Sử dụng phần mềm Excel để tính các giá trị trung bình và độ lệch chuẩn. So sánh thống kê bằng phương pháp ANOVA trong phần mềm SPSS ở mức tin cậy P<0,05.
Hình 3.5: Dụng cụ và qui trình đục lỗ thạch
(A, B: Đầu cole dùng để đục lỗ thạch; C: Sử dụng đầu cole đục 3 lỗ trên đĩa thạch; D: Dùng que cấy loại bỏ khối thạch đã được đục lỗ; E: Bơm dung dịch vi khuẩn vào lỗ
thạch; F: Ủ vi khuẩn trong tủ ủở 30 oC.) C B A D E F
Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Kết quả khảo sát đặc tính tương thích giữa các dòng Bacillus chọn lọc
Kết quả khảo sát đặc tính tương thích giữa 9 dòng vi khuẩn Bacillus được thể hiện trong Bảng 4.1. Kết quả cho thấy đa số các dòng đều đối kháng (không tương thích) lẫn nhau. Có 4 nhóm vi khuẩn sau đây thể hiện sự tương thích: (B2, B7, B41), (B2, B8, B41), (B9, B41), (B8, B67). Từ 4 nhóm vi khuẩn trên tìm đươc 9 hỗn hợp: H1 (B2, B7, B41), H2 (B2, B8, B41), H3 (B2, B7), H4 (B2, B8), H5 (B2, B41), H6 (B7, B41), H7 (B8, B41), H8 (B9, B41), H9 (B8, B67) để tiến hành chọn lọc và kiểm tra khả năng đối kháng Vibrio.
Bảng 4.1: Đặc tính tương thích của 9 dòng vi khuẩn Bacillus chọn lọc
B2 B7 B8 B9 B17 B37 B38 B41 B67 B2 + + - - - - + - B7 + - - - + - B8 + - - - + + B9 - - - + - B17 - - - - B37 - - - - B38 - - - - B41 + + + + - - - - B67 - - + - - - - - Chú thích: +: Tương thích; -: Đối kháng
Tính đối kháng là khả năng ức chế sự phát triển của vi sinh vật. Hiện nay người ta đã xác định được nhiều chất có khả năng ức chế ức chế sự phát triển của vi sinh vật như bacteriocin, chất kháng sinh, vi rút xâm nhiễm vi khuẩn,…Ngoài ra một số dòng vi khuẩn Bacillus như B. subtilis có khả năng sinh tổng hợp riboflavin, làm cho chủng vi khuẩn này có khả năng cạnh tranh thức ăn với một số loài khác. Một số loại bacteriocin có thể kháng đồng thời nhiều loại vi sinh vật Thêm vào đó một số nghiên cứu được xác định để giúp làm rõ mối quan hệ giữa những chất ức chế khác nhau. Vì vậy đa số các dòng vi khuẩn khảo sát thể hiện đặc tính đối kháng lẫn nhau mặc dù chúng cùng chung một chi Bacillus. Kết quả
nghiên cứu Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh và ctv (2010) cho kết quả tương tự, đa số các chủng vi khuẩn là tác nhân gây bệnh Vibrio spp được phân lập từ ấu trùng tôm sú và cá chẽm đều đối kháng lẫn nhau. Nghiên cứu của Trần Thị Thu Hiền (2010) đã tuyển chọn được 3 chủng vi khuẩn Bacillus T3, T4, T9 không có khả ức chế kiềm hãm lẫn nhau để cho vào sản phẩm sinh học.
4.2 Kết quả khảo sát khả năng đối kháng Vibrio của các dòng Bacillus.
Với mục tiêu lựa chọn các dòng vi khuẩn Bacillus có khả năng đối kháng vi khuẩn Vibrio, các dòng này được thử hoạt tính kháng khuẩn trên các chủng vi sinh vật kiểm định Vibrio gây bệnh. Sau thời gian 24 giờ kiểm tra vòng vô khuẩn xung quanh lỗ thạch đã thu được kết quả như sau:
Bảng 4.2: Đường kính vòng vô khuẩn (cm) của Vibrio đối kháng các dòng vi khuẩn Bacillus
*Những giá trị trên cùng một cột có chữ cái khác nhau thì khác biêt có ý nghĩa thống kê (P<0,05).
Bảng 4.2 cho thấy đường kính vòng vô khuẩn thể hiện khả năng đối kháng các chủng Vibrio của các dòng vi khuẩn Bacillus. Các dòng vi khuẩn Bacillus B2, B8, B9, B41, B67 thể hiện khả năng đối kháng Vibrio thông qua việc xuất hiện
Đường kính vòng vô khuẩn (D- d, cm) Kí hiệu dòng Vibrio harveyi
30953 Vibrio harveyi 0986 Vibrio V (x) B2 0,05±0,05a 0,07±0,03a 0,12±0,08a B7 - - - B8 0,15±0,05ab 0,23±0,03b 0,20±0,00a B9 0,22±0,03b 0,16±0,05ab 0,18±0,03a B17 - - - B37 - - - B38 - - - B41 0,47±0,06c 0,50±0,10c 0,43±0,06b B67 0,77±0,13d 0,67±0,14d 0,67±0,21c
vòng vô khuẩn tuy nhiên ở các mức độ khác nhau, trong đó B47, B67 có đường kính vòng vô khuẩn vượt trội hơn so với các dòng còn lại. Các dòng vi khuẩn B7, B17, B37, B38 không có vòng vô khuẩn xung quanh các giếng thạch, kết luận các dòng này không có khả năng kháng Vibrio. Điều này phù hợp với kết quả nghiên cứu trước đây của Huỳnh Hữu Điền (2012), dòng vi khuẩn Bacillus B37 không có khả năng đối kháng, dòng B67 và B41 có khả năng đối kháng Vibrio harveyi cao.
Theo Trần Thị Thu Hiền (2010) vi khuẩn Bacillus trong quá trình phát triển có thể sản sinh ra các chất kiềm hãm, ức chế với các vi khuẩn gây bệnh thông qua một số cơ chế như cạnh tranh oxi, chất dinh dưỡng, cạnh tranh vị trí và sản sinh ra các chất ức chế sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh. Một số nghiên cứu đã cho thấy vi khuẩn Bacillus có khả năng khống chế bệnh dịch bằng cách ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh Vibrio, thúc đẩy quá trình thực bào, tăng hoạt động của Melanin và kháng khuẩn. Theo Hasting và nealon (1981) Bacillus S11 có thể tạo ra một số chất kháng khuẩn V. Harveyi và Moriaty (1998) khi sử dụng probiotic chứa chứa chủng Bacillus spp cũng hạn chế được mầm bệnh vi khuẩn phát sáng Vibrio spp. Nghiên cứu của Vaseehara và Ramasamy (2003) cho thấy mầm bệnh Vibrio bị kiểm soát bởi Bacillus trong điều kiện phòng thí nghiệm và ngoài thực tế. Nghiên cứu của Phạm Thị Tuyết Ngân (2011) về quần thể vi khuẩn chuyển hóa đạm trong bùn đáy ao nuôi tôm sú cho thấy chất lượng nước ao nuôi được cải thiện đồng thời mật độ Vibrio ở các nghiệm thức bổ sung Bacillus thấp hơn so với đối chứng.
4.3 Kết quả khảo sát khả năng đối kháng Vibrio của các hỗn hợp Bacillus.
Dựa trên hai tiêu chí: khả năng đối kháng Vibrio của từng dòng Bacillus và đặc tính tương thích giữa các dòng vi khuẩn này các hỗn hợpđã được sàn lọc cho bước nghiên cứu khả năng đối kháng Vibrio gây bệnh. Từ kết quả hai thí nghiệm trên đã tuyển chọn được 6 trong tổng số 9 hỗn hợp: H2, H4, H5, H7, H8, H9 để tiếp tục khả sát khả năng kháng khuẩn của hỗn hợp.
Bảng 4.3: Đường kính vòng vô khuẩn (cm) của Vibrio đối kháng các hỗn hợp vi khuẩn Bacillus
* Những giá trị trên cùng một cột có chữ cái khác nhau thì khác biêt có ý nghĩa thống kê (P<0,05).
Kết quả khảo sát khả năng đối kháng Vibrio thể hiện ở Bảng 4.3 cho thấy:
Đối với chủng Vibrio harveyi 30953: Hỗn hợp H7 (0,90 cm) có đường kính vòng vô khuẩn lớn nhất, tiếp theo là H2 (0,70 cm) tuy nhiên khác biệt không có ý nghĩa thống kê (P>0,05). Hỗn hợp H7 khác biệt có ý nghĩa thống kê với các hỗn hợp còn lại; H2 khác biệt thống kê với H8, H9 (P<0,05) và không có ý nghĩa thống kê với H4, H5, H7 (P>0,05).
Đối với chủng Vibrio harveyi 0986: Hỗn hợp H9 có đặc tính kháng khuẩn mạnh nhất (0,67 cm), tiếp theo là H2 (0,57 cm), H5 (0,48 cm) tuy nhiên hỗn hợp H2 khác biệt không có ý nghĩa thống kê H5 và H9 (P>0,05) và khác biệt thống kê với các hỗn hợp còn lại (P<0,05). Cả ba hỗn hợp H4, H7, H8 đều khác biệt có ý nghĩa thống kê với các hỗn hợp còn lại.
Đối với chủng Vibrio chưa định danh V(x): hỗn hợp H5 và H9 có khả năng kháng khuẩn vượt trội hơn so với các dòng khác với đường kính vòng vô khuẩn
Đường kính vòng vô khuẩn (D- d, cm) Kí hiệu dòng Vibrio harveyi 30953 Vibrio harveyi 0986 Vibrio V (x) H2 0,70±0,20ab 0,57±0,06ac 0,37±0,06a H4 0,40±0,10ac 0,18±0,03b 0,15±0,05b H5 0,46±0,05ac 0,48±0,03a 0,73±0,06c H7 0,90±0,10b 0,22±0,03b 0,30±0,10ab H8 0,20±0,10c 0,17±0,06b 0,37±0,06a H9 0,23±0,06c 0,67±0,06c 0,60±0,00c
lần lượt là 0, 73 cm và 0,60 cm. Tuy hai hỗn hợp này khác biệt không có ý nghĩa thống kê (P>0,05) nhưng lại khác biệt có ý nghĩa thống kê với các hỗn hợp còn lại (P<0,05). Hỗn hợp H2, H7, H8 có khả năng kháng khuẩn ở mức trung bình tuy nhiên khác biệt không có ý nghĩa thống kê. H4 có khả năng kháng khuẩn thấp nhất, khác biệt không có ý nghĩa với H7 (P>0,05) và khác biệt thống kê với các hỗn hợp còn lại (P<0,05). 0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 H2 H4 H5 H7 H8 H9 Đ ườ n g k ín h v ò n g t rò n v ô k h u ẩ n ( c m ) Vh30953 Vh0986 V(x) Hình 4.1: Đường kính vòng kháng khuẩn
Sở dĩ có sự khác biệt kích thước đường kính vòng vô khuẩn giữa các chủng
Vibrio vì có sự khác nhau về nguồn gốc vi khuẩn. Hai dòng Vibrio harveyi 30953 và Vibrio harveyi 0986 có nguồn gốc từ trường Đại học Gent của Bỉ, chủng Vibrio
chưa định danh V (x) được phân lập từ nước bể nuôi tôm ở trại thực nghiệm của khoa Thủy sản, Đai học Cần Thơ.
Trong quá trình hình thành bào tử, Bacillus thường sản sinh những chất có hoạt tính sinh học, ứng dụng trong nhiều lĩnh vực. Các chất ức chế do vi khuẩn tiết ra có khả năng ngăn cản sự sinh trưởng mạnh mẽ của các vi sinh vật gây bệnh.
Các chất này gồm nhiều loại như các chất kháng sinh, bacteriocin, siderophore, lysozym, protease, hydroperoxit… chúng có thể tác động đơn lẻ phối hợp với nhau. Vì thế kết quả cho thấy một số hỗn hợp có khả năng kháng khuẩn mạnh hơn so với từng dòng riêng lẻ, tuy nhiên cũng có trường hợp ngược lại. Nhưng nhìn chung tác động phối hợp của các vi khuẩn trong hỗn hợp có đặc tính kháng khuẩn vượt trội hơn.
Hình 4.2: Phân lập vi khuẩn trên môi trường TCBS
A: Vi khuẩn V (x) phát triển sau khi tán mẫu nước ao nuôi tôm trong 24 giờ; B: Tách ròng vi khuẩn Vibrio.
Hình 4.3: Dịch khuẩn sau khi ly tâm
(A: Sinh khối vi khuẩn sau ly tâm lắng ở đáy ống balcon; B: Dịch khuẩn sau khi pha
loãng với nước muối sinh lí)
A B
Hình 4.4: Kích thước vòng vô khuẩn
(A: Không xuất hiện vòng vô khuẩn (không đối kháng); B, C, D: Các kích thước khác
nhau của vòng vô khuẩn (đối kháng); E: Vi khuẩn mọc leo ra bên ngoài lỗ thạch; F:
Đường kính vòng vô khuẩn)
A
F
A B
C D
Phần 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận
Có 4 nhóm vi khuẩn (B2, B7, B41), (B2, B8, B41), (B9, B41), (B8, B67) thể hiện sự tương thích lẫn nhau. Từ 4 nhóm vi khuẩn tìm được 9 hỗn hợp H1 (B2, B7, B41), H2 (B2, B8, B41), H3 (B2, B7), H4 (B2, B8), H5 (B2, B41), H6 (B7, B41), H7 (B8, B41), H8 (B9, B41), H9 (B8, B67).
Có 5 dòng vi khuẩn Bacillus (B2, B8, B9, B41, B67) thể hiện đặc tính đối kháng Vibrio, trong đó B67 và B41 có đặc tính kháng khuẩn vượt trội. Các dòng vi khuẩn B7, B17, B37, B38 không có khả năng đối kháng Vibrio.
Dựa vào khả năng đối kháng Vibrio gây bệnh và đặc tính tương thích giữa các dòng vi khuẩn Bacillus, có 6 hỗn hợp được tuyển chọn H2, H4, H5, H7, H8, H9 để xác định khả năng kháng khuẩn.
Cả 6 hỗn hợp được tuyển chọn đều thể hiện đặc tính đối kháng Vibrio, tuy nhiên ở các mức độ đối kháng là khác nhau. Trong đó khả năng đối kháng Vibrio harveyi 30953 mạnh nhất là các hỗn hợp H7 (0,90 cm), H2 (0,70 cm); đối với
Vibrio harveyi 0986 có H9 (0,67 cm), H2 (0,57 cm), H5 (0,48 cm) có kích thước đường kính vòng vô khuẩn cao. Riêng chủng Vibrio V(x) có nguồn gốc từ trại thực nghiệm khoa Thủy sản, trường Đại học Cần Thơ cho kết quả hai hỗn hợp H5 (0,73 cm) và H9 (0,60 cm) có khả năng đối kháng vượt trội hơn hẳn các hỗn hợp còn lại.
5.2 Đề xuất
Những kết quả đạt được chỉ mới dừng lại ở mức độ một đề tài nghiên cứu khoa học, để ứng dụng vào thực tiễn sản xuất cần tiếp tục nghiên cứu những nội dung sau đây:
Tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về tiềm năng probiotic của các hỗn hợp vi khuẩn Bacillus có đặc tính đối kháng Vibrio vượt trội: thử hoạt tính proteaza, amylaza, cenllulaza,.. để sàn lọc và chọn ra những hỗn hợp có hiệu quả tối ưu.
Những hỗn hợp vi khuẩn Bacillus được tuyển chọn cần đưa vào thử nghiệm trên ao nuôi tôm, cá thực tế để kiểm tra hiểu quả của vi khuẩn.
Nghiên cứu qui trình sản xuất chế phẩm vi sinh từ những hỗn hợp vi khuẩn
Bacillus có đặt tính kháng khuẩn mạnh để đưa vào sản xuất đại trà nhằm đáp ứng nhu cầu sử dụng của người dân.
Định danh các dòng vi khuẩn Bacillus và chủng vi khuẩn Vibrio đã được phân lập từ mẫu nước bể nuôi tôm ở trại thực nghiệm khoa Thủy sản để bổ sung vào bộ sưu tập các vi sinh vật có tính thích nghi với điều kiện sinh thái vùng ĐBSCL.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Đặng Thị Hoàng Oanh, Đoàn Nhật Phương, Nguyễn Thị Thu Hằng và Nguyễn Thanh Phương, 2006. Xác định vị trí phân loại và khả năng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn Vibrio phát sáng phân lập từ hậu ấu trùng tôm sú (Penaeus monodon). Tạp chí nghiên cứu khoa học: 42-52.
2. Đỗ Thị Hòa, 1996. Nghiên cứu một số bệnh chủ yếu trên tôm sú (Penaeus monodon Fabricius 1798) nuôi ở khu vực Nam Trung Bộ. Luận án Phó Tiến sĩ. Khoa Nông nghiệp, trường Đại học Thủy sản Nha Trang.
3. Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng và Nguyễn Thị Muội, 2004. Giáo trình bệnh học thủy sản. Khoa nuôi trồng Thủy sản, trường Đại học Nha Trang.
4. Huỳnh Hữu Điền, 2012. Thử nghiệm sản xuất chế phẩm vi sinh từ các dòng
Bacillus chọn lọc ở ao nuôi tôm sú thâm canh. Luận văn đại học. Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ.
5. Lê Đình Duẩn và Phạm Văn Tý, 2007. Nghiên cứu sản xuất và thử nghiệm chế phẩm probiotic làm sạch nước tôm nuôi. Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-Hà Nôi.
6. Mai Bé Túy, 2011. Ảnh hưởng của chế phẩm vi sinh lên chất lượng nước và vi sinh vật có hại trong xử lí nước thải ao nuôi cá tra (Pangasianodon hypophthalmus). Luận văn đại học. Khoa Thủy sản, trường Đại học Cần Thơ. 7. Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh, Nguyễn Văn Thanh, Đặng Tố Vân Cầm, Vũ Hồng Như Yến, Trần Nguyễn Ái Hằng, 2010. Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm chế phẩm vi sinh từ các dòng vi khuẩn có đặc tính đối kháng Vibrio sp nhầm nâng cao tỉ lệ sống ấu trùng cá biển và tôm sú. Đề tài thuộc chương trình công nghệ sinh học nông nghiệp, thủy sản.
8. Phạm Thị Tuyết Ngân, 2007. Giáo trình Vi sinh vật hữu ích. Khoa Thủy sản, trường Đại học Cần Thơ.
9. Phạm Thị Tuyết Ngân, 2011. Nghiên cứu quần thể chuyển hóa đạm trong bùn đáy ao nuôi tôm sú (Penaeus monodon). Luận án Tiến sĩ Thủy sản. Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ.
10. Tăng Thị Chính và Đinh Thị Kim, 2006. Sử dụng chế phẩm vi sinh trong ao nuôi tôm cao sản. Viện công nghệ môi trường, viện Khoa học và công nghệ Việt Nam.
11. Từ Thanh Dung, Đặng Thị Hoàng Oanh, Trần Thị Tuyết Hoa, 2005. Giáo trình bệnh học thủy sản. Khoa Thủy sản, trường Đại học Cần Thơ.
12. Trần Thị Thu Hiền, 2010. Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn thuộc chi
Bacillus ứng dụng tạo chế phẩm sinh học để xử lý môi trường nuôi trồng thủy sản. Luận văn cao học. Viện công nghệ sinh học- Công nghệ thực phẩm.Đại học Bách Khoa Hà Nội.
Tài liệu tiếng Anh
1. Aguirre-Guzman, G., Vazquez-Juarez, R., Ascencio, F., 2001. Differences in the susceptibility of American White Shrimp larval substages (Litopenaeus vannamei) to four Vibrio species. J Invert Pathol.
2. Karunasagar, I. Pai, R., Malathi, G.R., Karunasagar, I., 1994. Mass mortality of
Penaeus monodon larvae due to antibiotic-resistant Vibrioharveyi infection. 3. Oanh, D.T.H., 1999. Characterization anh Pathogenicity Studies on Vibrio
Bacteria Isolated from Fish and Sellfish in Vietnam. College Aquaculture and Fisheries. Can Tho University
4. Moriarty, D.J.W., 1999. Disease control in shrimp aquaculture with probiotic bacteria.
5. Rengpiat, S., S. Rukpratanporn, 1998. Probiotic in aquaculture: A case study of probiotic for larvae of the black tiger shrimp (Penaeus monodon). In Book of
Abstracs of the Fifth Asian Fisheries Forum-Indernational Conferece on Fisheries and Food Security Beyond the Year 2000. Asian Fisheries Society, Chiang Mai, Thailan.
6. Sung, H.-H., Song, Y.L., Kou, G.H., 1991. Potential ues of bacterin to prevent shrimp vibriosis. Fish & Shellfish Immun.
7. Vaseeharan, B., J. Lin and P. Ramsamy., 2003. Control of pathogenic Vibrio
spp by Bacillus subtilias BT23, a Possible Probiotic Treatment for Black Tiger Shrimp (Penaeus monodon).
8. Verschuere, L., Rombaut, G., Sorgeloos, P., Verstraete, W., 2000. Probiotic bacteria as biological control agents in aquaculture. Microbiol Mol Biol Rev. 9. Xiang-Hong, W., L. Jun, J. Wei-Shang, X. Huai-Shu, 1998. Application of Probiotics in Aquaculture. Ocean University of Qongdao. Qingdao.
PHỤ LỤC
Phụ lục 1: Các công thức môi trường
1. Công thức môi trường chuyên biệt để xác định mật độ vi khuẩn Bacillus