thí nghiệm.
4.3.1 Hoạt tính của Acetylcholinestrease (AChE) trong não, gan cá tra trong quá trình thí nghiệm
Bảng 14: Biến đổi hoạt tính của AChE (nmole/phút/mg protein) trong não, gan theo thời gian qua các đợt thu mẫu
Cơ quan Nghiệm thức Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Não Đối chứng 2103 ± 774 2317 ± 35 2392 ± 111 2349 ± 86 0,1ppm 2353 ± 137 ns 2050 ± 251ns 1847 ± 246ns 1897 ±137ns 1ppm 2031 ± 495ns 2054 ± 72* (11%) 1404 ± 208* (41%) 1340 ±103* (43%) Gan Đối chứng 1722 ± 304 1909 ± 367 1680 ± 134 1212 ± 44 0,1ppm 1548 ± 292ns 1054 ± 37* (45%) 1609 ± 148ns 1097 ± 128ns 1ppm 1909 ± 367ns 1488 ± 31ns 1487 ± 464ns 1177 ± 37ns
Kết quả trình bày trung bình ± SD. Dấu sao (*) chỉ sai khác có ý nghĩa thống kê so với đối chứng (P<0,05). ns chỉ không
sai khác so với đối chứng. Số liệu trong ngoặc là tỷ lệức chế (%)
Acetylcholinestrease (AChE) là một chất hoá học thần kinh đóng vai trò như một tác nhân dẫn truyền thông tin qua các thể tiếp hợp giữa hai tế bào thần kinh (Ellman
và ctv, 1961). Kết quả của bảng 14 cho thấy hoạt tính của AChE ở cá tra trong não 2103 ± 774 (nmole/phút/mg protein) cao hơn ở gan 1722 ± 304 (nmole/phút/mg protein) ở trạng thái không chịu tác động của MG (Lần 1). Sau khi có sự tác động của MG thì hoạt động của AChE bị ức chế một cách đáng kể và mức độức chế này còn phụ thuộc vào nồng độ của MG trong thí nghiệm, thời gian gây nhiễm với MG. Hoạt động AChE bị ức chế thể hiện rõ nét ở não, đặc biệt ở nồng độ gây nhiễm 1 ppm trong thời gian 60 phút 2054 ± 72 (nmole/phút/mg protein) giảm 11% và khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với đối chứng, trong khi đó ở nồng độ gây nhiễm 0,1 ppm trong thời gian 12 giờ thì không khác biệt so với đối chứng. Sau khi chuyển cá ra môi trường nước không chứa MG, nghiệm thức 1ppm MG, hoạt động AChE vẫn bị ức chế và không có dấu hiệu hồi phục, 1404 ± 208 (nmole/phút/mg protein) ( ức chế 41 % so với đối chứng) ở 12 giờ sau khi kết thúc gây nhiễm (lần 3) và 1340 ± 103 (nmole/phút/mg protein) ( ức chế 43 % so với đối chứng) ở 4 ngày sau khi kết thúc gây nhiễm đều khác biệt có ý nghĩa thống kê so với đối chứng. Trong khi đó hoạt động của AChE trong gan thì không chịu ảnh hưởng bởi sự tác động của MG ở nồng độ 1ppm trong thời gian 60 phút. Hoạt động của AChE trong gan chỉ bị tác động của MG ở nồng độ 0,1ppm trong thời gian 12giờ gây nhiễm, 1054 ± 37(nmole/phút/mg protein), ức chế 45% so với đối chứng và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với đối chứng (P<0,05). Tuy nhiên sự ức chế của AChE trong gan không diễn ra lâu mà đã có sự phục hồi hoạt động của AChE từ 1054 ± 37
(nmole/phút/mg protein) (ức chế 45 % so với đối chứng) tăng lên 1609 ± 148 (nmole/phút/mg protein) không khác biệt có ý nghĩa thống kê so với đối chứng (P<0,05) sau 12giờ và 4 ngày kể từ khi kết thúc gây nhiễm.
Gan là cơ quan có chức năng quan trọng trong suốt quá trình giải độc sau khi xâm nhập vào cơ thể, nhiều loại men có chức năng oxy hóa hay giải độc của đa số sinh vật đều do gan sản sinh ra. Thời gian gây nhiễm ngắn (1giờ) dù ở nồng độ cao (1 ppm) sự ức chế hoạt tính AChE ở gan đã không xảy ra trong khi đó mặc dù với nồng độ thấp 0,1 ppm nhưng cá tiếp xúc với MG trong thời gian dài (12 giờ) thì hoạt tính AChE bịức chế.
Các nghiên cứu cũng đã chứng minh sự biến đổi của AChE khi bị tác động bởi một tác nhân hoá học. Trichlorfon là một loại thuốc trừ sâu gốc lân hữu cơ được dùng trong nuôi trồng thuỷ sản để diệt ngoại kí sinh. Thí nghiệm ảnh hưởng của Trichlorfon ở 2 nồng độ 0,25mg/L trong thời gian 1 giờ và 0,5mg/L trong thời gian 24 giờ lên hoạt tính AChE ở não cá chép gần trưởng thành. Kết quả cho thấy hoạt động AChE ở thời gian gây nhiễm 24 giờ giảm 55-57% so với đối chứng và phục hồi lại trạng thái bình thường sau 7 ngày (Aruni Udara Chadrasekara và Asoka Pathiratne, 2005).
Nguyễn Văn Công và ctv (2006) nghiên cứu ảnh hưởng của Diazon lên hoạt tính của men cholinesterase (ChE) ở ba mức nồng độ 0,016mg/l, 0,079mg/l và 0,35mg/l trong 4 ngày trong hệ thống bể composite có sục khí liên tục. Kết quả cho thấy Diazon làm giảm hoạt tính ChE ở nồng độ 0,016mg/l. Sựức chế này gia tăng theo sự gia tăng của nồng độ. Hoạt tính ChE chỉ phục hồi hoàn toàn ở nồng độ 0,016mg/l khi kết thúc thí nghiệm
T. Balint và ctv (1995) nghiên cứu ảnh hưởngthuốc trừ sâu Methidathion (MD) và Deltamethein (DM) làm biến đổi hoạt tính AChE ở não loài cá chép trưởng thành (Cyprinus Carpio L), ở nồng độ trị bệnh 2 mg/l MD sau 5 ngày gây nhiễm làm giảm 70-90% hoạt tính AChE ở cơ quan não, trong khi đó ở nồng độ 2 mg/l DM sau 3 ngày không thâý được sự biến đổi của hoạt tính AChE.
Hiran M. Dutta và Dane. A. Arends (2003) thí nghiệm ảnh hưởng của endosufan lên hoạt động AChE trên não của cá Lepomis macrochius. Thí nghiệm được tiến hành gây nhiễm trong các khoảng thời gian là 0, 24, 48, 72, 96 giờ và 1 tuần ở nồng độ 1,0 µg/l (dựa vào LC50 của endosulfan đối với cá Lepomis macrochius là 1,2 µg/l ). Kết quả cho thấy hoạt động của AChE trong não giảm theo sự gia tăng của thời gian gây nhiễm tương ứng là 0%, 3,57%, 12,65%, 14,23%, 16,31% và 23,11%.
Theo Bhavan và Geraldine (2000) ở nồng độ thấp 10,6 – 32,0 ng/l Endosulfan có thể làm thay đổi về sinh hoá và sinh lý bên trong cơ thể của Macrochrachium malcolmsonii giai đoạn giống, làm giảm hoạt tính của men Acetylcholinesterase (AChE).
Silva và ctv (1993) cho rằng hoạt tính AChE trong huyết tương cá Callichthys bị hoá chất bảo vệ thực vật gốc lân hữu cơ methy parathium (ở nồng độ dưới mức gây chết ) ức chế 90% sau 4 giờ gây nhiễm và duy trì mức ức chế này trong 4 ngày, sau đó khôi phục ở 8-10 ngày kế tiếp và đạt 80-90% mức bình thường sau 35 ngày. Như vậy hoạt động AchE trong não cá tra nhạy hơn ở gan hay số lượng men AchE có sẵn trong não nhiều hơn ở gan. Ở nồng độ gây nhiễm 1ppm trong thời gian 1giờ hoạt động AchE trong não cá tra không thể phục hồi trở lại có thể do thời gian để giải phóng men này khỏi sự ức chế là lớn hơn thời gian cơ thể cá tái tạo một men mới.
4.3.2 Hàm lượng của Lipid peroxidation (LPO) trong não, gan cá tra trong quá trình thí nghiệm trình thí nghiệm
Bảng 15: Biến đổi hàm lượng của LPO (nmol TBARS /g mẫu) trong não, gan theo thời gian qua các đợt thu mẫu.
Cơ quan Nghiệm thức Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Não Đối chứng 4,3 ± 1,04 2,64 ± 0,67 3,95 ± 0,84 4,12 ± 1,27 0,1ppm 3,44 ± 0,89 ns 8,81 ± 0,43 * 10,89 ± 2,06 * 13,9 ± 3,99* 1ppm 2,64 ± 0,67ns 10,4 ± 3,53 * 13,9 ± 1,33 * 10,0 ± 2,62* Gan Đối chứng 27,03 ± 1,7 27,00 ± 5,88 29,6 ± 1,97 26,61 ± 1,97 0,1ppm 19,76 ± 2,76 ns 32,43 ± 8,33ns 33,38 ± 4,84ns 33,38 ± 4,84ns 1ppm 27,00 ± 5,88 ns 26,76 ± 7,51ns 27,95 ± 3,97ns 27,95 ± 3,97ns
Kết quả trình bày trung bình ± SD. Dấu sao (*) chỉ sai khác có ý nghĩa thống kê so với đối chứng (P<0,05).
ns chỉ không sai khác so với đối chứng.
Lipid peroxidation là chất có liên quan đến các tác nhân oxy hoá trong cơ thể thường góp phần vào tiến trình phát sinh bệnh (Jollon và ctv, 1974).
Vào thời điểm kết thúc quá trình gây nhiễm và 12h và 4 ngày kể từ khi kết thúc quá trình gây nhiễm hàm lượng LPO trong não cá tăng lên đáng kể và khác biệt có ý nghĩa thống kê (P<0,05) so với đối chứng lần lượt là 8,81 ± 0,43; 10,89 ± 2,06 và
13,9 ± 3,99 (nmol TBARS /g) mẫu ở nồng độ gây nhiễm là 0,1ppm và 10,4 ± 3,53; 13,9 ± 1,33; 10,0 ± 2,62 (nmol TBARS /g) mẫu ở nồng độ gây nhiễm là 1ppm. Đối với gan, tác động gây nhiễm MG không ảnh hưởng đến hàm lượng LPO trong gan, khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với đối chứng qua từng giai đoạn. Khi gây nhiễm MG với cá trong thời gian 12h ở nồng độ 0,1 ppm; 1ppm trong 1h thì hoạt tính LPO trong não tăng lên. Do não là cơ quan trung ương cho tất cả hoạt động sống trong cơ thể cá khi tiếp xúc trực tiếp với MG thì não bịảnh hưởng nhanh nhất làm cho cá bị streess.
Pandey và ctv (2000) nghiên cứu về cơ chế gây độc của endosulfan làm gia tăng LPO. Tác giả tiến hành thí nghiệm trên cá Channa punctatus (23-50g/con), khi gây nhiễm với endosulfan nồng độ thấp 5ug/l, kết quả LPO gia tăng có ý nghĩa so với
đối chứng ở các cơ quan gan, thận, mang. Sự gia tăng của LPO kéo theo các nhân tố chống oxy hoá cũng tăng theo. Trong thí nghiệm này hoạt tính LPO trong gan cá tra không khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng. Kết quả này tương tự Elif Ozan Oruc (2000) tiến hành thí nghiệm ảnh hưởng của 2,4-D và azinphosmethyl lên các men chống oxy hoá và lipid peroxidase ở gan cá rô phi (Oreochromis niloticus). Kết quả cho thấy cá rô phi có khả năng chống lại stress oxy hoá bằng các cơ chế kháng oxy hoá và chống lại sự gia tăng của hàm lượng lipid peroxydation
4.3.3 Hoạt tính của men Glutathione-S-transferas (GST) trong não, gan cá tra trong quá trình thí nghiệm
Bảng 16: Biến đổi hoạt tính của GST (nmol/mg protein/phút) trong não, gan theo thời gian qua các đợt thu mẫu.
Cơ quan Nghiệm thức Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Não Đối chứng 723 ± 112 691 ± 140 723 ± 162 563 ± 37 0,1ppm 730 ± 102ns 1068 ± 94* 790 ± 49ns 616 ± 93ns 1ppm 691 ± 140ns 1005 ± 104* 773 ± 164ns 779± 112ns Gan Đối chứng 499 ± 34 558. ± 31 548 ± 36 517 ± 144 0,1ppm 569 ± 48ns 559 ± 14ns 791 ± 40* 512 ± 97ns 1ppm 558 ± 31ns 583 ± 20ns 693 ± 105ns 506 ± 40ns
Kết quả trình bày trung bình ± SD. Dấu sao (*) chỉ sai khác có ý nghĩa thống kê so với đối chứng (P<0,05).
ns chỉ không sai khác so với đối chứng.
GST là men xúc tác phase II quan trọng trong quá trình làm giảm Glutathione (GSH) tiếp hợp lên tế bào làm phá huỷ tế bào do sự tấn công của ROS dẫn đến sự làm giảm độc tính của chúng (Storey, 1996). Hoạt động của men GST trong não cá vào thời điểm kết thúc gây nhiễm ở hai nồng độ gây nhiễm 0,1ppm và 1ppm lần lượt là 1068± 94, 1005 ± 104 (nmol/mg protein/phút) cao hơn và khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng (P<0,05). Tuy nhiên 12 giờ và 4 ngày sau khi kết thúc gây nhiễm thì hoạt tính GST trong não cá không có sự khác biệt giữa các nghiệm thức so với đối chứng (P>0,05).
GST hoạt động trong gan tương đối chậm. Ở nồng độ gây nhiễm là 1ppm trong thời gian 60 phút thì không biểu hiện thay đổi của men GST trong khi đó ở nồng độ gây nhiễm 0,1ppm trong thời gian 12 giờ thì men GST chỉ hoạt động sau khi kết thúc gây nhiễm 12 giờ là 791± 40 (nmol/mg protein/phút) cao hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê (P<0,05) so với đối chứng. Do tác dụng của MG lúc này chưa ảnh hưởng làm biến đổi hoạt tính GST, 12 giờ kết thúc gây nhiễm GST có biển đổi và khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng ở nồng độ 0,1 ppm có thể là ở não các men giải độc sinh ra không đủ khả năng để trung hoà độc tính của MG, sau một khoảng thời gian (12 giờ kết thúc gây nhiễm) tác dụng của MG đến gan, sau đó các men giải độc ở gan được sinh ra. Đó có thể là nguyên nhân làm cho GST tăng lên.
Hoạt tính này tăng có thể do khi gây nhiễm với MG cá tăng cường trao đổi chất chúng gia tăng trao đổi chất qua mang để lấy đủ oxy cho nhu cầu của cơ thể. Đây là điều kiện làm cho MG hoà tan vào nước có nhiều cơ hội tiếp xúc với mang và xâm nhập vào cơ thể đặt biệt là ở não khi đó cơ thể mới sản sinh ra men GST để giải độc. Elif Ozcan Orue và Nevin Uner (2000) nghiên cứu tác động 2,4-D ở nồng độ 27 ppm và thuốc trừ sâu azinphosmethy ở nồng độ 0,03 ppm ảnh hưởng đến hoạt tính của men GST và lipid peroxidation trên cá rô phi, trong cả hai trường hợp sử dụng riêng lẻ và kết hợp tắm cá ở các thời gian 24, 48, 72, 96 giờ cho thấy hoạt tính CAT, GST và mức độ MDA trong gan loài cá O. niloticus không có sự biến đổi. Jimena Cazenave và ctv (2005) thí nghiệm sựảnh hưởng của micocystin-RR (MC- RR) đến hoạt động của các men trên gan, mang, não của cá Corydoras paleatus. Tiến hành gây nhiễm MC-RR ở các nồng độ 0,5; 2,5; và 10µg/L sau 24 giờ. Kết quả cho thấy ở nồng độ MC-RR (lớn hơn hoặc bằng 2µg/L thì LPO trong não có sự thay đổi trong khi đó ở gan, mang vẫn bình thường. Đối với hoạt tính GST ở gan, não giảm ở nồng độ 0,5µg/L và CAT tăng ở gan đối với các nồng độ thí nghiệm.
Tương tự nghiên cứu của Bhavan và Geraldine (2000) ở nồng độ endosulfan lần lượt là (10,6; 16,0; 3,2ng/l) sau 21 ngày gây nhiễm qua các giai đoạn thu mẫu ở các ngày 1, 8, 15, 21 cho thấy có sự biến đổi sinh hoá, sinh lý trong cơ thể
Macrobrachium malcolmsoii giai đoạn giống làm tăng hoạt tính của enzim GST so với đối chứng.
4.3.4 Hoạt tính của men Glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) trong não, gan cá tra trong quá trình thí nghiệm não, gan cá tra trong quá trình thí nghiệm
Bảng 17: Biến đổi hoạt tính của G6PD (nmol NADPH/phút/mg protein) trong não, gan theo thời gian qua các đợt thu mẫu.
Cơ quan Nghiệm thức Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Não Đối chứng 31,16 ± 2,48 32,14 ± 3,61 30,02 ± 4,19 20,71 ± 4,46 0,1ppm 29,02 ± 7,93ns 32,22 ± 6,81ns 21,73 ± 2,49* 21,81 ± 5,59ns 1ppm 32,14 ± 3,61ns 31,60 ± 7,82ns 23,83 ± 8,91ns 15,81 ± 3,32ns Gan Đối chứng 75,61 ± 17,72 75,84 ± 9,16 79,31 ± 7,50 73,40 ± 22,3 0,1ppm 83,44 ± 0,46ns 65,57 ± 5,88ns 64,88 ± 4,13ns 62,24 ± 11,17ns 1ppm 75,84 ± 9,16ns 62,03 ± 13,66ns 72,11 ± 20,33ns 59,25 ± 8,94ns
Kết quả trình bày trung bình ± SD. Dấu sao (*) chỉ sai khác có ý nghĩa thống kê so với đối chứng (P<0,05). ns chỉ không
sai khác so với đối chứng.
Từ kết quả bảng 17 cho thấy hoạt động của men G6PD trong não, gan của cá tra ở cả 2 nghiệm thức 0,1 ppm và 1 ppm vào thời điểm kết thúc gây nhiễm không có sự khác biệt so với nghiệm thức đối chứng (P > 0,05). Ở thời điểm 12 giờ sau khi kết thúc gây nhiễm, hoạt động của G6PD trong não có sự biến đổi 21,73 ± 2,49 (nmol NADPH/phút/mg protein) và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với đối chứng, trong
khi ở nồng độ gây nhiễm 1ppm trong 1giờ thì không có sự khác biệt của G6PD so với đối chứng.
Elif Ozan Oruc (2000) tiến hành thí nghiệm ảnh hưởng của 2,4-D và azinphosmethyl lên các men chống oxy hoá và lipid peroxidase ở gan cá rô phi (Oreochromis niloticus). Khi sử dụng riêng lẻ hoặc kết hợp 2,4-D ở nồng độ 27ppm và 0,03 ppm azinphosmethyl trong các khoảng thời gian 24, 48, 72 và 96 giờ. Kết quả cho thấy hoạt tính G6PD tăng so với đối chứng khi sử dụng riêng lẻ 2,4-D sau 24 giờ, ở 96 giờ không ảnh hưởng đến hoạt tính G6PD, trong khi đó khi sử dụng kết hợp làm tăng G6PD đáng kể.
4.3.5 Hoạt tính của men Catalase (CAT) trong não, gan cá tra trong quá trình thí nghiệm. thí nghiệm.
Bảng 18: Biến đổi hoạt tính của CAT (U/mgprotein) trong não, gan theo thời gian qua các đợt thu mẫu. Cơ quan Nghiệm thức Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Não Đối chứng 0,0038 ± 0,0003 0,0028 ± 0,0004 0,003 ± 0,001 0,0038 ± 0,0003 0,1ppm 0,0035 ± 0,0006ns 0,0039 ± 0,0002 * 0,0047 ± 0,0011ns 0,0035 ± 0,0006ns 1ppm 0,0031 ± 0,0001ns 0,0021 ± 0,0001 * 0,0038 ± 0,0004ns 0,0021 ± 0,0001ns Gan Đối chứng 0,0266 ± 0,0023 0,0237 ± 0,0062 0,0226 ± 0,0029 0,0266 ± 0,0023