ALOA
Oxford
RLM
Hình 12: Đĩa ALOA và khuẩn lạc Listeria monocytogenes trên ALOA
Hình 13: Đĩa Oxford và khuẩn lạc Listeria monocytogenes trên Oxford
Hình 14: Đĩa RAPID’L.mono và khuẩn lạc Listeria monocytogenes trên
3) Môi trường thử sinh hóa
Hình 17: Khuẩn lạc Listeria trên TSYEA
Hình 18: Phản ứng Henry illumination
của Listeria spp
Hình 19: Hoạt tính tan huyết của
Listeria monocytogenes
Hình 20: Di động dù của Listeria
monocytogenes
Hình 15: Khuẩn lạc Listeria spp.
trên RAPID’L.mono
Hình 16: Khuẩn lạc Listeria ivanovii và
Listeria monocytogenes trên RAPID’L.mono
Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản Hình 21: Đường Xylose và Rhamnose Hình 22: Listeria monocytogenes Xylose (-) và Rhamnose (+) Hình 23: Thử nghiệm CAMP
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Sổ tay kiểm nghiệm vi sinh thực phẩm thủy sản - Nhà xuất bản nông
nghiệp Hà Nội – 2004.
2. Hướng dẫn quản lý hoạt động kiểm nghiệm tại cơ sở chế biến thủy sản -
nhà xuất bản Nông Nghiệp.
3. Ứng dung phương pháp PCR (Polymerase chain reaction) trong phát
hiện nhanh Listeria monocytogenes (Nguyến Thị Kim Hoa, Tô Kim Anh
– Viện Công nghệ sinh học – Công nghệ thực phẩm, Đại học Bách
Khoa Hà Nội 1, Đại Cồ Việt, Hai Bà Trưng Hà Nội, Fax: 48682452, tokimanh@mail.hut.edu.vn )
4. Báo cáo thẩm tra phương pháp phân tích định tính Listeria
monocytogenes trong thực phẩm ISO 11290-1:2004 của Trung Tâm
chất lượng, an toàn vệ sinh & thú y thủy sản vùng 6)
5. www.google.com.vn.
Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản
LỜI CẢM ƠN
Trãi qua thời gian dài học tập, đến nay kiến thức về chuyên môn tôi đã nắm được nhiều vấn đề. Trong thời gian thực hiện đề tài nghiên cứu tại Trung
Tâm quản lý chất lượng thực phẩm & thú y thủy sản vùng 6 để hoàn thành luận văn tốt nghiệp tôi cũng đã học hỏi rất nhiều từ thực tế. Có thể vận dụng
tốt vào công việc trong tương lai. Đạt được kết quả như ngày nay ngoài công
sức của bản thân tôi còn được sự giúp đỡ của nhiều người.
Trước tiên tôi xin gởi ngàn lời tri ân đến ba mẹ, các anh chị em trong gia đình tôi đã hỗ trợ rất nhiều về mặt vật chất cũng như tinh thần, giúp tôi
vượt qua nhiều khó khăn trong quá trình học tập tại trường.
Tôi xin chân thành cảm tập thể giáo viên, cán bộ Bộ môn Dinh Dưỡng & chế biến thủy sản Khoa Thủy Sản Trường Đại Học Cần Thơ đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp này.
Đặc biệt, tôi vô cùng xúc động, cám ơn thầy Phạm Văn Hùng phó giám
đốc Trung Tâm quản lý chất lượng thực phẩm & thú y thủy sản vùng 6 đã tận tình hướng dẫn, quan tâm và góp ý để tôi hoàn thành luận văn này.
Tôi cũng chân thành cảm ơn các anh chị trong phòng kiểm nghiệm vi sinh của Trung Tâm quản lý chất lượng thực phẩm & thú y thủy sản vùng 6.
Đặc biệt cám ơn chị Trang, chị Hà, chị Trinh anh Bình, anh Thế Anh, anh Thư
anh Thiệt đã tận tình đóng góp chỉ dẫn tôi hoàn thành luận văn này.
Trong quá trình thực hiện đề tài tôi cũng nhận được rất nhiều lời động viên từ bạn bè trong lớp đã giúp ích cho tôi rất nhiều về mặt tinh thần.
Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn!
Cần Thơ
Sinh viên thực hiện
TÓM LƯỢC
Để ứng dụng phương pháp phân tích nhanh trên RAPID’L.mono phát hiện Listeria monocytogenes trong sản phẩm thủy sản thay thế phương pháp phân tích định tính chỉ tiêu Listeria monocytogenes theo ISO 11290-1:2004 thì
phương pháp phải có ưu điểm hơn và tương đồng với phương pháp thay thế.
Đề tài đã tiến hành nghiên cứu các vấn đề sau trên phương pháp phân tích nhanh RAPID’L.mono: xác định độ đặc hiệu, xác định độ nhạy, xác định độ
lặp lại. Từ đó tổng hợp đánh giá mức độ tương đồng của hai phương pháp
phân tích RAPID’L.mono và ISO 11290-1:2004. Kết quả nghiên cứu cho thấy
phương pháp phân tích nhanh RAPID’L.mono có độ đặc hiệu cho khuẩn lạc
Listeria monocytogenes, độ nhạy của phương pháp (LOD50 = 8. Với độ tin cậy
95% LOD50 nằm trong khoảng 7 – 10 tế bào/25g), độ lặp lại của phương pháp với L = 29 tế bào là 100%, hai phương pháp tương đồng với nhau về độ đặc hiệu, độ nhạy, độ lặp lại. Thời gian cho kết quả của phương pháp theo ISO 11290-1:2004 là 4 – trên 7 ngày, RAPID’L.mono là 2-3 ngày.
Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
L. Listeria
R. equi Rodococcus equi
S. aureus Saphylococcus aureus
AOAC Association of Analytial Communities (Hiệp hội
các nhà phân tích)
FDA Food and Drug Administration (Cục quản lý thực
phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ)
ISO International Standard Organization (Tổ chức tiêu
chuẩn Quốc Tế)
PCR Polymerase Chain Reacion
HF Half Fraser Broth
ALOA Listeria selective Agar Base acc OTTAVIANI and
AGOSTI
TSYEA Trytone soya broth Yeast extract Agar
TSYEB Trytone soya broth Yeast extract
TSA Tryptic Soy Agar
BHI Brain Heart Infusion
Nafiqad 6 Trung Tâm quản lý chất lượng thực phẩm & thú y
MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn...i
Tóm lược ...ii
Danh mục từ viết tắt...iii
Mục lục...iv
Danh sách bảng ...vi
Danh sách hình ...vii
Phần 1: ĐẶT VẤN ĐỀ... 1
1.1. Giới thiệu...1
1.2. Mục tiêu của đề tài...1
1.3. Nội dung nghiên cứu...2
1.4. Thời gian thực hiện đề tài ...2
Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU... 3
2.1. Giới thiệu về Listeria monocytogenes...3
2.1.1. Phân loại học...3
2.1.2. Hình thái học...3
2.1.3. Đặc điểm sinh lý...4
2.1.4. Khả năng chịu đựng...4
2.1.5. Phân bố, nguồn lây nhiễm...5
2.1.6. Đặc điểm gây bệnh………..5
2.2. Phương pháp định tính chỉ tiêu Listeria monocytogens ...7
2.2.1. Theo ISO 11290 -1:2004 ...7
2.2.2. Phương pháp phân tích nhanh trên RAPID’L.mono ...11
2.3. Một số môi trường chính...13
2.3.1. Môi trường Half Fraser Broth (HF)...13
2.3.2. Môi trường Fraser Borth...13
2.3.3. Thạch ALOA...13
2.3.4. Thạch Oxford...14
2.3.5. Môi trường không chọn lọc TSYEA, TSYEB...15
2.3.6. Rhramnose, Xylose. ...16
2.3.7. Môi trường thạch máu (Blood agar) ...16
2.3.8. Motility Agar ...17
2.3.8. Môi trường lỏng BHI (Brain Heart Infusion)...17
Phần 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM... 18
3.1. Vật liệu...18
3.1.1. Mẫu thực phẩm...18
3.1.2. Môi trường, hóa chất...18
3.1.3. Thiết bị và vật dụng...18
3.1.4. Lấy mẫu...19
3.2. Phương pháp thí nghiệm... 19
3.2.1. Thí nghiệm 1: Xác định độ đặc hiệu của phương pháp . ...19
Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản
3.2.3. Thí nghiệm 3: Xác định độ lặp lại của phương pháp...23
3.2.4. Thí nghiệm 4: Kiểm tra độ tương đồng của phương pháp...24
Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN... 26
4.1. Hình dạng khuẩn lạc trên 3 loại môi trường đặc hiệu...26
4.1.1.Trên môi trường ALOA...26
4.1.2.Trên môi trường Oxford ... 26
4.1.3.Trên môi trường RAPID'L.mono ... 26
4.2. Kết quả thí nghiệm 1... 27 4.3. Kết quả thí nghiệm 2...311 4.4. Kết quả thí nghiệm 3 ...344 4.5. Kết quả thí nghiệm 4 ...344 Phần 5: KẾT LUẬN CHUNG... 36 Phần 6: KIẾN NGHỊ... 37 PHỤ LỤC HÌNH...38
1) Môi trường sử dụng trong luận văn...38
2) Môi trường phân lập...40
3) Môi trường sinh hóa...41
DANH SÁCH BẢNG
Trang
Bảng 2.1. Đặc điểm khác nhau của các loài thuộc giống Listeria ... 4
Bảng 2.2. Một số thông số cơ bản của Listeria... 4
Bảng 3.2.1. Danh mục các chủng vi sinh vật thử nghiệm... 19
Bảng 4.2.1. Kết quả thí nghiệm 1……... 28
Bảng 4.2.2. Kết quả phân tích trên nền mẫu cá tra phi lê đông lạnh... 28
Bảng 4.3. Kết quả thí nghiệm 2………... 31
Bảng 4.4. Kết quả thí nghiệm 3…………... 33
Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản
DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 2.2.1.2: Sơ đồ phân tích Listeria monocytogenes theo ISO 11290 -1: 2004... 8
Hình 2.2.2.2: Sơ đồ phân tích nhanh Listeria monocytogenes trên RAPID’L.mono ... 12
Hình 3.2.1: Sơ đồ thí nghiệm 1 ... 19
Hình 3.2.2: Sơ đồ thí nghiệm 2 ... 21
Hình 3.2.3: Sơ đồ thí nghiệm 3 ... 23
Hình 3.2.4: Sơ đồ thí nghiệm 4 ... 25
Hình 4.1: Ảnh chụp khuẩn lạc Listeria monocytogenes điển hình trên ALOA (a), Oxford (b) và RAPID’L.mono (c) ... 27
Hình 4.2.1: Ảnh chụp khuẩn lạc Listeria monocytogenes điển hình trên RAPID’L.mono ... 29
Hình 4.2.2: Ảnh chụp khuẩn lạc Listeria ivanovii điển hình trên RAPID’L.mono ... 29
Hình 4.2.3: Ảnh chụp khuẩn lạc các chủng vi sinh vật trên RAPID’L.mono ... 30
Hình 4.2.4: Ảnh chụp mẫu A6 mẫu đối chứng không chứa vi sinh vật trên RAPID’L.mono ... 30
Hình 4.3.1: Ảnh chụp khuẩn lạc Listeria monocytogenes điển hình với mật độ gây nhiễm trên mức LOD50... 32
Hình 4.3.2: Ảnh chụp khuẩn lạc Listeria monocytogenes điển hình với mật độ gây nhiễm ở mức LOD50... 33
Hình 4.3.3: Ảnh chụp khuẩn lạc Listeria monocytogenes điển hình với mật độ gây nhiễm dưới mức LOD50... 33