Trong 70 mẫu cá bệnh thu được trong thời gian gây cảm nhiễm, đã tái phân lập vi khuẩn 52 mẫu bệnh phẩm, vi khuẩn được phân lập từ gan, thận và tỳ
tạng của cá bệnh, cấy trên môi trường dinh dưỡng TSA, ủ ở 28oC sau 24 giờ
và đã thu được 156 chủng vi khuẩn. Sau đó dựa vào những đặc điểm hình thái và một số chỉ tiêu sinh hóa cơ bản đã chọn được 12 chủng vi khuẩn tiến hành tái định danh vi khuẩn.
1 2 3 4
B 1 2
A
Hình 4.6 Kết quả test các chỉ tiêu sinh hóa của chủng Xương-CĐ3L310 A. Chỉ tiêu acid amin (1. đối chứng, 2. arginine)
B. Các chỉ tiêu: 1. Citrate, 2. SIM, 3. Esculin, 4. TSI.
Qua kết quả kiểm tra nhuộm Gram, quan sát tính di động và các phản ứng test sinh hóa cho thấy chủng phân lập từ cá tra bệnh trong thí nghiệm và chủng gốc ban đầu được phân lập từ cá bệnh ngoài tự nhiên đều có khuẩn lạc dạng tròn, hơi lồi, nhẵn và có màu vàng nhạt, vi khuẩn Gram âm, có dạng hình que ngắn, kháng với O/129. Phản ứng dương tính với Oxidase, Catalase, Indole,
VP, Gelatin, có khả năng phân giải Arginine, không có khả năng sinh H2S, có khả năng lên men các môi trường đường, có khả năng thủy phân Esculin, cho phản ứng âm tính với Urease (Hình 4.6 & Hình 4.7)
B
A B
2
1 3 4 5 6 7
Hình 4.6 Kết quả test các chỉ tiêu sinh hóa của chủng Xương-CĐ3L310 A. Khả năng phân giải đường (1. arabinose, 2. glucose, 3. inositol, 4. mannitol,
5. rhamnose, 6. sucrose, 7. salicin) B. Test O/129
Chủng Xương-CĐ3L310 sai khác chỉ tiêu H2S (+) và inositol (-) so với dòng chuẩn của Inglis et al., (1993). Nguyễn Thị Như Ngọc (1997) cũng ghi nhận
A. hydrophila có khả năng phân giải arginine. Theo kết quả ghi nhận của Ngô Thị Ngọc Thủy (1998), A. hydrophila vẫn có khả năng phân giải ornithin. Ngoài ra, Đoàn Nhật Phương (2002) còn ghi nhận, A. hydrophila có khả năng sử dụng H2S, sử dụng citrate và cho phản ứng dương tính với lysine.
4.4.2 Tái định danh vi khuẩn E. ictaluri
Sau khi gây cảm nhiễm, trong quá trình theo dõi thí nghiệm đã thu được 52 mẫu cá bệnh và đã tái phân lập vi khuẩn 39 mẫu bệnh phẩm, vi khuẩn được phân lập từ gan, thận và tỳ tạng của cá bệnh, cấy trên môi trường dinh dưỡng TSA, ủở 28oC sau 48 giờ và đã thu được 117 chủng vi khuẩn. Sau đó dựa vào những đặc điểm hình thái và một số chỉ tiêu sinh hóa cơ bản đã chọn được 12 chủng vi khuẩn tiến hành tái định danh vi khuẩn.
1 2 3 4 1 2 3 4
A B
Hình 4.8 Kết quả test các chỉ tiêu sinh hóa của chủng Tỷ-PT207 A. Các chỉ tiêu acid amin (1. đối chứng, 2. arginine, 3. lysine, 4. ornithine) B. Các chỉ tiêu: 1. TSI, 2. SIM, 3. Citrate, 4. Asculin
Qua kết quả kiểm tra nhuộm Gram, quan sát hình dạng và tính di động và các phản ứng test sinh hóa cho thấy chủng phân lập từ cá tra bệnh trong thí nghiệm và chủng gốc ban đầu được phân lập từ cá bệnh ngoài tự nhiên đều có khuẩn lạc nhỏ, tròn, màu tắng đục, rìa có dạng không đồng nhất, vi khuẩn Gram âm, có dạng hình que, không di động, phản ứng Oxidase âm tính và cho phản ứng với Catalase. Trong các phản ứng lên men đường chỉ có đuờng glucose cho phản ứng dương tính còn các đường khác đều âm tính. Có khả
năng phân giải Ornithin và Lysine, không có khả năng sinh H2S, cho phản ứng âm tính với Citrate, Urease, Indole và VP, không có khả năng thủy phân Gelatin và Esculin (Hình 4.8).
Chủng Tỷ-PT207 sai khác chỉ tiêu khả năng sinh gas từ glucose(+) so với dòng chuẩn của Inglis et al., (1993).
4.5 Một số hạn chế trong quá trình thí nghiệm
Nhiệt độ phòng gây cảm nhiễm không ổn định ở nhiệt độ thích hợp trong thời gian thí nghiệm, điều này ảnh hưởng đến tỉ lệ cá chết.
Không theo dõi được các yếu tố thủy hóa của môi trường trong thời gian thí nghiệm.
Không có dòng chuẩn vi khuẩn trong quá trình tái định danh vi khuẩn, điều này ảnh hưởng đến tính chính xác khi so sánh kết quả.
CHƯƠNG 5
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
5.1 Kết luận
− Ở cả hai thí nghiệm gây cảm nhiễm vi khuẩn A. hydrophila và E. ictaluri đều thấy xuất hiện cá chết ở các nghiệm thức, trừ nghiệm
thức đối chứng.
− Thí nghiệm gây cảm nhiễm vi khuẩn A. hydrophila, ở nghiệm thức 2,16×106 CFU/ml có thời gian biểu hiện bệnh lý sớm nhất là 17 giờ sau khi tiêm vi khuẩn cho cá. Không xác định được giá trị LD50 của chủng vi khuẩn gây cảm nhiễm.
− Thí nghiệm gây cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri có thời gian biểu hiện bệnh lý sớm nhất ở nghiệm thức 1×108 CFU/ml là 37 giờ sau khi tiêm vi khuẩn cho cá. Chủng vi khuẩn sử dụng gây cảm nhiễm có giá trị
LD50= 106,5 CFU/ml.
− Trong cả hai thí nghiệm, khi quan sát biến đổi mô học chỉ thấy có hiện tượng sung huyết và xuất huyết ở các cơ quan gan, thận và tỳ tạng của cá bệnh.
5.2 Đề xuất
− Cần có dòng chuẩn khi tái định danh vi khuẩn. − Cần có dụng cụđo pH và nhiệt độ nước hằng ngày.
− Ổn định nhiệt độ phòng gây cảm nhiễm ở điều kiện 27oC-28oC trong thời gian thí nghiệm gây cảm nhiễm.
− Gây cảm nhiễm vi khuẩn A. hydrophila trên cá tra và thu mẫu ở những mốc thời gian khác nhau nhằm xác định ảnh hưởng của vi khuẩn đến quá trình biến đổi cấu trúc mô.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Angka, S.L. 1990. The Pathology of the Walking catfish Clarias
batrachus (L), infected intraperitoneally with Aeromonas hydrophila
Asian Fish Sci. 3: 343- 351. In Asian Fish Health Bibliography and Abstracts I: Southeast Asia. Fish Health Section Asian Fisheries Society Manila, Philippines, 1992.
2. Aydin, S. and A. Cilta. 2004. Systemic Infections of Aeromonas
hydrophila in Rainbow Trout (Oncorhynchus mykiss Walbaum): Gross
Pathology, Bacteriology, Clinical Pathology, Histopathology and Chemotherapy. In Journal of Animal and Veterinary Advances 3 (12): 810-819.
3. Azad, I. S., Rajendran, K. V., Rajan, J. J. S., Vijayan, K. K. and Santiago, T. C. 2001. Virulence and histopathology of Aeromonas hydrophila (SAH 93) in experimentally infected tilapia, Oreochromis mossambicus (L.). In Journal of Aquaculture in the Tropics 16(3): 265-275.
4. Baxa, D. V., J. M. Groff, A. Wishkovsky and R. P. Hedrick. 1990. Susceptibility of nonictalurid fishes to experimental infection with
Edwardsiella ictaluri. In Diseases of Aquatic organisms. Vol. 8: 113-117.
5. Bergey, U. 1974. Pathogenicity of lactobacilli.
6. Bộ tài nguyên môi trường Việt Nam. 2006. Ngày truy cập 26/02/2007. http://www.monre.gov.vn/monrenet/default.aspx?tabid=210&ItemID=103 72
7. Bùi Quang Tề. 2006. Bệnh học thủy sản.
8. De Figueirredo, J. and Plum. J. A. 1977. Virulence of different isolates of
Aeromonas hydrophila in channel catfish. Aquaculture. 349-354
9. Dương Nhựt Long. 2006. Giảp pháp kĩ thuật góp phần nâng cao chất lượng và khai thác bền vững sản phẩm cá Tra nuôi xuất khẩu vùng
ĐBSCL.
http://mekongfish.net.vn/modules/new/index.php?storytopic=0,2start=10. 10. Đoàn Nhật Phương. 2001. Xác định LD50 và thử nghiệm vaccine phòng
bệnh vi khuẩn (Aeromonas hydrophila) trên cá chép (Cyprinus carpio). LVTN. Khoa thủy sản, ĐHCT.
11. Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng, Nguyễn Thị Muội. 2004. Giáo trình bệnh học thủy sản. Khoa nuôi trồng thủy sản, Đại học thủy sản nha Trang, 345 trang.
12. Esteve, C., E. G. Biosca and C. Amaro. 1993. Virulence of Aeromonas
hydrophila and some other bacteria isolated from European eels Anguilla anguilla reared in fresh water. In Diseases of Aquatic organisms. Vol. 16:
15-20.
13. Francis- Floyd R., M.H. Beleau, P.R. Waterstat and P.R. Bowser. 1987. Effect of water temperater on the clinical outcome of infection with
Edwardsiella ictaluri in Channel catfish, Ictalurus punctatus. Journal of
the American Veterinary Medical Assosiation 1991, 1413-1416
14. Ferguson H. W, J.F. Turnbull, A. Shinn, K.Thompson, T.T. Dung and M. Crumlish. 2001. Bacillary nercrosis in farmed Pangasius hypophthalamus (Sauvage) from the Mekong Delta, Viet Nam. Journal of Fish Diseases 2001, 24, 509- 513.
15. Hà Yên. 2005. Lập ban điều hành sán xuất và tiêu thụ cá tra, basa. http://www.vnn.vn/kinhte/congnongngunghiep/2005/05/435019. Ngày truy cập: 26/02/2007.
16. Hawke J.P. 1979. A bacterium associated with disease of pond cultured channel catfish. Journal of the Fisheries Research Board of Canada. 36: 1508-1512.
17. Inglis, V., R. Roberts and N. R. Bromage. 1993. Bacterial Diseases of Fish.
18. Klesius, P.H. and W.M. Sealey. 1995. Chacracterization of serum antibody in enteric septicemia of catfish. In Journal of aquatic animal Heath: 205-210.
19. Lawrence M.L., R.K. Cooper and R.L. Thune. 1997. Attenuation, persistence and vaccine potential of an Edwardsiella ictaluri purA Mutant. Infection and Immunity, Nov. 1997, p.4642-4652. Vol. 65, No. 11.
20. Lê Thị Bé Năm. 2002. Xác định tác nhân vi khuẩn gây bệnh đốm trắng ở
nội tạng cá Tra (Pangasius hypophthalmus). LVTN. Khoa thủy sản,
ĐHCT.
21. Lewis, D.H. and J.A.Plumb. 1979. Bacterial diseases p.15-24. In Principal diseases of farm raised catfish. Southern Cooperative Ser. 225 Auburn University. Alabama.
22. Lương Trần Thục Đoan. 2006. Khảo sát sự xâm nhập của vi khuẩn gây bệnh mủ gan (Edwardsiella ictaluri) trên các cơ quan khác nhau của cá Tra (Pangasius hypophthalmus). LVTN. Khoa thủy sản, ĐHCT.
23. Ngô Thị Ngọc Thủy. 1998. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh hóa của
Aeromonas hydrophila gây bệnh đốm đỏ ở cá trắm cỏ
(Ctenopharyngodonidelus) và chọn chủng chế vaccine phòng bệnh. LVTN. Khoa thủy sản, ĐHCT.
24. Nguyễn Bạch Loan. 2004. Ngư loại I. Bài giảng.
25. Nguyễn Quốc Thịnh. 2002. Nghiện cứu mô bệnh đốm trắng trong nội tạng cá tra (Pangasius hypophthalmus). LVTN. Khoa thủy sản, ĐHCT.
26. Nguyễn Thị Như Ngọc. 1997. Xác định tác nhân vi khuẩn gây bệnh tuột nhớt trên cá bống tượng (Oxyeleotris marmoratus, Bleeker). LVTN. Khoa thủy sản, ĐHCT.
27. Phan Thị Mỹ Hạnh. 2004. Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng bệnh vi khuẩn do E. ictaluri trên cá tra ở Đồng Bằng Sông Cửu long. LVTN. Khoa thủy sản, ĐHCT.
28. Plumb J.A., 1999. Fish diseases and disorders. Aquaculture and aquatic Environments, Auburn University, Alabama 36849 USA. 3: Viral, Bacterial and Fungal infections.
29. Rahman, M.H., S. Suzuki and K. Kawai. 2000. The effect of temperature on Aeromonas hydrophila infection in goldfish, Carassius auratus.
30. Reed, L. J. and H. Muench. 1938. A simple method of estimating fifty percent end points. American Journal of Hygiene 27: 493 – 497.
31. Roselynn, M. and W. Stevenson. 1988. Vaccination against Aeromonas
hydrophila. In Fish Vaccination. 9: 112 – 123.
32. Saitanu, K.S., Wongsawang and K. Poonsuk. 1982. Red sore disease in carp (Cyprinus carpio L) J. Aquat. Animal Dis. 3: 79-86. (In Thai). In Asian Fish Health Bibliography and Abstracts I: Southeast Asia. Fish Health Section Asian Fisheries Society Manila, Philippines, 1992.
33. Takahashi, Y., T. Kajiwaki and T. Itami. 1986. Characteristics of vibriostatic agent-sensitive Aeromonas hydrophila isolated from ayu Plecogrossus altivelis and its pathogenicity. In Bulletin of the Japanese Society of Scientific Fisheries 52(4): 1727-1733.
34. Tanasomwang, V. and K. Saitanu. 1979. Ulcer disease in striped catfish (Pangasius pangasius) J. Aquat. Animal. Dis. 2: 131-133. In Asian Fish Health Bibliography and Abstracts I: Southeast Asia. Fish Health Section Asian Fisheries Society Manila, Philippines, 1992.
35. Thompson, K. and A. Adams. 1998. Characterisation of Aeromonas
hydrophila Extracellular Products with Reference to Toxicity, Virulence,
Protein Profiles and Antigenicity.
36. Trần Anh Dũng. 2005. Khảo sát các tác nhân gây bệnh trong nuôi cá tra (Pangasius hypophthalmus) thâm canh ở tỉnh An Giang. LVCH. Khoa thủy sản, ĐHCT.
37. Trần Hồng Ửng. 2003. Bước đầu xác định sự thay đổi số lượng tế bào bạch cầu và mô tỳ tạng trên cá tra (Pangasius hypophthalmus) bệnh trắng gan. LVTN. Khoa thủy sản, ĐHCT.
38. Trần Thị Ngọc Hân. 2006. Khảo sát mô học cá Tra (Pangasius
hypophthalmus) bị bệnh mủ gan trong điều kiện gây cảm nhiễm. LVTN. Khoa thủy sản, ĐHCT.
39. Trương Quốc Phú. 2004. Quản lý môi trường ao nuôi. Bài giảng.
40. Từ Thanh Dung. 1997. Tài liệu tập huấn thực hành kí sinh trùng và vi khuẩn.
41. Từ Thanh Dung, M.Crumlish, Nguyễn Thị Như Ngọc, Nguyễn Quốc Thịnh và Đặng Thụy Mai Thy. 2004. Xác định vi khuẩn gây bệnh đốm
42. Từ Thanh Dung. 2005. Bài giảng bệnh học thủy sản.
43. Williams, M.L and M.L. Lawrence. 2005. Identification and characerization of a two component hemolysin from E. ictaluri. Journal of aquatic animal Heath. 108: 281-189.
PHỤ LỤC
PHỤ LỤC A
Phương pháp định danh vi khuẩn 1. Chỉ tiêu về hình thái
Hình dạng, màu sắc khuẩn lạc
Quan sát khuẩn lạc vi khuẩn trên môi trường thạch TSA và ghi nhận các đặc
điểm sau:
Hình dạng khuẩn lạc: tròn, dạng sợi, dạng rễ cây, không có dạng cốđịnh. -
Rìa khuẩn lạc: nguyên dạng, dạng thùy, dạng sợi.. -
Bề mặt khuẩn lạc: dạng đều, hơi lồi, lồi hình vòm -
Kích cỡ khuẩn lạc: chấm li ti, nhỏ, trung bình, lớn -
Màu sắc khuẩn lạc: kem, trắng (đục hay trong suốt), đen, cam… -
Tạo sắc tố ( đổi màu môi trường) có hay không ? sắc tố màu gì ? -
Nhuộm Gram
Nhuộm gram để quan sát hình dạng, kích thước và xác định vi khuẩn thuộc nhóm gram âm hay gram dương.
Thông thường vi khuẩn có các hình dạng: hình cầu, hình chuỗi, hình que ngắn, hình que dài, hình cong.
Phương pháp
- Sử dụng lame sạch, que cấy tiệt trùng, cho một ít nước muối sinh lý lên lame.
- Cho một ít vi khuẩn lên giọt nước muối trên lame và trãi đều. - Để lame khô tự nhiên.
- Hơ lướt lame qua ngọn đèn cồn để cốđịnh vi khuẩn. - Để lame nguội và tiến hành nhuộm.
- Nhuộm crystal violet khoảng 1 phút.
- Rửa lame bằng nước. Nhuộm iodine khoảng 1 phút.
- Rửa lame bằng dung dịch alcohol/acetone khoảng 10 giây. - Rửa lại bằng nước và để khô.
- Nhuộm safranine khoảng 2 phút. - Rửa lại bằng nước sạch và để khô.
- Quan sát trên kính hiển vi quang học ở vật kính 40 X và 100X có giọt dầu.
Kết quả
¾ Gram dương: màu xanh/tím
¾ Gram âm: màu đỏ/hồng
2 Các chỉ tiêu về sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn
Tính di động
Test này dùng để kiểm tra khả năng di chuyển độc lập của vi khuẩn.
Nhiều loại vi khuẩn có khả năng di động nhờ vào tiêm mao. Sự di động này có thể quan sát dưới kính hiển vi bằng phương pháp giọt treo ở vật kính 40X để
xác định khả năng di động của vi khuẩn.
Phương pháp
- Cho vaseline lên 4 góc của lamelle và đặt ngửa lamelle trên bàn. - Dùng que cấy tiệt trùng lấy nước muối sinh lý cho lên lamelle
- Tiệt trùng que cấy, lấy một ít vi khuẩn cho lên lamelle hòa vào nước muối sinh lý chứa vi khuẩn.
- Dùng lame đặt nhẹ nhàng lên lamelle sao cho lame không chạm vào giọt nước muối sinh lý chứa vi khuẩn.
- Cẩn thận lật nhanh lame để giọt nước treo ngược lên lamelle.
- Đặt lame lên kính hiển vi quan sát ở vật kính 40X để kiểm tra tính di động của vi khuẩn.
Phản ứng Oxydase
Phương pháp
- Chạm nhẹ que thử vào một khuẩn lạc trêm đĩa agar.
- Quan sát que thử trong 30 giây và ghi nhận sự thay đổi màu sắc.
Kết quả
¾ Que thử chuyển màu xanh đậm cho phản ứng Oxydase dương tính (+) và không chuyển màu âm tính (-).
Phản ứng Catalase
Phương pháp
- Nhỏ một giọt dung dịch 3% H2O2 lên lame
- Dùng que cấy tiệt trùng lấy một ít vi khuẩn cho vào dung dịch 3% H2O2.
Kết quả
¾ Vi khuẩn cho phản ứng Catalase dương tính (+) sẽ gây ra hiện tượng sủi bọt trong dung dịch H2O2; ngược lại khi không sủi bọt thì phản ứng Catalase âm tính(-)
Khả năng lên men và oxy hóa đường glucose (O-F test)
Phương pháp
- Chuẩn bị 2 ống nghiệm chứa môi trường O-F đã tiệt trùng. - Tiệt trùng que cấy thẳng và để nguội.
- Dung đầu que cấy lấy vi khuẩn trên đĩa agar và cấy thẳng vào 2 ống nghiệm.
- Phủ lên 1 trong 2 ống nghiệm 0,5-1 ml dầu parafin và để vào tủầm ở nhiệt