Theo Boenisch và ctv (2002) kháng thể thuộc nhóm protein gọi là globulin miễn dịch (immunoglobulin – Ig). Globulin miễn dịch gồm 5 nhóm chính, đƣợc xếp theo thứ tự giảm dần trong huyết thanh: IgG, IgA, IgM, IgD và IgE. Trong đó, IgG và IgM thƣờng đƣợc dùng trong hóa mô miễn dịch.
Có hai loại kháng thể
A B
Hình 2.5: Kháng thể đa dòng và kháng thể đơn dòng (Boenisch và ctv, 2002).
A: Kháng thể đa dòng gắn với các epitope khác nhau trên kháng nguyên B: Kháng thể đơn dòng phản ứng với một epitope đặc hiệu trên kháng nguyên
Kháng thể đa dòng (polyclonal antibodies): Đƣợc tạo ra bởi những tế
bào plasma khác nhau nên thƣờng không đồng nhất về hóa miễn dịch, chúng phản ứng với những epitopes khác nhau trên kháng nguyên đã kích thích tạo ra chúng. Động vật đáp ứng miễn dịch và tạo ra kháng huyết thanh bao gồm nhiều loại kháng thể đặc hiệu và không đặc hiệu. Kháng thể đa dòng dễ sản xuất hơn kháng thể đơn dòng nhƣng có khuyết điểm là ngay cả sau khi tinh sạch, kháng thể đa dòng vẫn có thể chứa những kháng thể phản ứng không đặc hiệu với kháng nguyên
Kháng thể đơn dòng (monoclonal antibody): Đƣợc tạo ra từ một dòng tế
bào plasma nên đồng nhất về hoá miễn dịch, chúng phản ứng với một epitope nhất định trên kháng nguyên đã kích thích tạo ra chúng. Ƣu điểm của kháng thể đơn dòng là độ đồng nhất cao, rất tinh khiết và đặc hiệu.
2.5.4. Các phƣơng pháp nhuộm (theo IHC world)
Có nhiều phƣơng pháp hóa mô miễn dịch có thể dùng để định vị kháng nguyên. việc lựa chọn phƣơng pháp thích hợp dựa trên các thông số nhƣ loại mẫu vật và độ nhạy yêu cầu (IHC world, 2005).
Â
Hình 2.6: Các phƣơng pháp nhuộm IHC
A: Phương pháp nhuộm trực tiếp B: Phương pháp nhuộm gián tiếp
C: phương pháp nhuộm ABC (Avidin – Biotin Complex) D: Phương pháp nhộm PAP (Peroxidase anti-Peroxidase) E: Phương pháp nhuộm LSAB
2.5.4.1. Phƣơng pháp trực tiếp
Phƣơng pháp trực tiếp là phƣơng pháp nhuộm màu một bƣớc và bao gồm kháng thể đƣợc đánh dấu phản ứng trực tiếp với kháng nguyên trên những vùng mô. Kỹ thuật này chỉ sử dụng một kháng thể và quy trình thực hiện thì ngắn và nhanh. Tuy nhiên, phƣơng pháp này không nhạy do sự khuếch đại dấu hiệu quá ít và cũng rất ít đƣợc sử dụng (Hình 2.7.A)
2.5.4.2. Phƣơng pháp gián tiếp
A B C
Phƣơng pháp gián tiếp bao gồm một kháng thể sơ cấp không đƣợc đánh dấu (lớp đầu tiên) phản ứng với kháng nguyên trên mô và một kháng thể thứ cấp đƣợc đánh dấu (lớp hai) phản ứng với kháng thể sơ cấp. Phƣơng pháp này nhạy hơn do sự khuếch đại dấu hiệu thông qua những phản ứng của kháng thể thứ cấp với những vị trí kháng nguyên khác nhau trên kháng thể sơ cấp. Thêm vào đó, phƣơng pháp này cũng rất kinh tế vì một kháng thể thứ cấp đƣợc đánh dấu có thể sử dụng với nhiều kháng thể sơ cấp cho những kháng nguyên khác nhau.
Kháng thể lớp thứ hai có thể đƣợc đánh dấu với thuốc nhuộm huỳnh quang nhƣ: FITC, rhodamine hay Texas red và phƣơng pháp gián tiếp này đƣợc gọi là phƣơng pháp miễn dịch huỳnh quang (immunofluorescent method). Kháng thể thứ hai có thể đƣợc đánh dấu với một enzyme nhƣ peroxidase, alkaline phosphatase hay glucose oxidase và phƣơng pháp này đƣợc gọi là miễn dịch enzyme (Hình 2.7.B)
2.5.4.3. Phƣơng pháp PAP (peroxidase anti – peroxidase method)
Phƣơng pháp PAP là một phƣơng pháp phát triển cao hơn phƣơng pháp gián tiếp. Phƣơng pháp này liên quan đến lớp thứ 3 là kháng thể thỏ gắn với peroxidase để tạo thành phức hợp peroxidase anti – peroxidase ổn định. Phức hợp này, bao gồm gaba – globulin thỏ và peroxidase, hoạt động nhƣ kháng nguyên lớp thứ 3 và có khả năng gắn kết kháng gaba – globulin thỏ ở dê không tiếp hợp của lớp thứ hai. Độ nhạy của phƣơng pháp này cao hơn từ 100 – 1000 lần vì phân tử peroxidase không tiếp hợp hóa học với kháng IgG nhƣng gắn kết miễn dịch và không làm giảm hoạt tính enzyme. Phƣơng pháp này cũng cho phép độ pha loãng của kháng thể sơ cấp cao hơn, do đó loại bỏ đƣợc nhiều kháng thể không mong muốn và giảm sự nhuộm màu nền không chuyên biệt. (Hình 2.7.C)
2.5.4.4. Phƣơng pháp avidin – biotin complex (ABC method)
Phƣơng pháp ABC là phƣơng pháp IHC chuẩn và là một trong những kỹ thuật đƣợc sử dụng rộng rãi trong việc nhuộm màu. Avidin, một glycoprotein lớn, có thể đƣợc đánh dấu bằng peroxidase hoặc fluorescent và có ái lực cao đối với biotin. Biotin, một vitamin có trọng lƣợng phân tử thấp, có khả năng tiếp hợp với nhiều phân tử sinh học khác nhau nhƣ là kháng thể
Kỹ thuật này liên quan đến 3 lớp. Lớp thứ nhất là kháng thể sơ cấp không đánh dấu. Lớp thứ hai là kháng thể thứ cấp đƣợc gắn với biotin. Lớp thứ ba là một
phức hợp của avidin – biotin peroxidase. Sau đó peroxidase đƣợc gắn bởi DAB hay các cơ chất khác để tạo những sản phẩm cuối cùng có màu sắc khác nhau.(Hình 2.7.D)
2.5.4.5. Phƣơng pháp đánh dấu Streptavidin Biotin (LSAB) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Streptavidin, có nguồn gốc từ streptococcus avidini, là một phƣơng thức
mới nhằm thay thế avidin. Phân tử streptavidin không có điện tích trên mô của động vật, không giống nhƣ avidin có điểm đẳng điện là 10 và do đó loại bỏ đƣợc sự gắn kết tĩnh điện với mô. Thêm vào đó, streptavidin không chứa các nhóm carbohydrate nên không gây ra sự gắn kết với mô lectin.
LSAB là kỹ thuật tƣơng tự nhƣ kỹ thuật ABC chuẩn. lớp đầu tiên là kháng thể sơ cấp không đánh dấu. Lớp thứ hai là kháng thể sơ cấp đƣợc đánh dấu bằng biotin. Lớp thứ ba là phức hợp enzyme và streptavidin (HRP – Streptavidin hoặc AP – Streptavidin) để thay thế cho phức hợp avidin – biotin peroxidase. Enzyme đƣợc quan sát bằng dung dịch chất tạo sắc để tạo ra những sản phẩm cuối có màu sắc khác nhau. Lớp thứ ba có thể đƣợc đánh dấu bằng fluorescent dye – streptavidin nhƣ FITC – streptavidin. (Hình 2.7.E)
Theo một số báo cáo gần đây cho rằng phƣơng pháp LSAB có độ nhạy cao hơn 5 – 10 lần so với phƣơng pháp ABC chuẩn
PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM THÍ NGHIỆM 3.1.1. Thời gian 3.1.1. Thời gian
Từ ngày 6/3/2006 đến ngày 18/7/2006
3.1.2. Địa điểm
- Gây nhiễm: Trại Thực Nghiệm Thuỷ Sản Thủ Đức-Tp HCM
- Phân tích IHC: Phòng Mô Học – Trung Tâm Quốc Gia Quan Trắc Cảnh Báo Môi Trƣờng và Phòng Ngừa Dịch Bệnh Khu Vực Nam Bộ – Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II.
3.2. VẬT LIỆU
3.2.1. Vật liệu và dụng cụ sử dụng trong quá trình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn 3.2.1.1. Vật liệu 3.2.1.1. Vật liệu
- Dịch virus gốc sử dụng trong thí nghiệm đƣợc tạo từ dòng WSSV-VN thu từ khu vực bệnh đốm trắng tại Long An năm 2003. Sau đó tăng sinh và tinh sạch tại Đại học Ghent – Vƣơng quốc Bỉ.
- Tôm sú có độ tuổi từ 45 ngày tuổi (trọng lƣợng cơ thể 8,5 g 2) đƣợc lấy từ trại nuôi tôm Công ty K22, huyện Thạnh Phú, tỉnh Bến Tre sau khi đã kiểm tra tôm không mang các mầm bệnh virus thông thƣờng (WSSV, MBV, IHHNV, HPV, YHV, TSV). Tôm đƣợc đem về Trại Thực Nghiệm Thuỷ sản Thủ Đức, nuôi thuần dƣỡng theo các điều kiện thí nghiệm 6 ngày trƣớc khi đƣa vào gây nhiễm thực nghiệm.
- Bể kính thí nghiệm có thể tích 126 lít
- Nƣớc biển sử dụng trong thí nghiệm đƣợc chở từ Vũng Tàu có độ mặn 30 %o- 35 ‰ đƣợc pha loãng đến 20 ‰ cho thí nghiệm. Sau đó xử lý nƣớc biển bằng chlorine 30 ppm. Sau 3 ngày trung hòa dƣ lƣợng chlorine.bằng NaHSO4.
3.2.1.2. Dụng cụ
- Micropipette 100µl, 1000µl; eppendoff 2ml; găng tay; kim tiêm insulin; bông gòn tiệt trùng
- Máy bơm nƣớc, sục khí, đá bọt, bộ lọc cơ. - Vợt và thức ăn tôm lớn CP – 9003 P - Panh, dao, kéo vô trùng
- Hóa chất: Cồn 700, cồn 900, dung dịch Davidson, nƣớc cất, dung dịch đệm PBS, Chlorine, formaline, NaHSO4.
3.2.2. Các hóa chất và dụng cụ sử dụng trong IHC 3.2.2.1. Hóa chất 3.2.2.1. Hóa chất
- Xylene
- Ethanol ( 100 %, 95 %, 70 %, 50 %) - Sodium azide 10 %
- Tris NaCl, tris HCl pH 7.6 - H2O2 30%
- Kháng thể thứ nhất 8B7 (Diagxostic – USA)
- Kháng thể thứ hai (Anti-mouse Ig, biotinylated species-specific whole antibody (Amersham – Vƣơng quốc Anh)
- Normal Sheep serum (Calbiochem)
- Streptavidin – biotine horseradish peroxidase (HRP) (Amersham – Vƣơng quốc Anh)
- 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) (Sigma – USA) - Hematoxylin
- Keo dán Baume Canada (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.2.2.2. Vật tƣ - Lame - Lame - Lamella - Găng tay - Khẩu trang - Kim - Kẹp - Bình tam giác
- Các loại becher, ống đong
3.2.2.3. Thiết bị
- Tủ lạnh - Máy ủ nhiệt - Máy xử lý mẫu
- Máy cắt mẫu microtome - Tủ ủ
- Kính hiển vi quang học
3.3. BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM
3.3.1. Tôm và điều kiện thí nghiệm
Tôm sau khi đƣợc nuôi thuần hóa trong bể composite 4 ngày đƣợc chuyển lên các bể kính thí nghiệm chứa 70 lít nƣớc biển có độ mặn 20 ‰ và nhiệt độ nƣớc là 280C, pH nƣớc 7,5 – 8,5 đƣợc duy trì suốt quá trình thí nghiệm. Tiến hành 2 thí nghiệm. Ở thí nghiệm thứ nhất, tôm (n = 48) đƣợc tiêm với liều thấp và ở thí nghiệm thứ hai tôm (n = 48) đƣợc tiêm với liều cao. Trong mỗi thí nghiệm, mỗi nhóm 6 con tôm đƣợc nuôi chung trong 1 bể thí nghiệm chứa 70 lít nƣớc. Tôm thí nghiệm đƣợc cho ăn mỗi ngày 3 lần: 8; 13 và 18 giờ.
Các chỉ tiêu môi trƣờng đƣợc theo dõi:
Chỉ tiêu lần 1 lần 2
Trong ngày:
Nhiệt độ 8 giờ 14 giờ
pH 8 giờ 14 giờ
Oxy hoà tan 8 giờ 14 giờ
Đầu và cuối đợt thí nghiệm
Amonia Đầu thí nghiệm Cuối thí nghiệm
3.3.2. Virus đốm trắng dòng Việt Nam (WSSV-VN)
Stock virus đốm trắng dòng Việt Nam sau khi chuẩn độ có đƣợc nồng độ gây nhiễm 50 % số tôm thí nghiệm (SID50/ml) là 105,32 SID50/ml. Từ 105,32 SID50/ml tiến hành pha loãng dịch virus trong PBS 1X để có đƣợc liều cao (104,0
SID50/ml) và liều thấp (101,5 SID50/ml). Thể tích tiêm cho liều thấp và liều cao là 100 l
3.3.3. Gây nhiễm virus đốm trắng trên tôm sú
Sử dụng kim tiêm insulin (1ml) hút 100 l dịch virus đã đƣợc pha loãng và tiêm thẳng vào phần cơ giữa đốt thứ 2 và thứ 3 ở mặt bên của tôm. Sau khi tiêm khử trùng chỗ tiêm bằng cồn 70 %.
3.3.4. Thời gian theo dõi và thu mẫu để khảo sát quá trình phát sinh bệnh
Thời gian theo dõi và thu mẫu nhƣ bảng 3.1 cho cả 2 thí nghiệm Mỗi lần thu mẫu là 6 con/bể và tiến hành trong 60 h
Bảng 3.1: Thời gian theo dõi và thu mẫu tôm sú để khảo sát quá trình phát sinh bệnh.
Bể 1 2 3 4 5 6 7 8 Đ/C Số tôm 6 6 6 6 6 6 6 6 6 Thời điểm Thu mẫu 0* 6 12 18 24 36 48 60 Kết thúc thí nghiệm (*): thu ở 0 giờ để xem hiệu quả tiêm
3.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.4.1. Phƣơng pháp pha loãng dịch virus 3.4.1. Phƣơng pháp pha loãng dịch virus
Cách tính để có đƣợc liều cao104,0 SID50/100 l thể tích tiêm (Nghĩa là 104,0 SID50/100 µl = 105,0 SID50/1ml) Cách tính: Hệ số pha loãng 105,32 SID50.ml-1 =100,32 = 2,089 lần 105 SID50.ml-1
Thể tích dịch virus cần để sử dụng để gây nhiễm thực nghiệm: 100µl x 6con x 8 bể = 4800 µl
Thể tích dịch virus đã đƣợc chuẩn độ SID50/ml cần sử dụng để pha loãng: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Vstock = Vsử dụng /hệ số pha loãng = 4800 l / 2,089 = 2297,7µl (2,2977 ml)
Thành phần dịch virus liều cao là: 2,2977 ml stock SID50/ml + 2,5023 ml PBS
Cách tính để có đƣợc liều thấp 101,5 SID50/100µl thể tích tiêm (nghĩa là
101,5 SID50/100 µl = 102,5 SID50/1ml Cách tính: Hệ số pha loãng: 105,32 SID50. ml-1 =102,82 lần = 660,69 lần 102,5 SID50. ml-1 Thể tích cần để sử dụng: 100µl x 6 x 8 bể = 4800 µl
Thể tích dịch virus đã đƣợc chuẩn độ SID50/ml cần sử dụng để pha loãng:
Vstock = Vsử dụng / hệ số pha loãng = 4800 l / 660,69 = 7,265 l Thành phần dịch virus liều thấp là: 7,265 l + 4792,735 l PBS
3.4.2. Phƣơng pháp thu mẫu tôm
Thu mẫu tôm phân tích PCR:
Thu chân bơi và 1 – 2 lá mang, cố định trong cồn 950 Thu mẫu tôm phân tích IHC
Ở mỗi thời điểm tiến hành thu phần đầu của 6 con, tiêm và cố định trong dung dịch Davidson từ 24 – 48 h, sau đó chuyển qua cồn 500 ít nhất là 24h. .
Sau đó tiến hành cắt mẫu nhƣ sau: - 3 con xẻ dọc
- 3 con còn lại đƣợc cắt ngang làm 3 phần riêng :
Phần 1: gồm ruột trƣớc, tuyến anten, biểu mô dƣới vỏ
Phần 2: phần giữa của phần đầu gồm ruột giữa, gan tụy, mang, dạ dày, mô tạo máu, lymphoid.
Phần 3: phần còn lại của đầu
3.4.3. Phƣơng pháp nhuộm IHC
Quy trình thực hiện IHC gồm 3 giai đoạn chính
Ủ mẫu trong 24 – 72 giờ
12,5 giờ
Làm lạnh
Ủ mẫu ở 400C
Quy trình 3.4: Các bƣớc thực hiện IHC
Thu mẫu
Cố định mẫu
Xử lý mẫu
Đúc mẫu
Cắt mẫu
Nhuộm IHC và quan sát dƣới kính hiển vi Chuyển mẫu lên lame
Giai đoạn 1: Xử lý mẫu (theo phƣơng pháp mô học)
Bước 1: Xử lý mẫu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Mẫu sau khi đƣợc cố định trong dung dịch Davidson đƣợc chuyển vào cassette và rửa 1 – 2 giờ dƣới vòi nƣớc. Sau đó xử lý theo quy trình 3.2. Quá trình này đƣợc thực hiện bằng máy. Tổng thời gian xử lý là 12,5 giờ
Quy trình 3.5: Các giai đoạn xử lý mẫu
Bước 2: Đúc mẫu
Cho mẫu vào nằm sát đáy khuôn, rót hỗn hợp paraffin vào đầy khuôn, đậy nắp cassette và để nguội.
Sau khi nến đông lại, đặt khuôn lên bàn lạnh cho đến khi tách đƣợc khối paraffin ra khỏi khuôn và đặt lên bàn lạnh cho đến khi mặt cắt cứng lại.
Bước 3: Cắt mẫu
Cắt khối paraffin chứa mẫu bằng máy cắt mẫu microtome. Bề dày lát cắt là 5 m.
Bước 4: Đính mẫu lên lame.
Với mỗi lát cắt, nhỏ cồn 70 % sao cho ƣớt toàn bộ lát cắt rồi chuyển vào nồi nƣớc nóng 400C. Dùng lame (+) vớt mẫu. Sau đó ủ ở 500C cho đến khi mẫu khô hoàn toàn. Cồn 70 % 30 phút Cồn 95 % (1) 30 phút Cồn 95 % (2) 30 phút Cồn 95 % (3) 30 phút Cồn tuyệt đối (1) 30 phút Cồn tuyệt đối (2) 30 phút Cồn tuyệt đối (3) 30 phút Chloroform (1) 1,5 giờ Chloroform (2) 1,5 giờ Paraffin (1) 3 giờ Paraffin (2) 3 giờ
Giai đoạn 2: Tiến hành nhuộm IHC cho mẫu
Quy trình 3.6: Các bƣớc thực hiện IHC
Bước 1: Khử paraffin cho mẫu mô
- Xylene 1 lần 5 phút
- Cồn 100 % 1 lần 5 phút
- Cồn 95 % 1 lần 5 phút
- Cồn 70 % 1 lần 5 phút
- Cồn 50 % 1 lần 5 phút
Nhúng 3 lần trong Tris buffer NaCl pH 7.6. Mỗi lần 5 phút
Bước 2: Ngăn ngừa hoạt động của enzyme nội bào
Ngăn hoạt động của enzyme peroxidase nội bào: Pha dung dịch gồm sodium azide (10 %), Tris - NaCl, H2O2 theo tỉ lệ 25 : 221 : 4. Lƣợng dung dịch cần pha phụ thuộc vào lƣợng lame muốn nhuộm (80μl hỗn hợp/lame). Dùng micropipette hút dung dịch và trải đều lên trên mặt mẫu.
Ủ mẫu 30 phút ở nhiệt độ phòng. Khử paraffin Ngăn hoạt động của enzyme nội bào bằng
SA 10% Ủ với kháng thể thứ nhất Ủ với kháng thể thứ hai Rửa 3 lần với Tris-NaCl 1X Rửa 3 lần với Tris-NaCl 1X Rửa 3 lần với
Tris-NaCl 1X Ủ với HRP Rửa 3 lần với
Tris-NaCl 1X
Hiển thị màu bằng DAB Nhuộm tạo màu nền
với hematoxylin Khử nƣớc Dán keo Baume Canada 30 phút Mỗi lần 5 phút 1 giờ Mỗi lần 3 phút 1 giờ Mỗi lần 3 phút 30 phút Mỗi lần 5 phút
Rửa 3 lần với Tris buffer pH 7,6 + NaCl (5 phút/lần).
Bước 3: Ủ với kháng thể thứ nhất
Pha kháng thể 8B7 mAb (kháng WSSV VP28) với huyết thanh cừu 10% (100 μl huyết thanh cừu + 900 μl tris buffer pH 7,6) theo tỉ lệ 1:30. Lƣợng dung dịch cần pha và cách sử dụng tƣơng tự bƣớc 3.
Ủ mẫu 1 giờ ở 370 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
C .
Rửa 3 lần với Tris buffer pH 7,6 + NaCl (3 phút/ lần).