Trong bánh men thuốc bắc, thấy có nhiều loài vi khuẩn phát triển. Trước đây
chủ yếu là vi khuẩn lactic và acetic. Các loài vi khuẩn này thường làm chua môi trường. Thời gian đầu quá trình lên men, quá trình này xảy ra là có lợi vì pH môi
trường do chúng tạo ra sẽ thích hợp cho nấm men và nấm sợi phát triển. Tuy nhiên pH xuống quá thấp lại ảnh hưởng xấu cho quá trình lên men. Mặt khác trong giai
đoạn sau, nếu dịch lên men có oxy thì vi khuẩn acetic sẽ oxy hóa rượu thành acid
acetic, làm giảm lượng côổn tạo thành; không có lợi. Ngày nay, bằng phân lập, người ta thu được và bổ sung vào chế phẩm bánh men nhiều chủng giống vi khuẩn
có khả năng chuyển hóa tỉnh bột thành đường: Ö. subilis, B. diastaticus... [ 14]
Hình 2.7: Vi khuẩn Bacillus Subtilis
CHƯƠNG 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
3.1 NGUYÊN LIỆU 3.1.1 Nguyên liệu chính
Gạo: sử dụng loại gạo Tài Nguyên nở xốp, được mua một lần tại chợ Bà
Chiểu.
Yêu cầu kĩ thuật: gạo trắng, không ẩm mốc, không có côn trùng, không mối
mọt, không có tạp chất lạ (cát, sạn...). 3.1.2 Nguyên liệu phụ
- Bánh men giống: sử dụng bánh men rượu Bầu Đá, thu thập ở Bình Định.
- Chủng giống nấm mốc Mucor của phòng thí nghiệm. - Các vị thuốc bắc: sử dụng bài thuốc 8 vị bắc:
1-Nhục đậu khấu 3g 5-Cam thảo 3g
2-Bạch truật 2g 6-Bạc hà 28
3-Nhục quế 2g 7-Tế tân 3g
4-Thảo quả 3g §-Tiểu hồi 3g - Nước: sử dụng nước sạch của phòng thí nghiệm.
3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2.1 Mục đích của quá trình nghiên cứu
Các phương pháp sẳn xuất rượu theo qui mô công nghiệp: phương pháp
amylose, mycomalt, hay dùng chế phẩm enzym... yêu cầu điều kiện vô trùng
nghiêm ngặt, chỉ thích hợp cho qui mô lớn, hiện đại. Trong khi đó, việc sẳn xuất
rượu gạo theo phương pháp truyền thống bằng chế phẩm bánh men thuốc bắc không đòi hỏi điều kiện nghiêm ngặt về vi sinh, thiết bị đơn giản, dễ thực hiện, lại
thu được rượu có hương vị thơm ngon.
Do đó với để tài này chúng tôi tiến hành sản xuất bánh men thuốc bắc, sau đó tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến qui trình sẳẩn xuất rượu gạo từ bánh men đã sản xuất. Từ đó tiến tới hoàn thiện qui trình để thu được rượu có
nồng độ cồn cao, có thể ứng dụng sắn xuất rượu qui mô vừa và nhỏ.
3.2.2 Sơ đô nghiên cứu
Tổng quan tài liệu, lựa chọn bánh men Phân lập, định lượng, vi sinh vật trong bánh men
Lựa chọn chủng giống và giữ giống
Sản xuất bánh men từ chủng giống đã chọn và chủng Mucor của phòng thí nghiệm
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình
sản xuất rượu gạo bằng chế phẩm bánh men đã làm
Kết luận và kiến nghị
Hình 3.1: Sơ đồ nghiên cứu
3.2.2.1 Tổng quan tài liệu, lựa chọn loại bánh men
Trong giai đoạn này, chúng tôi tìm hiểu về nguyên liệu, phương pháp và
các hóa chất cần thiết để tiến hành thí nghiệm. Đồng thời chúng tôi thu thập, tổng hợp, so sánh các kết quả nghiên cứu có liên quan đến quá trình sẳn xuất rượu gạo theo phương pháp truyền thống.
3.2.2.2. Phân lập, định lượng vì sùnh vật trong bánh men
Chúng tôi tiến hành phân lập, định tính sơ bộ hệ vi sinh vật có trong mẫu
bánh men. Đồng thời tiến hành định lượng để xác định tỉ lệ vi khuẩn, nấm mốc và
nấm men có trong bánh men.
3.2.2.3. Lựa chọn chủng giống và giữ giống
Xác định khả năng phân giải tinh bột của những chủng giống phân lập
được, xem xet chọn ra chủng giống tốt nhất. Sau đó, tiến hành làm môi trường thích hợp để giữ những giống đã chọn, dùng cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.2.4. Sản xuất bánh men từ những chủng giống được chọn
Tiến hành sản xuất bánh men từ những chủng giống được lựa chọn, đồng thời bổ sung chủng giống mốc Mucor của phòng thí nghiệm.
3.2.2.5. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sản xuất rượu gạo
Sử dụng bánh men vừa sản xuất, chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình sản xuất rượu gạo với hàm mục tiêu là nồng độ
ethanol trong rượu thành phẩm:
_ Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ men giống:
Giữ cố định các thông số nêu trên, thay đổi tỉ lệ men giống dùng lên men để xác định tỉ lệ thích hợp. Hàm mục tiêu: nồng độ ethanol tạo thành.
* Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ nước cho vào trước lên men ẩm và sau lên
men ẩm:
Thời gian lên men ẩm, thời gian lên men lỏng, tỉ lệ men giống vừa chọn sẽ sử dụng trong thí nghiệm này để khảo sát hàm ẩm trước lên men ẩm và lượng nước cho vào để lên men lỏng. Hàm mục tiêu: nông độ ethanol tạo thành.
vé Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên men ẩm và thời gian lên men lỏng:
Với tỉ lệ giống thích hợp vừa chọn được ở thí nghiệm trên, tiến hành lên
men rượu với thời gian lên men ẩm và thời gian lên men lỏng lần lượt thay đổi.
Giữ cố định các thông số còn lại. Hàm mục tiêu: nồng độ ethanol tạo thành.
v_ Khảo sát ảnh hưởng của SO; cho vào sau lên men ẩm:
Sau quá trình lên men ẩm, tiến hành sunfit hóa dịch thu được, khảo sát sự
ảnh hưởng đến nồng độ ethanol và độ chua của sản phẩm.
3.2.3 Qui trình sản xuất rượu từ bánh men thuốc bắc trong nghiên cứu Bánh men T giống Bột gạo Nghiên Trộn men Nghiên Làm ẩm Tạo hình - Hong khô Làm sạch Ĩ Nấu Bánh Ta€e1 Làm nguội Nghiên mịn Trộn men Lên men ẩm Lên men lỏng Chưng cất Hoàn thiện Rượu trắng
Hình 3.2: Qui trình sẵn xuất rượu từ bánh men thuốc bắc trong nghiên cứu Thuyết minh qui trình: các quá trình sẳn xuất tương tự các quá trình đã trình bày ở chương 2 (2.3.1.1 trang 5 và 2.3.1.2 trang 8).
3.2.4 Các phương pháp phân tích 3.2.4.1. Các phương pháp vi sinh [II]
s* Phân lập vi sinh vật: sử dụng phương pháp dàn đều vi sinh vật.
Nguyên lí: một lượng nhỏ vi sinh vật đã được pha loãng trước được dàn đều lên trên bể mặt hộp peptri có chứa môi trường dinh dưỡng thích hợp.
Tiến hành: môi trường agar nóng chảy được đổ vào hộp peptri vô khuẩn, để
cho đặc lại. Dùng pipet hút 0.Iml dung dịch hỗn hợp vi sinh vật cần phân lập ở các nông độ khác nhau cho vào các hộp peptri chứa môi trường agar ở trên; sau đó dùng que trang vô khuẩn dàn đều ra khắp bể mặt. Lật ngược hộp peptri để nuôi trong tủ ấm ở 35C. Sau khoảng 48 giờ, tách rời các khuẩn lạc trên môi trường
đặc.
+* Định lượng vỉ sinh vật: dùng hai phương pháp:
Phương pháp đổ hộp
Nguyên lí: cấy một thể tích xác định mẫu huyễn phù vi sinh vật lên môi
trường thạch trong hộp peptri. Môi trường được chọn có cơ chất đặc hiệu cho loài
vi sinhv ật cần định lượng. Sau một khoảng thời gian nuôi cấy, đếm số khuẩn lạc
phát triển trên các môi trường và dựa vào tỉ lệ pha loãng cùng thể tích ban đầu
đem cấy để suy ra số lượng khuẩn lạc có trong Iml mẫu. Nếu loài vi sinh vật là đơn bào, dạng riêng lẽ, có thể xem mỗi khuẩn lạc là kết quả của sự phát triển từ một tế bào.
Tiến hành: dùng 3 môi trường sau để định lượng nấm men, nấm mốc và vi
khuẩn tương ứng.
Môi trường cho nấm men: môi trường thạch malt.
Dịch chiết malt8°Bx: I1 lít
A8ar: 20g
Môi trường cho vi khuẩn: thạch thịt — peptone.
Cao thịt: 10g
Peptone: 10g
NaC]: 5g
Agar: 20g
Nước cất: l lít.
Môi trường cho nấm mốc: thạch Czapec.
Saccharose: 30g
Agar: 18— 20g
Dung dịch A: 50ml Dung dịch B: 50ml
Dung dịch A; - NaNOa 40g Dung dịch B:- KạHPO, 20g
- KCI 10g L Nước cất 1 lít
-MgSO,7HO 10g
- FeSO¿ 0.2g
- Nước cất 1 lít
Các môi trường đều được tiệt trùng ở 121C, 15 phút.
Phương pháp đếm số tế bào vi sinh vật bằng buồng đếm;
Dùng buông đếm Thoma xác định nhanh số vi khuẩn và nấm men sau nhân
giống.
Cấu tạo buồng đếm Thoma: là một phiến kính dày hình chữ nhật, có đục
các rãnh sonh song, chia bể mặt thành 3 khoang A, B, C. Chiều cao khoang B thấp
hơn khoang A và C một đoạn h. Giá trị h được gọi là chiều cao buông đếm.
Khoang B được chia thành hai khoang nhỏ Bị và B; nhờ một rãnh đục song song
với chiều dài của bể mặt buồng đếm. Trên mỗi khoang nhỏ, người ta kẻ các lưới đếm (hình vẽ). Lưới đếm của buồng đếm Thoma gồm 16 ô vuông lớn và trong
mỗi ô vuông lớn lại được thành 16 ô vuông nhỏ hơn.
A C : riilli#tse L_Y vy x Y | Hình3.3: Buông đếm Thoma.
Cách thực hiện: dùng lá kính đậy lên lưới đếm, dùng ngón tay ép chặt vào
bể mặt hai khoang A và C. Dùng pipet cho mẫu đã pha loãng vào mép giữa
buồng đếm. Sau 3-5 phút, đếm số tế bào vi sinh vật bằng kính hiển vi (độ phóng đại: 400 lần).
s* Giữ giống vi sinh vật:
Chuẩn bị ống thạch nghiêng chứa môi trường agar đông đặc.
Cấy chuyển vi sinh vật sang ống nghiệm và để một thời gian ở nhiệt độ tối ưu cho vi sinh vật phát triển.
Sau đó đem bảo quản ở nhiệt độ lạnh (khoảng 4°C).
% Phương pháp xác định khả năng thủy phân tỉnh bột:
Xác định bằng đường kính vòng phân giải tinh bột của các chủng trên môi
trường thạch đĩa có chứa tinh bột
Cho 1-2 ml nước vô khuẩn vào ống giống chứa vi sinh vật, lắc nhẹ, dùng que cấy điểm chấm nhẹ vào dịch. Đặt hộp petri chứa môi trường để úp, cấy 1 điểm
vào giữa hộp. Nuôi trong tủ tại nhiệt độ phòng, quan sát sau 3 ngày, cho dịch lugol
vào thử, chủng nào có vòng phân giải tinh bột chứng tỏ có enzym amilaza thủy phân tỉnh bột; đồng thời dựa vào đường kính vòng phân giải tinh bột và đường
kính khuẩn lạc để xác định hoạt tính enzym
Dung dịch lugol được pha như sau: hòa 2g KI trong 5ml nước cất cho tan hết, sau đó cho thêm Ig I; vào, sau đó cho nước cất đến đủ 300ml, lắc đều.
3.2.4.2. Các phương pháp hóa lí +* Xác định độ ẩm:
Dùng máy đo độ ẩm SCALTEC SM 01.
+* Xác định pH:
Dùng máy đopH MP220-METTLER TOLEDO.
s* Xác định nông độ chất khô: Dùng khúc xạ kế (Bx).
s* Xác định độ rượu:
Dùng phương pháp chưng cất và đo tỷ trọng.
Xác định nông độ rượu trong dịch giấm sau lên men:
Bình tỷ trọng đem sấy khô, làm nguội trong bình hút ẩm, cân được khối
lượng mụ.
Cho nước cất 20°C vào bình, cân được khối lượng mị.
Dùng bình định mức lấy 100ml dịch giấm chín cho vào bình cầu có dung
tích khoảng 500ml. Tráng bình định mức bằng nước cất và định mức đến
100mI, cho vào bình cầu. Tiến hành chưng cất, thu ~ 100ml dịch cất thì ngưng.
Giữ nhiệt độ dịch cất ở 20°C trong 15 phút và định mức thành 100ml cũng bằng
nước cất 20°C. cho dịch cất 20C vào bình tỷ trọng, cân được khối lượng mạ. Tính tỷ số: đ= Ơn tra phụ lục của tài liệu [14], xác định được nồng
— Họ độ rượu.
Xác định nông độ rượu trong hèm sau lên men ẩm: cân 100g hèm sau lên
men ẩm cho vào bình cầu. Cho thêm 100ml nước cất rồi tiến hành chưng cất. Các bước khác tiến hành tương tự như trên.
Xác định hàm lượng đường khử
Xác định đường khử bằng phương pháp quang phổ hấp thu:
a. Nguyên tắc dựa trên phẩn ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử
đinitro salycilic (DNS):
3 CaH¡¿O¿ + (NO,);C¿H;(COOH)OH + 4NaOH —>
(NO2);C¿H;(COONa)OH + 3 C;H¡;COONa + 3 HO
Cường độ màu tỉ lệ thuận với nỗng độ đường khử trong một phạm vi
nhất định. Dựa theo đổ thị đường chuẩn của glucose tỉnh khiết với thuốc thử
suy ra hàm lượng đường khử trong mẫu nghiên cứu.
b. Hóa chất sử dụng
NaOH rắn, Natri kali tartrat rắn và glucose chuẩn dạng rắn do Trung
Quốc sản xuất; acid DNS (2,4 - dinitro salycilic) rắn do Merk sản xuất.
c. Phương pháp pha thuốc thử
— Hòa tan Ig DNS trong 20ml dung dịch NaOH 1.6M.
— Hòa tan 30g muối Natri kali tartrat trong 50ml nước cất.
— Hòa tan hai dung dịch trên vào nhau và khuấy đều cho đến khi DNS tan
hoàn toàn, định mức thành 100ml.
—. Bảo quần trong lọ sẫm màu ở nhiệt độ ở nhiệt độ thấp, từ 5-10°C. Thời gian bảo quần không quá 2 tuần.
d. Xây dựng đường chuẩn
Chuẩn bị dãy ống nghiệm theo bắng sau (ml): STT Mẫu trắng 1 2 3 4 5 Dd glucose 0 2 0.4 0.6 0.8 1 Nước cất 3 28 | 26 | 24 | 242 2 Thuốc thử DNS I 1 1 l l I
Đun cách thủy các ống mẫu chuẩn và mẫu trắng ở 100C trong 5 phút. Sau
đó, làm nguội đến nhiệt độ thường.
Đo độ hấp thu OD ở bước sóng 540nm.
Vẽ đồ thị OD = f(C), ta có đường chuẩn glucose. e. Xác đinh hàm lượng đường khử trong mẫu
Pha loãng mẫu đến nồng độ thích hợp sao cho nồng độ đường khử của mẫu
nằm trongkhoảng nông độ của đường chuẩn. Tiến hành đo như các bước ở trên.
Xác định nồng độ đường khử x (g/1) trong mẫu pha loãng bằng phương pháp nội suy từ đường chuẩn.
Hàm lượng đường khử X (g/1) trong mẫu ban đầu là: X(g/)=x*f
Trong đó: f là hệ số pha loãng.
+* Xác định hàm lượng tỉnh bột
Luận
Lấy 50ml dịch giấm chín, 50ml nước cất và 6ml HCI đậm đặc cho vào bình
tam giác 250.
Nối bình với ống sinh hàn khí, đun cách thủy trong 2 giờ. Làm nguội đến nhiệt độ phòng.
Trung hòa bằng NaOH 10% cho đến khi giấy quì có màu xanh lơ. Chuyển vào bình định mức 250ml và định mức bằng nước cất, lọc.
Tiến hành đo nồng độ đường khử bằng phương pháp DNS, sau đó tính lại hàm lượng tinh bột sót
CHƯƠNG 4 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Chủng giống bánh men là một trong yếu tố cực kỳ quan trọng quyết định chất
lượng rượu, nồng độ rượu. Việc lựa chọn loại bánh men giống là bước đâu tiên vô
cùng cần thiết.
Trong nghiên cứu trước đã khảo sát 6 loại bánh men giống thu thập từ 6 địa
phương khác nhau trên thị trường (Long Xuyên —- Vĩnh Long - Cần Giuộc - Gò Đen — Bình Định - Hà Nội). Kết quả thí nghiệm chọn được bánh men rượu Bầu Đá của
Bình Định là mẫu bánh men cho hiệu suất lên men cao nhất, đồng thời rượu cất được có hương vị tốt nhất. Do đó, chúng tôi chỉ tiến hành các thí nghiệm với mẫu
bánh men rượu của Bình Định như đã chọn.
4.1 KHẢO SÁT HỆ VI SINH VẬT TRONG BÁNH MEN
4.1.1 Phân lập và định lượng hệ vi sinh vật trong bánh men
Đầu tiên chúng tôi tiền hành phân lập và định lượng lại hệ vi sinh vật trong
bánh men. Sử dụng các môi trường tối ưu cho vi khuẩn, nấm mốc và nấm men (
3.2.1 trang 27), chúng tôi tiến hành phân lập hệ vi sinh vật trong bánh men thành những khuẩh lạc riêng biệt, sau đó tiến hành làm tiêu bản và quan sát dưới kính hiển
VỊ.
Kết quả thu được như sau:
Bảng 4.1: Các chẳng vi khuẩn phân lập được từ bánh men rượu Bầu Đá
Khuẩnh lạc ¿ Chúng vi Hình tế bà Kí hiệu Hình dạng ình dạng tế bào | sình vật Đối á à, hình h lễ 3
VKI răng cưa, bề mặt có khía tròn Ôm trắng ngà, hình hoa, viễn Hình que Vi khuẩn