4.2.1 Sự nhiễm WSSV ở mẫu ốc mượn hồn
Ốc mượn hồn là mẫu thu được nhiều nhất tại các điểm thu mẫu, loài ốc này rất
đa dạng về hình thái cũng như màu sắc (hình 4.1) và tỉ lệ nhiễm WSSV là rất cao.
Hình 4.1 Các mẫu ốc thu từ các trại sản xuất giống ở Bạc Liêu và Cà Mau Sự tồn tại của WSSV trong các mẫu ốc mượn hồn được phát hiện bằng phương pháp PCR 2 bước (Kimura et al. 1996) (hình 4.2). Lo et al. (1996) cũng đã nghiên cứu và phát hiện việc nhiễm WSSV trên các loài giáp xác hoang dã như
các loài cua thu trong ao tôm và ngoài tự nhiên. S. K. Otta et al. (1999) cũng đã dùng kỹ thuật PCR phát hiện WSSV trên các loài giáp xác nuôi và tự nhiên ở Ấn Độ. Nghiên cứu này phát hiện WSSV trên nhiều đối tượng khác nhau (tôm, cua, artemia…), cả trên đối tượng biểu hiện bệnh và không biểu hiện bệnh đốm trắng. Cả hai nghiên cứu trên đều sử dụng phương pháp phát hiện WSSV là kỹ
cua thu ngoài tự nhiên và mẫu ốc mượn hồn thu từ huyện Cái Nước – Cà Mau cũng cho kết quả dương tính với WSSV. Từđó cho thấy khả năng nhiễm WSSV trong các loài giáp xác hoang dại ở Bạc Liêu và Cà Mau là rất lớn.
Hình 4.2 Kết quảđiện di sản phẩm PCR ốc mượn hồn, mực và tôm tít Giếng M là thang DNA 1kb Giếng 1, 2, 3, 4 là những mẫu ốc mượn hồn dương tính Giếng 5 là mẫu mực dương tính Giếng 6, 7, 8 là những mẫu tôm tít dương tính Giếng 9 là đối chứng dương Giếng 10 là đối chứng âm
Hình 4.2 cho thấy, WSSV hiện diện trong các mẫu ốc mượn hồn được phát hiện bằng phương pháp PCR. Trong đó có cả mẫu của Bạc Liêu (giếng 1, 2) và mẫu của Cà Mau (giếng 3,4). Những mẫu này xuất hiện đồng thời hai vạch tương
4.2.2 Sự nhiễm WSSV ở mẫu mực
Bạc Liêu là điểm thu mẫu thức ăn đa dạng nhất có mực, ốc và cả tôm tít. Các mẫu mực được phân tích là phần thân được cắt sợi.
Hình 4.3 Các mẫu mực dùng trong các trại sản xuất giống tại Bạc Liêu Trong các mẫu mực thu về có một mẫu dương tính với phản ứng PCR 2 bước (phương pháp được sử dụng chung cho việc phát hiện WSSV trên ốc và tôm tít). Kết quả báo cáo của Trần Thị Phương Trang (2009) cũng có một mẫu mực dương tính khi sử dụng cùng một qui trình phát hiện như trên. Theo Lo et al. (1996), kết quả phân tích cho thấy nhóm giáp xác được thu từ ao tôm cũng cho kết quả WSSV dương tính với một qui trình PCR khác. Như vậy sự tồn tại của WSSV trong mực là hoàn toàn có khả năng. Hình 4.2 (giếng 5) cho thấy, WSSV hiện diện trong mẫu mực, được phát hiện bằng phương pháp PCR (đây là mẫu mực thu tại một trại sản xuất giống tại Bạc Liêu).
4.2.3 Sự nhiễm WSSV trên tôm tít
Các loài tôm tít cũng là một trong những thức ăn ưa thích của tôm bố mẹ tuy nhiên các trại ít sử dụng loại tôm này vì nghi khả năng nhiễm WSSV của chúng.
Hình 4.4 Mẫu tôm tít dùng cho tôm mẹ tại Bạc Liêu
Cả mẫu tôm tít thu về từ một trại sản xuất giống thuộc khu vực Bạc Liêu thì tất cảđều dương tính với WSSV. Kết quảở hình 4.2 (giếng 6, 7, 8) cho thấy WSSV hiện diện trong 3 mẫu tôm tít thu được ở Bạc Liêu, được phát hiện với phương pháp PCR 2 bước. Kết quả này cũng tương đồng với kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học ở Ấn Độ (Hossain et al. 2000). Với phương pháp PCR 2 bước, nhóm tác giả này đã công bố sự hiện diện của WSSV ở nhiều loài khác nhau (Metapenaeus dobsoni, Parapenaeopsis stylifera, Solenocera indica…) và cả
trên tôm tít (Squilla mantis). Bên cạnh đó kết quả nghiên cứu của Lo et al (1996) trên các loài giáp xác hoang dại đánh bắt từ tự nhiên (tôm sú tự nhiên, tôm he Nhật, tôm rằn, tôm thẻ đuôi đỏ) cũng cho kết quả WSSV dương tính ở PCR bước 2. Tuy số lượng mẫu tôm tít được kiểm tra là không nhiều nhưng cũng có thể tin vào khả năng tồn tại của WSSV trong mẫu tôm này.
4.2.4 Xác định sự nhiễm WSSV trong các mẫu thức ăn tươi sống với kít WSSV-IQ2000 WSSV-IQ2000
Một số mẫu dương tính ở hai tỉnh Bac Liêu và Cà Mau còn được chọn để kiểm tra với bộ kit WSSV-IQ2000. Kết quả cho thấy các mẫu được kiểm tra đều bị
nhiễm WSSV với cường độ nhẹ (hình 4.5). Các mẫu hiện vạch tương ứng 296 bp và xuất hiện cả vạch nội chuẩn tương ứng 848 bp. Theo nghiên cứu của Chưng Thị Nghiễm (2009) những mẫu cua tạp thu từ ao tôm ở Cà Mau cũng
được phát hiện nhiễm WSSV với qui trình của kit WSSV-IQ2000.
Hình 4.5 Kết quảđiện di các mẫu chạy PCR với bộ kit IQ2000
Giếng M là thang ADN
Giếng 1 là mẫu ốc của Cà Mau Giếng 2, 4 là mẫu ốc của Bạc Liêu
Giếng 3 là mẫu mực dương tính của Bạc Liêu
Kết quả này góp phần khẳng định sự nhiễm WSSV trong các mẫu được nghiên cứu. Tuy sản phẩm PCR khi sử dụng bộ kít WSSV-IQ2000 cho vạch không rõ
như sử dụng phương pháp của Kimura et al. 1996 nhưng qui trình này có thể đánh giá mức độ nhiễm của mẫu.
4.2.5 Xác định sự nhiễm WSSV trong mẫu thức ăn với phương pháp mô học học
Kết quả nghiên cứu mô học trên ốc mượn hồn cũng cho dấu hiệu đặc trưng khi nhiễm WSSV. Các tế bào của mô liên kết của cũng xuất hiện các thể vùi WSSV với vùng sáng bao quanh (hình 4.6). Do đây là lần đầu tiên mô ốc mượn hồn
được cắt thử theo qui trình của tôm nên hình ảnh còn chưa được đẹp cũng như
các cơ quan phát hiện có thể vùi WSSV là không nhiều.
Hình 4.6 Tế bào liên kết của ốc mượn hồn nhiễm WSSV (H&E, 100X) Dấu mũi tên chỉ tế bào có nhân phì đại với thể vùi WSSV. Dấu hiệu này không khác so với dấu hiệu mô học trên tôm của Lightner (1996) và của Lo et al. (1997). Theo Phạm Trần Nguyên Thảo (2003) khi xâm nhập vào cơ thể tôm, WSSV tạo các thể vùi trong nhân của tế bào mang, biểu bì ruột, dạ dày, biểu bì dưới vỏ, cơ quan lymphoid, tim, tuyến râu. Cơ quan tấn công của WSSV trên ốc mượn hồn được phát hiện trong nghiên cứu là tế bào liên kết của dạ dày nhưng chúng không tấn công trên các tế bào của tuyến gan tụy (hình 4.7). Kết quả này cũng cần được tìm hiểu thêm với số lượng mẫu nhiều hơn.
Hình 4.7 Cơ quan ống gan tụy của ốc mượn hồn (H&E, 40X) Từ kết quả mô học có thể tin rằng WSSV hoàn toàn có khả năng gây ra những biến đổi về mô học ở tế bào liên kết của dạ dày ốc mượn hồn hay các loài ốc này cũng mẫn cảm với WSSV và những tổn thương gây ra cũng tương tự trên tôm.
4.3.1 Xác định tỉ lệ nhiễm WSSV ở các mẫu thức ăn tại Bạc Liêu
Ở khu vực Bạc Liêu, ba loại thức ăn tươi sống (ốc mượn hồn, mực, tôm tít)
được thu với số lượng mỗi loại khác nhau. Trong đó 1/5 mẫu mực cho kết quả
dương tính với WSSV chiếm tỉ lệ 2,17 % tổng số mẫu được kiểm tra. Trong khi tôm tít kiểm tra 3 mẫu thì tất cảđều dương tính chiếm 6,52 %. Các mẫu chiếm
đa số trong đợt kiểm tra là mẫu ốc mượn hồn với tỉ lệ nhiễm WSSV là 45,65 %. Tỉ lệ nhiễm giữa các trại là không giống nhau, có trại thì dương tính cả 5/5 mẫu kiểm tra (2 trại), có trại thì chỉ nhiễm 1 hoặc 2 mẫu (5 trại).
Theo Lo et al. (1996), kết quả phân tích PCR của họ mười chân trong nhóm chân đốt hoang dại được thu từ ao tôm thì tỉ lệ nhiễm WSSV là 12,5 %. Cùng với kết quả nghiên cứu của Lo et al (1996) trên các loài giáp xác đánh bắt từ tự
nhiên cũng cho kết quả dương tính với WSSVcủa các mẫu cũng khác nhau. Cụ
thể là đối với tôm sú tự nhiên thì tỉ lệ nhiễm là 33,78 %, đối với tôm he Nhật là 9,45 %, tôm rằn 1,35 % và tôm thể đuôi đỏ là 2,02 %. Tỉ lệ nhiễm trung bình trên tôm tít là có thể chấp nhận so với các loài tôm được thu từ tự nhiên như
trên. Lo et al. 1996 cũng đã nghiên cứu và phát hiện việc nhiễm WSSV trên cua hại mà họ thu được chiếm 15,62 %. Tỉ lệ này là thấp hơn so với tỉ lệ nhiễm của
ốc mượn hồn được nghiên cứu nhưng cũng không thể kết luận được vì phương pháp được sử dụng trong các nghiên cứu là khác nhau. Nhưng điều có thể khẳng
định ởđây là sự tồn tại của mầm bệnh WSSV trong các mẫu được kiểm tra. Tóm lại, tùy thuộc vào phương pháp và số lượng mẫu thu mà tỉ lệ nhiễm của các mẫu có thể khác nhau. Các mẫu được kiểm tra đa số là ốc mượn hồn và đây cũng là nhóm chiếm tỉ lệ nhiễm cao nhất (hình 4.8).
Hình 4.8 Tỉ lệ nhiễm WSSV trong các mẫu thu từ Bạc Liêu
Phần trăm các mẫu nhiễm WSSV tại Bạc Liêu Mẫu mực 2,17% Mẫu tôm tích 6,52% Mẫu ốc 45,65% Mẫu âm tính 45,66%
4.2.3 Xác định tỉ lệ nhiễm WSSV ở các mẫu thức ăn tại Cà Mau
Ở khu vực Cà Mau, ốc mượn hồn là loại thức ăn duy nhất được sử dụng trong tổng số 18 trại được thu và tỉ lệ nhiễm WSSV là 59,26 % (48/81 mẫu) trong tổng số mẫu được phân tích khi được kiểm tra bằng PCR 2 bước. Tình hình nhiễm WSSV giữa các trại cũng khác nhau, 8 trại nhiễm toàn bộ 5 mẫu kiểm tra, 3 trại chỉ có 1/5 hoặc 2/5 mẫu nhiễm WSSV, 1 trại nhiễm 4/5 mẫu kiểm tra hay hoàn toàn cho kết quả âm tính trên các mẫu kiểm tra (4 trại). Theo S. K. Otta et al. (1999) cũng đã dùng kỉ thuật PCR phát hiện WSSV trên các loài giáp xác nuôi và tự nhiên ởẤn Độ. Nghiên cứu được tiến hành trên nhiều đối tượng khác nhau (tôm, cua, artemia…), cả trên đối tượng biểu hiện bệnh và không biểu hiện bệnh đốm trắng. Trên mẫu cua Scylla serrata không có dấu hiệu bệnh, tỉ lệ
nhiễm là 15 % (3/20 mẫu cua khỏe), tôm mẹ không có dấu hiệu của WSSV là 3/3 mẫu, tôm mẹ có dấu hiệu của WSSV là 7/7 mẫu, artemia khỏe là 1/1 mẫu. Một số mẫu cua khác được kiểm tra thì cho kết quả âm tính với WSSV. Theo Chu-Fang Lo et al. (1996), đối với các loài côn trùng thủy sinh, họ mười chân, cua tạp, tôm tạp hại có kích thước nhỏ thì kết quả nghiên cứu của nhóm tác giả
trên như sau: nhộng của côn trùng thủy sinh 19,04 %, họ mười chân 9,52 %, tôm tạp 28,57 % và cua tạp là 11,9 % mẫu dương tính với PCR bước 2.
Dù các mẫu được thu ngẫu nhiên từ hai tỉnh khác nhau (Bạc Liêu là 15 trại và Cà Mau là 18 trại) nhưng kết quả dương tính với WSSV lại chiếm tỉ lệ gần bằng
nhau (Bạc Liêu là 54,34 % và Cà Mau là 59,26 %).
Tóm lại, tỉ lệ nhiễm WSSV trong mẫu thức ăn tươi sống thu từ các trại sản xuất giống tôm sú ở Cà Mau (59 %) là cao hơn Bạc Liêu (54 %) nhưng thành phần thức ăn có nguồn gốc thủy sản thì ở Bạc Liêu là đa dạng hơn ở Cà Mau.
PHẦN V
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận
- WSSV đã được phát hiện trên thức ăn tươi sống (ốc mượn hồn, mực, tôm tít) sử dụng nuôi vỗ tôm sú bố mẹ tại các trại sản xuất tôm sú giống ở khu vực Bạc Liêu và Cà Mau.
- Tỉ lệ nhiễm WSSV trong các loại thức ăn tươi sống ở Bạc Liêu là 54 %. - Tỉ lệ nhiễm WSSV trong các loại thức ăn tươi sống ở Cà Mau là 59 % .
- Phát hiện những thể vùi WSSV trong tế bào của mô liên kết trên ốc mượn hồn khi bị WSSV xâm nhập.
5.2 Đề xuất
- Tiếp tục nghiên cứu và phát hiện WSSV trên các mẫu thức ăn tươi sống dùng trong các trại sản xuất giống.
- Nghiên cứu và tối ưu qui trình cắt mô trên nhiều đối tượng khác nhau để có thể
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Bùi Quang Tề, 2006. Bệnh học Thủy sản. Nhà xuất bản Nông Nghiệp
2. C M Escobedo-Bonilla, V Alday-Sanz, M Wille, P Sorgeloos, M B Pensaert
and H J Nauwynck, 2008. A review on the morphology, molecular characterization, morphogenesis and pathogenesis of white spot syndrome virus. Journal of Fish Diseases 31: 1-18.
3. CSIRO, 2008. Phương pháp PCR phát hiện ADN của giáp xác mười chân theo OIE, sử dụng mồi của CSIRO. Hội thảo về PCR phát hiện WSSV, Việt Nam, trang 18.
4. Chu- Fang Lo, Jiann-Horng Leu, Ching-Hui Ho, Chau-Huei Chen, Shao-En
Peng, You-Tzung Chen, Chih-Ming Chou, Pei Yan Yeh, Chang-Jen Huang, Hsin-Yiu Chou, Chung-Hsiung Wang, Guang-Hsiung Kou, 1996b. Detection of baculovirus associated with white spot syndrome (WSSV) in penaeid shrimps using polymerase chain reaction. Diseases of Aquatic Organisms 25: 133-141.
5. Chu-Fang Lo, Ching-Hui Ho, Shao-En Peng, Chau-Huei Chen, Hui-Chen
Hsu, Ya-Lin Chiu, Chen-Fang Chang, Kuan-Fu Liu, Mao-Sen Su, Chung- Hsiung Wang, Guang-Hsiung Kou, 1996a. White spot syndrome baculovirus (WSSV) detected in cultured and captured shrimp, crabs and other arthropods. Diseases of Aquatic Organisms 27: 215-225.
6. Chưng Thị Nghiễm, 2009. Ứng dụng phương pháp PCR – Genotyping trong nghiên cứu tác nhân gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên tôm sú. Luận văn tốt nghiệp đại học.
7. Đặng Thị Hoàng Oanh, 2007. Bài giảng Nguyên lý và kỹ thuật chẩn đoán bệnh. Khoa thủy sản trường Đại học Cần Thơ.
8. Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng và Nguyễn Thị Muội, 2004. Giáo trình Bệnh học thủy sản. Khoa Nuôi Trồng Thủy Sản, trường Đại học thủy sản Nha Trang.
9. Franklin Pérez, Filip A.M. Volckaert, Jorge Calderón, 2005. Pathogenicity of white spot syndrome virus on postlarvae and juveniles of Penaeus (Litopenaeus) vannamei. Aquaculture,205,586-591.
10. Http://www.vasep.com.vn/vasep/dailynews./87abdd0d40924a7547257142
0323ea3/ADD567A73BB5E6B947257508004CF07E?OpenDocument&Start =6.8
11. Http://www.khoahocthuysan.org/modules.php?name=News&op=viewst&
si=123. Ngày truy cập 01/01/2009.
12. Http://thuysan.kiengiang.gov.vn/index2.jsp?menuId=455&articleId=2243 Ngày truy cập 01/01/2009 13. Http://www.khuyennongvn.gov.vn/g-ttdh/ca-mau-xuat-hien-tinh-trang-tom- the-chan-trang-nhiem-benh-va-chet/view. Cập nhật ngày 01/01/2009 14. Http://www.nongthon.net/apm/modules.php?name=News&file=article&sid =3436. Ngày truy cập 02/01/2009
15. Http://nhanong.net/?nn=view&action=showid&id=1343. Ngày truy cập 02/ 01/2009.
16. Jeroen Witteveldt, Carolina C. Cifuentes, Just M. Vlak, and Marie¨lle C. W. van Hulten. Protection of Penaeus monodon against White Spot Syndrome Virus by Oral Vaccination, 2004. Journal of Virology, p. 2057–2061 Vol. 78, No. 4
17. Lê Xuân Sinh, 2003. A Bio-economic Model of a shrimp hatchery in the Mekong River Delta of Vietnam. Luận án tiến sĩ Kinh tế nông nghiệp- Đại học Sydney, Australia.
18. Lightner D.V, 1996.A handbook of shrimp patholgy and diagnostic
procedures for disease of cultured penaeid shrimp. The world aquaculture society.
19.Lo. C. F, Ho. C. H, Chen. C. H and Chui. Y. L, 1997. Detection and tissue tropism of white spot syndrome baculovirus (WSSV) in captured brooders of Penaeus monodon with a special emphasis on reproduction organs. In Dis Aquat Org 30: 53-72.
20. Lê Như Nguyệt, 2004. Ứng dụng và so sánh các phương pháp phát hiện virus đốm trắng (WSSV) trên tôm sú (Penaeus monodon) bằng kỹ thuật PCR. Luận văn tốt nghiệp đại học
21. Lý Ngọc Hà, 2008. Tìm hiểu sự biến đổi của vùng lặp lại thuộc ORF94 và ORF125 của WSSV (White spot syndrome virus) trên tôm nuôi tại Bạc Liêu. Luận văn tốt nghiệp đại học.
22. Md. Shahadat Hossain, Anirban Chakraborty, Biju Joseph, S.K. Otta,
Indrani Karunasagar and Iddya Karunasagar, 2001. Detection of new hosts for white spot syndrome virus of shrimp using nested polymerase chain reaction. Aquaculture 198: 1-11.
23. Nguyễn Văn Hảo,2003. Tình hình dịch bệnh ở tôm sú nuôi trên thế giới và tại Việt Nam- Viện NXNTTS II
24. Nguyễn Minh Hậu, 2002. Xác định tỉ lệ cảm nhiễm WSSV và MBV trên tôm sú (P. monodon) giống ở các tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long. Luận văn tốt nghiệp đại học.
25. Nguyễn Trường Quang, 2004. Khảo sát tình hình bệnh đốm trắng trên tôm sú (P. monodon) ở tỉnh Sóc Trăng. Luận văn tốt nghiệp đại học.
26. Phạm Trần Nguyên Thảo, 2003. Ứng dụng kỹ thuật mô bệnh học trong chẩn
đoán bệnh đốm trắng ở tôm sú (P. monodon). Luận văn tốt nghiệp đại học. 27. S.K. Otta, Indrani Karunasagar, Iddya Karunasagar, 2003. Detection of
monodon baculovirus and whitespot syndrome virus in apparently healthy Penaeus monodon postlarvae from India by polymerase chain reaction. Aquacuture 220: 59-67.
28. Syed Musthaq, R. Sudhakaran, V.P. Ishaq Ahmed, G. Blasubramanian,