Bảng 4.7. Sản phẩm PCR với 2 cặp primer theo quy trình nhiệt 4.
Khi chạy multiplex PCR với 6 mẫu, chỉ thu đƣợc một band 0,8 kp ở các mẫu 2, 4, 6 (Hình 4.7). Đối chiếu với các kết quả thu đƣợc ở Hình 4.5 và Hình 4.6, chúng tôi cho rằng phản ứng multiplex PCR chƣa thành công là do các thành phần trong phản ứng chƣa tối ƣu cho phản ứng multiplex PCR xảy ra. Đặc biệt, tỉ lệ các primer trong phản ứng multiplex PCR là rất quan trọng. Cần phải tiến hành khảo sát nồng độ các primer để tìm ra tỉ lệ primer thích hợp trong phản ứng. Để tối ƣu phản ứng, có thể thực hiện khảo sát thêm các thành phần quan trọng khác trong phản ứng nhƣ MgCl2 , dNTP’s, Taq DNA polymerase.
L: ladder (2 kb). N: đối chứng âm (không có DNA). H là sản phẩm PCR khi thực hiện PCR mẫu 4 với cặp primer W11. F là sản phẩm PCR khi thực hiện PCR mẫu 4 với cặp primer T1. 1 – 6 là sản phẩm PCR thu đƣợc khi thực hiện multiplex PCR các mẫu 1 -6 với 2 cặp primer T1 và W11.
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận
Phƣơng pháp ly trích
Thực hiện phản ứng PCR trên chromosome giới tính nên chất lƣợng DNA là rất quan trọng. Qua kết quả ly trích rút ra kết luận: quy trình ly trích 2 ở mục 3.3.4 là quy trình đơn giản, giúp thu đƣợc DNA có chất lƣợng tốt. Qua thực nghiệm, chúng tôi nhận thấy, với mẫu DNA ly trích theo quy trình 2, không cần phải tinh sạch, chỉ cần pha loãng DNA, vẫn có thể thực hiện thành công phản ứng PCR.
Kỹ thuật PCR
Dựa vào kết quả chạy PCR có thể xác định đƣợc giới tính cây đu đủ với mức độ chính xác rất cao. Bƣớc đầu đã tìm đƣợc quy trình nhiệt tƣơng đối ổn định cho 2 cặp primer T1 và W11. Tuy nhiên, do giới hạn thời gian, chúng tôi chƣa tối ƣu đƣợc các thành phần của phản ứng multiplex PCR với các cặp primer T1 và W11. Từ những kết quả thu đƣợc, chúng tôi cho rằng các yếu tố quan trọng ảnh hƣởng kết quả PCR trong nghiên cứu này gồm giống, chất lƣợng DNA, quy trình nhiệt.
5.2. Đề nghị
Vì đây là nghiên cứu cơ bản để tạo điều kiện thuận lợi cho những nghiên cứu tiếp theo nhƣ nuôi cấy mô đu đủ, chuyển gen cây đu đủ, lai tạo giống, với những kết quả đã đạt đƣợc, chúng tôi có một vài đề nghị sau:
- Tiếp tục hoàn thiện phƣơng pháp xác định giới tính cây đu đủ bằng kỹ thuật PCR với các cặp primer T1 và W11.
- Tiến hành xác định giới tính trên những giống đu đủ trồng ở nƣớc ta. - Tiến tới giải trình tự sản phẩm PCR.
TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999. Di truyền phân tử - Những nguyên tắc
cơ bản trong chọn giống cây trồng. Nhà xuất bản Nông nghiệp.
2. Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 2004. Di truyền học phân tử. Nhà xuất bản nông nghiệp.
3. Bùi Trang Việt, 2005. Sinh học tế bào. Nhà xuất bản đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh. 434 trang.
4. Dƣơng Tấn Lợi, 2002. Kỹ thuật trồng cây ăn quả (ca cao, đu đủ). 61 trang. 5. Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1998. Sinh học phân tử (Khái niệm- Phương pháp-
Ứng dụng). Tái bản lần thứ nhất. Nhà xuất bản Giáo dục, TP. HCM. 301 trang.
6. Nguyễn Đức Lƣợng, 2002. Công nghệ gen. Nhà xuất bản đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh.
7. Nguyễn Thành Hối, Dƣơng Minh và Võ Thanh Hoàng, Khoa Trồng trọt, Đại học Cần Thơ, 1996. Cây đu đủ. Nhà xuất bản Nông Nghiệp, Hà Nội. 20 trang. 8. Nguyễn Thị Lang, 2002. Phương pháp cơ bản trong nghiên cứu công nghệ sinh
học. Nhà xuất bản nông nghiệp TP. Hồ Chí Minh.
9. Nguyễn Văn Uyển, 1995. Những phương pháp công nghệ sinh học thực vật, Tập 1. Nhà xuất bản nông nghiệp.
10.Nhiều tác giả, 2002. Phương pháp nhân giống cây ăn quả. Nhà xuất bản dân
tộc Hà Nội.
11.Phạm Thành Hổ, 2003. Di truyền học. Nhà xuất bản giáo dục. 613 trang.
12.Trần Thế Tục - Đoàn Thế Lƣ, 2002. Cây đu đủ và kỹ thuật trồng. Nhà xuất bản lao động - xã hội Hà Nội. 52 trang.
13.Trần Thế Tục, 1999. Kỹ thuật trồng xoài, na, đu đủ, hồng xiêm. Nhà xuất bản nông nghiệp Hà Nội.
TÀI LIỆU TIẾNG NƢỚC NGOÀI
15.Detuty J. C., et al. Molecular marker for sex determination in papaya, 2002. Theor Appl Genet 106. p 107 – 111.
16.Henry R. J, 1997. Practical applications of plant molecular biology. Chapman & Hall. 258 pages. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
17.Kurt Weising, Hilde Nybom, Kirsten Wolff, Wieland Meyer, 1995. DNA fingerprinting in plants and fungi. CRC Press. 322 pages.
18.Magdalita P. M and Mercado C. P., 2002. Sex determination in papaya by PCR.
PCARRD, Los Banos, Laguna, Philippines.
19.Magdalita P. M., Drew R. A., Adkins S. W. and Godwin I. D.,1997. Morphological, molecular and cytological analyses of Carica papaya x C. cauliflora interspecific hybrids. Theoretical and applied Genetics 95. p 224 – 229. 20.McPherson M. J. and Moller S. G., 2000. PCR. BIOS. 276 pages.
21.Paranis A. S., Gupta V. S., Tamhanhar S. A., Ranjekar P. K., 1999. Microsatellite (GATA)n reveal sex specific differences in papaya. Theor Appl Genet 99. p 1047 – 1052.
22.Paranis A. S., Gupta V. S., Tamhanhar S. A., Ranjekar P. K., 2000. A highly reliable sex diagnotic PCR assay for mass screening of papaya. Molecular Breeding 6. p 337 -344.
23.Sambrook and Russell, 2001. Molecular cloning, a laboratory manual. Volume 2. Third edition. CSHL Press. p 8.1 - 8.24.
24.Somri S., Jobin M.,Drew R. A., Lawson W. and Graham M. W.,1998. Developing molecular marker for sex prediction in papaya. Acta Horticulture. p 24 – 29. 25.Sondur S. N., Manshardt R. M. and Stiles J. I., 1996. A genetic linkage map of
papaya based on radomly amplified polymorphic DNA markers. Theor Appl Genet 99. p 547 – 553.
26.Zhiyong Liu, et al, 2004. A primitive Y chromosome in papaya marks incipient sex chromosome evolution. Nature 427. p 348 – 352.
TÀI LIỆU TỪ INTERNET
27. www.hawaiiag.owww.elsevier.com/locate/scihorti 28. www.nature.com/nature
29. http://www.ogtr.gov.au/pdf/ir/papaya.pdf 30. www.sciencedirect.com/sciencerg/harc