột dừa cạn sau khi tro hóa được hòa tan bằng dung dịch HNO3 đặc và định mức đến 100ml bằng nước cất.
Lấy dung dịch đã được định mức trên đem đi xác định hàm lượng một số kim loại bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS tại Trung tâm khí tượng thủy văn Quốc gia – Đài khí tượng thủy văn khu vực Trung Trung Bộ - số 666 Trưng Nữ Vương - Đà Nẵng
Kết quả hàm lượng một số kim loại trong rễ dừa cạn hoa trắng được trình bày qua bảng 3.3
Bảng 3.3. Hàm lượng một số kim loại trong rễ dừa cạn hoa trắng
Kim loại Ca2+ Mg2+ Fe3+ Pb2+
Hàm lƣợng (mg/l) 1420,8 425,6 15,27 0,3147
Nhận xét: Từ kết quả hàm lượng kim loại ở bảng 3.3, ta thấy hàm lượng Ca và Mg
trong rễ dừa cạn là rất cao
3.2. Định tính ancaloit
Bột dừa cạn hoa trắng được làm ẩm bằng NH3 đặc trong 30 phút rồi lắc với CHCl3, sau đó lọc lấy dịch lọc và đem chiết với dung dịch axit HCl 2%.
Hình 3.1. Dịch lọc CHCl3 trong axit Hình 3.2. Dịch chiết axit
Dịch chiết axit đem thử với thuốc thử Mayer và Wagner để định tính ancaloit trong bột rễ dừa cạn hoa trắng.
Hình 3.3. Kết quả thử dịch chiết với thuốc thử ancaloit
Kết quả định tính của dịch chiết với các thuốc thử ancaloit: - Thuốc thử Mayer : kết tủa màu vàng nhạt
- Thuốc thử Wagner : kết tủa màu nâu
Nhận xét: Từ kết quả cảm quan thu được ở trên, chúng tôi nhận thấy rằng trong dịch
chiết rễ dừa cạn hoa trắng có chứa các hợp chất ancaloit.
3.3. Kết quả khảo sát các điều kiện chiết tách tối ƣu các hợp chất trong rễ dừa cạn hoa trắng
3.3.1. Kết quả lựa chọn dung môi chiết.
Cân khoảng 5g bột rễ dừa cạn, lần lượt cho vào 4 bình tam giác nút mài. Tiến hành ngâm bột rễ dừa cạn hoa trắng trong các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, clorofom, dung dịch hỗn hợp C2H5OH 96%: HCl 2% (tỉ lệ 4:1), nước cất với cùng thể tích là 50ml
Sau 5 ngày, lọc lấy dịch chiết . Quan sát màu sắc dịch chiết và tiến hành đo UV-VIS để định xác mật độ quang của các mẫu
Hình 3.4. Dịch chiết rễ dừa cạn trong các dung môi khác nhau
Kết quả nhận định cảm quan màu sắc dịch chiết trong các dung môi khác nhau được trình bày trong bảng 3.4
Bảng 3.4. Màu sắc dịch chiết trong các dung môi khác nhau
STT Dung môi Màu sắc
1 n-hexan Màu trắng, trong suốt 2 Cồn-axit Màu nâu, trong suốt
3 Nước Màu vàng, đục
4 Cloroform Màu nâu đậm, trong suốt
Nhận xét: Quan sát màu sắc dịch chiết của rễ dừa cạn hoa trắng trong các dung môi
khác nhau, ta thấy dịch chiết cồn-axit và dịch chiết cloroform đều có màu nâu tương tự nhau, nhưng màu của dịch chiết cloroform đậm hơn. Từ kết quả trên, chúng tôi nhận thấy rằng dung môi cloroform tách được nhiều cấu tử trong rễ dừa cạn hoa trắng hơn.
1
2
3
* Kết quả đo quang phổ UV-VIS của mỗi dịch chiết được thể hiện trong bảng 3.5
Bảng 3.5 .Mật độ quang của các dịch chiết rễ dừa cạn
STT Dung môi Bƣớc sóng (nm) Mật độ quang
1 n-hexan 670,5 0,0189
2 Clorofom 380 2,6587
3 Nước Không ghi nhận Không ghi nhận
4 Cồn -axit 383,2 1,0583
Nhận xét: Từ kết quả đo UV-VIS thu được của các dịch chiết, ta thấy dịch chiết
cloroform có mật độ quang cao nhất cùng với kết quả nhận định cảm quan màu sắc của dịch chiết trong các dung môi khác nhau, chúng tôi nhận thấy rằng dung môi clorofom chiết tách được nhiều cấu tử trong rễ dừa cạn nhất nên cloroform là dung môi thích hợp cho quá trình chiết tách các chất trong rễ dừa cạn hoa trắng.
3.3.2. Khảo sát tỉ lệ rắn – lỏng tối ưu
Cân khoảng 10g bột rễ dừa cạn hoa trắng cho mỗi lần khảo sát. Tiến hành tẩm bột bằng dung dịch NH3 25% và để trong khoảng 1giờ. Sau đó gói bột đã tẩm NH3 vào giấy lọc, tiến hành chiết soxhlet trong khoảng thời gian 6giờ, ở nhiệt độ 650
C với các thể tích dung môi lần lượt là: 100ml, 120ml, 140ml, 160ml.
Dịch chiết thu được tiến hành đuổi dung môi bằng dụng cụ chiết soxhlet. Lượng dung môi còn lại trong dịch chiết để cho bay hơi tự nhiên, ta thu được cắn, cân lấy khối lượng.
Kết quả cảm quang lượng sản phẩm chiết của 10g nguyên liệu với các thể tích dung môi 100ml, 120ml, 140m, 160ml được thể hiện ở hình 3.5
Hình 3.5.Khối lượng sản phẩm thu được theo tỉ lệ rắn – lỏng khác nhau
Kết quả khảo sát tỉ lệ rắn - lỏng được thể hiện trong bảng 3.6
Bảng 3.6.Kết quả khảo sát tỉ lệ nguyên liệu-dung môi
STT Thể tích dung môi (ml) m1 (g) m2 (g) Khối lƣợng cắn (g) 1 100 54,38 54,67 0,29 2 120 50,30 50,65 0,35 3 140 56,84 57,15 0,31 4 160 55,72 55,92 0.2
Trong đó: m1: khối lượng cốc ban đầu (g) m2: khối lượng cốc chứa cắn (g) Từ bảng 3.5, chúng tôi xây dựng đồ thị như sau:
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 100ml 120ml 140ml 160ml
Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc khối lượng cắn vào tỉ lệ rắn- lỏng khác nhau
Nhận xét: Với 10g bột rễ dừa cạn hoa trắng chiết bằng dung dịch CHCl3 với các thể tích 100ml, 120ml, 140ml, 160ml thì khối lượng cắn nhiều nhất là 0,35g tương ứng với thể tích dung môi là 120ml.
Vậy tỉ lệ rắn – lỏng tối ưu là 10 : 120 = 1:12
3.3.3.Khảo sát thời gian chiết tối ưu
Cân khoảng 10g bột rễ dừa cạn cho mỗi lần khảo sát. Tiến hành chiết soxhlet với thể tích dung môi tối ưu đã khảo sát ở thí nghiệm trên là 120ml trong các koảng thời gian lần lượt là 4h, 6h, 8h, 10h và xác định lượng cắn thu được của mỗi lần khảo sát tương tự như thí nghiệm khảo sát tỉ lệ rắn – lỏng.
Dịch chiết thu được tiến hành đuổi dung môi bằng dụng cụ chiết soxhlet. Lượng dung môi còn lại trong dịch chiết để cho bay hơi tự nhiên, ta thu được cắn và cân lấy khối lượng.
Kết quả cảm quan về lượng sản phẩm tạo thành theo thời gian chiết 4giờ, 6giờ, 8giờ, 10giờ được thể hiện ở hình 3.7
Khối
lư
ợng
cắn
Hình 3.7.Khối lượng sản phẩm thu được theo thời gian chiết
Kết quả khảo sát thời gian chiết tối ưu được thể hiện trong bảng 3.7
Bảng 3.7. Kết quả khảo sát thời gian chiết tối ưu
STT Thời gian chiết
(giờ) m1 (g) m2 (g) Khối lƣợng cắn (g) 1 4 56,40 56,60 0,2 2 6 49,30 49,55 0,25 3 8 55,74 56,06 0,32 4 10 58,45 58,81 0.35 Trong đó:
- m1: khối lượng cốc ban đầu (g) - m2: khối lượng cốc chứa cắn (g)
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 4h 6h 8h 10h
Hình 3.8. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc khối lượng cắn vào thời gian chiết
Nhận xét: Với 10g bột rễ dừa cạn hoa trắng chiết với 120ml dung dịch CHCl3 trong thời gian từ 8 đến 10 giờ thì khối lượng cắn tăng không đáng kể. Nếu tiếp tục tăng thời gian chiết thì có thể các chất trong dịch chiết bị phân hủy bởi nhiệt cung cấp cho quá trình chiết. Vì vậy thời gian chiết thích hợp là trong 8 giờ.
3.4. Quy trình chiết tách các chất trong bột rễ dừa cạn hoa trắng bằng phƣơng pháp chiết soxhlet.
Quá trình chiết được thực hiện trong bình Soxhlet gồm có: bình cầu, trụ chiết, ống sinh hàn và bếp cách thủy.
Cân khoảng 10g bột rễ dừa cạn, tiến hành tẩm bằng 25ml dung dịch NH3 25%, để yên khoảng 1 giờ để chuyển ancaloit muối trong dược liệu thành dạng bazơ tan trong CHCl3.
Khối
lư
ợng
cắn
Hình 3.9. Bột dừa cạn trước và sau khi tẩm NH3 25%
Bột sau khi tẩm NH3 đem gói trong giấy lọc. Cho gói nguyên liệu vào trụ chiết, lắp trụ chiết vào bình cầu, cho 120ml dung dịch CHCl3 vào bình chiết đến ngập túi nguyên liệu, lắp ống làm lạnh, ngâm nguyên liệu trong dung môi khoảng 30 phút. Đặt bình Soxhlet vào nồi cách thủy. Tiến hành chiết trong thời gian 8 giờ ở nhiệt độ khoảng 65o
C Dịch chiết clorofom thu được, tiến hành đuổi dung môi còn khoảng 1/3 thể tích và đem đo GC-MS tại Trung tâm kĩ thuật đo lường chất lượng II, số 2 – Ngô Quyền – Đà Nẵng để xác định thành phần hóa học.
Kết quả xác định thành phần hóa học trong dịch chiết rễ dừa cạn hoa trắng bằng phương pháp GC-MS được thể hiện trong phổ đồ hình 3.12
Hình 3.12. Phổ đồ của dịch chiết rễ dừa cạn hoa trắng
Kết quả định danh một số thành phần hóa học trong rễ của cây dừa cạn hoa trắng được thể hiện trong bảng 3.8
Bảng 3.8. Một số thành phần hóa học trong dịch chiết rễ cây dừa cạn hoa trắng STT Thời gian lƣu Hàm lƣợng (%)
Định danh Công thức cấu tạo
1 12,469 3,95 n-Hexadecanoic acid C16H32O2 O OH 2 14,143 4,34 Cis-Vaccenic acid C18H33O2 O H O 3 15,135 1,37 1-Hydroxy-3 methyl- 9Hcarbazol C13H11NO N H OH 4 17,118 2,12 Heneicosane C21H44 5 17,484 1,73 1-(2-Napthyl)-3-(2-
thienyl) prop-2-en-1-one C17H12OS S O 6 17,915 16,79 - Tên hóa học: 2, 20- Cycloaspidospermidine- 3-carboxylic acid, 6,7- didehydro-,methylester, (2.alpha. , 3.alpha.,5.alpha.,12 .beta., 19.alpha., 20R)- - Tên gọi khác: Vindolinine NH N O O 7 18,078 2,13 8-Methyl-3-phenyl-5- quinolinecarboxylic acid C17H13NO2 N OH O 8 25,207 7,78 -Tên hóa học: Oxayohimban-16- carboxylic, 16,17-
didehydro-19-methyl-, methyl ester, (19.alpha., 20.alpha.)- -Tên gọi khác: Tetrahydroalstonin O O CH3 O CH3 N N H 9 26,011 1,03 Campesterol C28H48O O H 10 26,637 15,13 Ajmalicine C21H24N2O3 N O O O NH 11 28,044 2,21 Gamma-sitosterol