1.9.1. Quy trình sản xuất glu.HCl của Trần Thị Luyến [3]
Để khử khoáng, vỏ tôm được ngâm trong HCl 10%, tỷ lệ w/v = 1/10, ở
nhiệt độ phòng trong thời gian 5 giờ, sau đó vớt ra rửa sạch đến pH=7. Sau đó khử protein kết hợp deacetyl hóa trong NaOH 40%, tỷ lệ w/v = 1/10, ở nhiệt độ
95 - 1000C trong thời gian 6,5 giờ. Tẩy màu rửa sạch, sấy khô. Chitosan được
đun trong HCl 35%, tỷ lệ w/v = 1/4, ở nhiệt độ 95 - 1000C trong thời gian 4 giờ. Sau đó lọc bỏ cặn, làm lạnh 0 - 20C trong thời gian 2 giờ khi đó kết tinh sẽ xuất hiện. Lọc tách kết tinh, hòa tan trong nước cất, khử màu qua than hoạt tính, cô cạn và lại thực hiện kết tinh. Sau khi kết tinh lần cuối (khoảng 3 lần), tinh thể
trắng, lọc lấy tinh thểđem rửa lại bằng cồn, sau đó sấy khô ở 50 - 600C.
1.9.2. Quy trình sản xuất glu.HCl của Đỗ Đình Rãng [14]
Vỏ tôm khô, sạch, nghiền thành bột, sau đó đun sôi nguyên liệu với nước trong 2 giờ và gạn bỏ protein, sấy khô. Nguyên liêu khô đun trong HCl 5% tách khoáng, rửa sạch đến pH=7 và sấy khô. Khử hoàn toàn protein trong NaOH 5%,
http://www.ebook.edu.vn
phớt hồng. Từ chitin để chuyển hóa thành glucosamin bằng cách thủy phân trong dung dịch axit HCl đậm đặc 36%, ở nhiệt độ 1000C, tẩy màu băng than hoạt tính,
để kết tinh và lọc. Sấy khô, thu được tinh thể glucosamin hydroclorua trắng. Hiệu suất quá trình 51,4%.
http://www.ebook.edu.vn
Chương II : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.Đối tượng nghiên cứu
*Vật liệu:
Vỏ tôm *Hóa chất:
Sử dụng các loại hóa chất tinh khiết như axit hydroclorua (HCl), natri hydroxit (NaOH), kali permanganat (KMnO4), axit oxalic (C2H2O4), oxi già (H2O2), axit acetic CH3COOH, ngoài ra còn có các dung môi khác như nước cất, methanol, ethanol…
*Dụng cụ thí nghiệm:
Bình tam giác, bình cầu cổ nhám, cốc thủy tinh, cân phân tích, nhiệt kế, thiết bị đo điểm nóng chảy, tủ sấy, bình hút ẩm, thiết bị gia nhiệt, khuấy từ, sinh hàn hồi lưu, dụng cụ lọc…
2.2. Phương pháp nghiên cứu
1. Sử dụng các phương pháp chiết tách hóa học để tách chiết vỏ tôm thu
được chitin và deacetyl hóa chitin trong dung dịch NaOH đậm đặc thu
được chitosan.
2. Tổng hợp glucosamin hydroclorua từ chitin và chitosan.
3. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng tới phản ứng như: thời gian phản ứng, nhiệt độ phản ứng và nồng độ tác nhân tác nhân phản ứng.
4. Kiểm tra cấu trúc của sản phẩm điều ra thông qua các loại phổ như : IR, 1H-NMR, 13C-NMR tại Viện Hóa Học – Viện Khoa Học Việt Nam. So sánh với các số liệu phổđã công bốđể xác định cấu trúc sản phẩm.
- Đo phổ IR trên máy FTR – IMPACT 410 của hãng Nicolet.
- Đo phổ 1H – NMR và 13C – NMR trên máy Bruker AC- 500MHz trong dung môi D2O.
http://www.ebook.edu.vn
5. Kiểm tra, đo một số thông số như nhiệt độ nóng chảy trên máy Boetius – MK (Đức).
6. Xác định độẩm bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi. 7. Phưong pháp xác định hàm lượng chất không tan.
a) Nguyên lý: Chitosan tan được trong axit acetic loãng, còn chitin và các tạp chất khác thi không tan.
b) Tiến hành : Cân chính xác a gam chitosan hoà tan trong dung dịch axit acetic 1%, khuấy đảo 60 phút cho chitosan tan hết rồi lọc, rửa cặn bằng axit acetic loãng, sau đó rửa lại bằng nước cất và đem sấy khô đến khối lượng không
đổi.
Hàm lượng chất không tan được tính theo công thức:
(%) 100 * (%) a B A X = − Trong đó:
A : khối lượng phễu lọc + giấy + tạp chất sau khi sấy (g). B : khối lượng phễu lọc + giấy lọc trước khi sấy (g). a : khối lượng chitosan sử dụng (g).
X : Hàm lượng chất không tan (%).
8. Phương pháp xác định hiệu suất quá trình bằng phương pháp trọng lượng.
http://www.ebook.edu.vn
Chương III : THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1.Quy trình điều chế chitin, chitosan và glucosamin hydroclorua (glu.HCl)
Sơđồ 3.1: Quy trình điều chế chitin, chitosan và glu.HCl từ vỏ tôm
Vỏ tôm sạch
Ngâm trong HCl 10%, Ts = 12 giờ, T0 = t0 phòng
Rửa trung tính
Đun trong NaOH 3%, Ts = 3,5 - 4 giờ, T0 = 90 - 950C
Rửa trung tính
1.Ngâm trong hỗn hợp KMnO4 + C2H2O4. Hoặc 2.Ngâm trong H2O2 1%. Chitin trắng sạch Loại Khoáng Loại Protein Rửa sạch, sấy khô ở T0 = 600C Đun trong NaOH 50%, Ts = 4 giờ, T0=110 - 1200C Chitosan Đun trong HCl 36%, TT0= 90-95% s= 4 giờ, Glucosamin hydroclorua Rửa trung tính, sấy khô Tẩy màu, lọc, sấy khô
http://www.ebook.edu.vn
3.2. Điều chế chitin từ vỏ tôm
Cân 40g vỏ tôm khô cho vào cốc 1lít, sau đó cho từ từ 200ml HCl 10% vào và để ngập toàn bộ vỏ tôm, nhận thấy có hiện tượng sủi bọt mạnh chứng tỏ
có phản ứng xẩy ra, kiểm tra pH=1 - 2 là được, ngâm trong khoảng 12 giờ (để
qua đêm) và để ở nhiệt độ phòng, thỉnh thoảng lại khuấy để cho phản ứng xảy ra nhanh hơn (đến khi không thấy bọt, khí thoát ra, thử pH vẫn còn axit).
Sau 12 giờ, vớt vỏ tôm ra và rửa lại bằng nước thường đến pH=7, sau đó rửa bằng nước cất. Lúc này vỏ tôm có màu hồng nhạt và mềm do đã được loại hết các tạp chất vô cơ.
Vỏ tôm thu được để ráo bớt nước sau đó cho vào bình cầu 500ml, đồng thời cho NaOH 3% vào cho đến khi ngập hoàn toàn vỏ tôm và kiểm tra pH= 11- 12 là đạt yêu cầu. Đun ở nhiệt độ 90 - 950C trong khoảng 3,5 - 4 giờ, lúc đun có lắp sinh hàn để tránh hiện tượng trào bọt ra ngoài và mùi khó chịu. Sau khi phản
ứng kết thúc đem sản phẩm đi rửa bằng nước thường đến pH=7, sau đó tráng lại bằng nước cất. Sản phẩm thu được có màu trắng phớt hồng.
Chất màu (astaxanthin) có trong chitin được loại bỏ theo 2 phương pháp: 1. Cho 10ml dung dịch KMnO4 1% vào trong bình đựng chitin ở trên,
sau đó trộn đều với nhau, để trong thời gian 1 giờở nhiệt độ phòng. Sau 1 giờ, rửa sạch sản phẩm, nhận thấy sản phẩm có màu tím đen chứng tỏ vẫn còn nhiều KMnO4 chưa được rửa sạch. Để loại hết KMnO4 ta dùng 50ml axit Oxalic HOOC-COOH 1%, nhận thấy nếu
để ở nhiệt độ phòng thì khó loại hết màu tím, ta đem đun nóng ở
nhiệt độ 50 - 600C thì màu mất hoàn toàn, rửa sạch thu được sản phẩm có màu trắng đẹp.
2. Ngâm ngập chitin bằng 60ml H2O2 1%, để qua đêm ở nhiệt độ
phòng. Sản phẩm sau khi ngâm tuy màu đã bớt nhiều nhưng vẫn còn thấy hơi phớt hồng, rửa sạch bằng nước, tráng lại bằng nước cất.
Sấy khô sản phẩm ở nhiệt độ 600C, thu được chitin trắng sạch. Hiệu suất quá trình điều chế chitin được tính theo công thức sau:
http://www.ebook.edu.vn 2 1 1 (%) m *100% H m = Trong đó :
m1: số gam của vỏ tôm ban đầu (g).
m2: số gam chitin thu được (g).
H1(%) : hiệu suất của quá trình (%). Kết quả thu được như bảng 3.1:
Bảng 3.1. Hàm lượng chitin trong vỏ tôm
STT Vỏ tôm (g) Chitin (g) Hiệu suất (%) 1 40 10,87 27,18 2 40 13,67 32,73 3 40 12,27 30,68 4 40 14,33 35,83 5 40 13,09 34,65
3.3.Điều chế chitosan bằng cách deacetyl chitin
Từ chitin điều chế trên, cân lượng chính xác 10g chitin cho vào bình cầu 500ml, sau đó cho 350ml dung dịch NaOH 50% cho đến ngập hoàn toàn chitin.
Đun ở nhiệt độ 110 - 1200C, có hồi lưu tránh bay hơi dung môi, bay mùi khó chịu, thỉnh thoảng có khuấy cho phản ứng xảy ra nhanh, thời gian đun là 4 giờ. Sản phẩm sau phản ứng được rửa sạch đến pH=7, rửa lại bằng nước cất, sấy khô. Sản phẩm thu được là chitosan có màu trắng.
Hiệu suất quá trình điều chế chitosan được tính theo công thức:
4 2 3 (%) m *100% H m = Trong đó:
m3: khối lượng chitin tham gia phản ứng (g).
m4 : khối lượng sản phẩm chitosan thu được(g).
H2(%) : hiệu suất của quá trình (%). Kết quả thu được ở bảng 3.2:
http://www.ebook.edu.vn Bảng 3.2. Hiệu suất điều chế chitosan từ chitin STT Chitin (g) Chitosan (g) Hiệu suất (%) 1 10 6,33 63,3 2 10 6,56 65,6 3 10 7,23 72,3 4 10 7,0 70,0 5 10 7,47 74,7 Tinh chế chitosan
Cân 5g chitosan cho vào cốc thủy tinh 1lít, sau đó cho 300ml axit acetic CH3COOH 1%, khuấy ở nhiệt độ thường trong thời gian 30 phút thu được dung dịch trong suốt. Dung dịch được đem đi lọc bỏ cặn bẩn.
Sau đó cho 30 ml NaOH 10% vào, khuấy đều trong 10 phút thu được dung dịch keo. Lọc lấy kết tủa keo và rửa 3 lần bằng methanol (5ml/lần).
Cho kết tủa keo bào bình cầu 250ml, thêm 140ml CH3OH và đun ở nhiệt
độ 60 - 650C trong thời gian 5 giờ. Lọc và rửa bằng aceton 2 lần, sau đó sấy khô
ở 400C. Thu được 4,2g chitosan tinh khiết. Hiệu suất 84%.
3.4.Điều chế glu.HCl
3.4.1.Điều chế glu.HCl từ chitin
Cân 5g chitin khô (đã cắt nhỏ) cho vào bình cầu 250ml, sau đó thêm 40ml HCl 36%. Đun cách thủy có lắp sinh hàn hồi lưu, khuấy đều và duy trì ở nhiệt độ
khoảng 90 - 950C. Khi nhiệt độ hỗn hợp trong bình phản ứng đạt 65 - 700C thì chitin bắt đầu tan rất nhanh tạo thành dung dịch màu nâu đen. Đun trong thời gian 4giờ.
Kết thúc thời gian phản ứng, sản phẩm được lọc nóng để loại bỏ cặn bẩn, sau đó dịch lọc được tẩy màu bằng 1g than hoạt tính, giai đoạn này được hỗn hợp
được đun nóng đến 900C, sau đó duy trì ở nhiệt độ 50 - 600C trong thời gian 30 phút.
http://www.ebook.edu.vn
Lọc bỏ than hoạt tính thu được dung dịch có màu xanh nhạt trong suốt, để
nguội thu được dung dịch có màu vàng rơm. Dung dịch để nguội lạnh ở nhiệt độ
0 - 40C, thời gian để kết tinh là 12 giờ (để qua đêm).
Tinh thể glu.HCl được tách ra bằng phương pháp lọc, sau đó rửa lại sản phẩm thu được bằng cồn 960. Sản phẩm được sấy khô ở nhiệt độ 600C thì thu
được tinh thể glu.HCl khô trắng đẹp.
Dịch lọc còn lại sau khi lọc kết tinh được cô bớt dung môi bằng cất chân không ở nhiệt độ 60 - 650C, đến khi thể tích bằng 1/3 thể tích đem cô ban đầu, để
kết tinh và lọc lấy kết tinh, rửa bằng cồn 960, sấy khô.
Hiệu suất của quá trình điều chế glu.HCl từ chitin được tính theo công thức sau: 6 7 3 5 (%) m m *100% H m + = Trong đó :
m5: khối lượng chitin ban đầu (g).
m6 : khối lượng glu.HCl kết tinh lần thứ nhất (g).
m7: khối lượng glu.HCl kết tinh lần thứ hai (g).
H3(%): hiệu suất của quá trình (%). Kết quả thu được ở bảng 3.3:
Bảng 3.3. Hiệu suất điều chế glucosamin hydroclorua từ chitin STT Chitin (g) Glu.HCl (g) Hiệu suất (%)
1 5 3,12 62,4
2 5 3,14 62,8
3 5 3,10 62,0
3.4.2.Điều chế glu.HCl từ chitosan
Cân 5 gam chitosan cho vào bình cầu 250ml, thêm từ từ 40ml axit HCl 36% vào bình, sau đó thực hiện các thao tác tương tự như phần 3.4.1 trên.
Tính thời gian phản ứng khi chitosan bắt đầu tan vào dung dịch. Đun được 1 giờ thì nhận thấy dung dịch có độ nhớt cao, đun tiếp đến 3 giờ thì thu được dung dịch đặc quánh. Kết thúc thời gian phản ứng, cho thêm 20ml nước cất vào
http://www.ebook.edu.vn
để pha loãng dung dịch rồi đem lọc lấy dung dịch nước cái. Dung dịch có màu nâu đen được tẩy màu bằng than hoạt tính. Do có pha loãng dung dịch, lượng nước đưa vào tương đối nhiều nên để có kết tinh cần phải cô bớt dung môi đến thể tích 1/5 thể tích dung dịch ban đầu. Sau khi cô, dung dịch được để nguội lạnh
ở nhiệt độ 0 - 40C qua đêm. Nhận thấy có rất ít tinh thể glu.HCl được tạo thành, hầu như là không đáng kể. Lọc lấy kết tinh, rửa lại bằng cồn, sấy khô.
Hiệu suất của quá trình điều chế glu.HCl từ chitin được tính theo công thức sau: % 100 * (%) 8 9 4 m m H = Trong đó :
m8 : khối lượng chitosan ban đầu (g). m9 : khối lượng glucosamin thu được (g).
H4(%) : Hiệu suất quá trình (%). Kết quả thu được ở bảng 3.4:
Bảng 3.4. Hiệu suất điều chế glucosamin hydroclorua từ chitosan STT Chitosan (g) Glu.HCl (g) Hiệu suất (%)
1 5 0,5 10,0
2 5 0.35 7,0
3 5 0.6 12,0
3.4.3. Tinh chế glu.HCl
Cân 2g glu.HCl cho vào bình cầu 100ml, thêm dần 25ml cồn 960, đun sôi, có khuấy ở nhiệt độ 75 - 800C.
Sau khi hỗn hợp sôi, cho từ từ nước cất tối thiểu vào, cho đến khi glu.HCl tan hết (vẫn duy trì ở nhiệt độ sôi), lượng nước cất tối thiểu là 5,5 - 6ml cho 2g glu.HCl. Đun tiếp 60 phút, lọc nóng. Để kết tinh lại ở nhiệt độ 0 - 40C trong thời gian 4 giờ.
Tinh thể được lọc và rửa bằng cồn 960 (2 lần x 3ml), sấy khô ở nhiệt độ
http://www.ebook.edu.vn
kết tinh lại để thu thêm glu.HCl. Sản phẩm thu được có nhiệt độ nóng chảy 192 - 1940C.
Cấu trúc của glu.HCl điều chế ra đã được đo các loại phổ IR, 1H-NMR, 13C-NMR.
Phổ IR có các vạch đặc trưng sau: ν(OH…O) 3354,44(cm-1); ν(N-H) 3289.88(cm-1); ν(C-H) 2852,33-2945,58(cm-1); δ(OH phẳng) 1422,37(cm-1); δ(OH không phẳng) 1248,95(cm-1); ν(C-O) 1185,36(cm-1); ν(C-N) 1029,28(cm-1). • α-D-glucosamin hydroclorua O HO HO NH2.HCl OH OH 1 2 3 4 6 5 Phổ1H-NMR (500MHz, D2O, δ : ppm) 5,42 (d, J = 3,5Hz, 1H, H1); 3,3 (dd, J = 3,5Hz; 10,5Hz, 1H, H2); 3,5 – 3,9 (m, 4H, H3, H4, H5, H6). Phổ13C-NMR (125MHz, D2O, δ : ppm) 89,6 (C1); 54,7 (C2); 70,0 (C3); 70,2 (C4); 72,0 (C5); 60,8 (C6). • β-D-glucosamin hydroclorua O HO HO NH2.HCl OH OH 1 2 3 4 6 5 Phổ1H-NMR (500MHz, D2O, δ : ppm) 4,93 (d, J = 8,5Hz, 1H, H1); 2,98 (dd, J = 8,5Hz; 10,5Hz,1H, H2); 3,2 – 3,9 (m, 4H, H3, H4, H5, H6). Phổ13C-NMR (125MHz, D2O, δ : ppm) 93,1 (C1); 57,2 (C2); 72,5 (C3); 76,6 (C4); 70,2 (C5); 60,9 (C6).
http://www.ebook.edu.vn
http://www.ebook.edu.vn
http://www.ebook.edu.vn
http://www.ebook.edu.vn
3.6. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất điều chế glu.HCl từ chitin Tiến hành phản ứng như mục 3.4.1 làm trong bình cầu 250ml (5 lần) với mỗi lần 5g chitin, 40ml HCl 36%, nhiệt độ phản ứng 90 - 950C nhưng thực hiện với điều kiện thời gian khác nhau: • Lần 1: thời gian phản ứng 1giờ. • Lần 2: thời gian phản ứng 2 giờ. • Lần 3: thời gian phản ứng 3 giờ. • Lần 4: thời gian phản ứng 4 giờ. • Lần 5: thời gian phản ứng 5 giờ.
Kết quả thu được được trình bày trong bảng 3.5:
Bảng 3.5: Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất của phản ứng:
Ts(h) 1 2 3 4 5
Chitin(g) 5 5 5 5 5
Glu.HCl(g) 2,93 2,97 3,05 3,14 3,11
H(%) 58,6 59,4 61,0 62,8 62,2
3.7. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất điều chế glu.HCl từ chitin
Tiến hành phản ứng như mục 3.4.1 làm trong bình cầu 250ml (3 lần) với mỗi lần 5g chitin, 40ml HCl 36%, thời gian phản ứng 4 giờ nhưng thực hiện với
điều kiện ở những khoảng nhiệt độ khác nhau.
• Lần 1: khoảng nhiệt độ 25 - 300C (nhiệt độ phòng). • Lần 2: khoảng nhiệt độ 55 - 600C.
• Lần 3: khoảng nhiệt độ 90 - 950C.
http://www.ebook.edu.vn Bảng 3.6 : Ảnh hưởng của nhiệt độđến hiệu suất phản ứng: T0 (0C) 25 - 30 55 - 60 90 - 95 Chitin(g) 5 5 5 Glu.HCl(g) - 1,83 3,14 Hiệu suất (%) - 36,6 62,8 - : không xác định. 3.8. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ axit HCl đến hiệu suất điều chế glu.HCl từ chitin Tiến hành phản ứng như mục 3.4.1 làm trong bình cầu 250ml (3 lần) với lần 5g chitin, thời gian phản ứng 4giờ, nhiệt độ phản ứng 90 - 950C nhưng thực hiện trong điều kiện nồng độ axit hydrocloric khác nhau:
• Lần 1: Nồng độ axit HCl 10%.
• Lần 2: Nồng độ axit HCl 20%.
• Lần 3: Nồng độ axit HCl 36%.
Kết quả thu được được trình bày trong bảng 3.7:
Bảng 3.7.Ảnh hưởng của nồng độ axit HCl đến hiệu suất phản ứng. HCl (%) 10 20 36 Chitin (g) 5 5 5 Glu.HCl (g) - - 3,14 Hiệu suất (%) - - 62,8 - : không xác định.
http://www.ebook.edu.vn
Chương IV : KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
4.1.Điều chế chitin từ vỏ tôm
4.1.1. Quá trình khử khoáng
Trong vỏ tôm, thành phần khoáng chủ yếu là muối CaCO3, MgCO3 và rất