e. Lựa chọn tốc độ dòng 30
2.2.2. Qui trình định lượng 31
- 32 - 2.2.2.1. Khảo sát tính thích hợp của hệ thống
Cân chính xác khoảng 30,0 mg tobramycin đối chiếu cho vào bình định mức 10,0ml. Hoà tan và pha loãng bằng nước vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 µm, dùng dịch lọc tiêm sắc ký.
Tiêm 5 lần mẫu đối chiếu vào hệ thống HPLC, tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn ở trên. Ghi kết quả: thời gian lưu, diện tích và hệ số bất đối của pic tobramycin.
Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký được trình bày như bảng 2.
Bảng 2: Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống
STT Pic của tobramycin
Thời gian lưu (phút) Diện tích pic (mAU) Hệ số bất đối (AF)
1 2,94 12,2985 1,52 2 2,95 12,3001 1,53 3 2,96 12,2805 1,51 4 2,96 12,2230 1,52 5 2,96 12,1916 1,52 RSD(%) 0,30 0,40 Nhận xét: Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống HPLC cho thấy:
Độ lệch chuẩn tương đối (RSD %) của thời gian lưu và diện tích pic trong các phép thử là 0,30 và 0,40 đều nhỏ hơn 2%.
Các giá trị của hệ số bất đối giao động từ 1,51 đến 1,53 Kết luận:
Hệ thống HPLC mà chúng tôi sử dụng là thích hợp để định lượng tobramycin trong nguyên liệu.
- 33 - a. Dung dịch thử
Cân chính xác khoảng 30,0 mg tobramycin nguyên liệu cho vào bình định mức 10,0 ml. Hoà tan và pha loãng bằng nước vừa đủđến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 µm
b. Dung dịch chuẩn (đối chiếu)
Cân chính xác khoảng 30,0 mg tobramycin đối chiếu, cho vào bình định mức 10,0 ml. Hoà tan và pha loãng bằng nước vừa đủđến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 µm.
c. Mẫu trắng:
Nước cất 2 lần, lọc qua màng lọc 0,45 µm, siêu âm đuổi khí 15 phút d. Pha động:
Dung dịch đệm phosphat 0,01 M, pH 3,0.
Cách pha: Hoà tan 0,68g KH2PO4 trong nước và pha loãng bằng nước vừa đủ 500 ml. Điều chỉnh về pH 3,0 bằng H3PO4 đặc. Lọc qua màng lọc 0,45µm, siêu âm đuổi khí 15 phút. 2.2.2.3. Điều kiện sắc ký - Cột Nucleosil C18 (250 x 4,6 mm; 5µm) - Pha động: Đệm phosphat 0,01 M pH 3,0. - Tốc độ dòng: 0,6 ml/phút - Thể tích tiêm: 30 µl - Detector UV 195 nm
- Nhiệt độ phân tích: Nhiệt độ phòng 2.2.2.4. Tính kết quả
Ghi diện tích pic thu được trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn và mẫu thử tương ứng. Tính hàm lượng % tobramycin có trong mẫu thử theo công thức sau:
- 34 - %X = P m A m A t c c t × × ×
Trong đó: At, Ac là diện tích pic tương ứng của mẫu thử và mẫu chuẩn mt, mc là lượng cân tương ứng của mẫu thử và mẫu chuẩn (mg) P là hàm lượng % ghi trên nhãn của tobramycin chuẩn
2.2.3. Định lượng tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp mới xây dựng dựng
Chuẩn bị và cho hệ thống HPLC chạy ổn định với pha động trong 30 phút. Tiêm lần lượt 30 µl mỗi dung dịch đã chuẩn bị vào hệ thống sắc ký. Tiến hành định lượng 5 mẫu thử và 1 mẫu chuẩn tobramycin theo các điều kiện đã chọn. Ghi các giá trị diện tích pic thu được trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn và mẫu thử tương ứng. Kết quảđịnh lượng được trình bày ở bảng 3.
Bảng 3 : Kết quảđịnh lượng tobramycin nguyên liệu
Khối lượng cân (mg) Diện tích pic(mAU.min) Hàm lượng % 29,6 11,9207 90,97 29,7 11,9585 90,95 29,9 11,9165 90,02 30,1 11,9975 90,03 30,3 12,0954 90,17 m( chuẩn) =29,0 12,1916 94,96 Số liệu thống kê: Giá trị trung bình X =90, 43 Độ lệch chuẩn : S = 0,46 Độ lệch chuẩn tương đối : RSD = 0,51% Sai số chuẩn : Sx= 0,21 (n 1) x 0,5962 X tα − S ∆ = × = Khoảng tin cậy = 90,43 ± 0,59 Kết luận:
- 35 -
Kết quả trình bày ở bảng trên cho thấy nguyên liệu tobramycin đem định lượng có hàm lượng là: 90,43% ± 0,59 %
2.2.4. Đánh giá phương pháp định lượng
Chúng tôi tiến hành đánh giá phương pháp định lượng tobramycin nguyên liệu bằng HPLC mới xây dựng dựa vào các chỉ tiêu sau
- Đánh giá tính tuyến tính - Đánh giá tính chính xác - Đánh giá tính đúng - Đánh giá tính đặc hiệu 2.2.4.1. Tính tuyến tính Tiến hành khảo sát sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ với diện tích pic của dẫn chất tobramycin (tính theo lượng tobramycin đưa vào) trên chất chuẩn tobramycin.
Cách pha: Cân chính xác khoảng 375 mg tobramycin chuẩn cho vào bình định mức 50,0 ml. Hoà tan và pha loãng bằng nước vừa đủ đến vạch. Dung dịch thu được có nồng độ 7,5 mg/ml. Tiến hành pha loãng theo bảng 4 để thu được các dung dịch có nồng độ lần lượt là 2,4; 2,7; 3,0; 3,3; 3,6 mg/ml. Lọc qua màng lọc 0,45µm.
Bảng 4 : Cách pha các dung dịch để khảo sát khoảng tuyến tính
Tiêm lần lượt 30 µl các dung dịch đã chuẩn bị vào hệ thống sắc ký. Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn. Ghi các gía trị diện tích pic đo được
Bình 1 2 3 4 5
Tobramycin (mg) 8,0 9,0 10,0 11,0 12,0
Nước cất vừa đủ (ml) 25 25 25 25 25
- 36 -
ứng với các nồng độ của các dung dịch trên. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính được trình bày ở bảng 5.
Bảng 5 : Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính
Từ các kết quả thu được ở bảng trên chúng tôi thiết lập mối tương quan giữa diện tích pic thu được trên sắc ký đồ và nồng độ của dung dịch (tính theo lượng tobramycin đưa vào).
Phương trình hồi quy biểu thị mối tương quan này là: y= 3,9878 x + 0,039 với hệ số tương quan r= 0,9999
Độ lệch chuẩn y_intercept: Sb= 0,064
Khoảng tin cậy 95% của y_intercept: 0,039 ± 0,204 hay -0,165 ≤ y_intercept ≤ 0,243 chứa gốc toạđộ.
Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ dung dịch và diện tích pic của tobramycin được ghi ở hình 2.
Nồng độ (mg/ml) 2,4 2,7 3,0 3,3 3,6 Diện tích pic (mAU.min) 9,6023 10.7959 12,0322 13,1989 14,3825 Tính tuyến tính y = 3.9878x + 0.039 R2 = 0.9999 0 4 8 12 16 0 1 2 3 4 Nồng độ (mg/ml) D i ệ n t íc h p ic ( m A U *m in )
- 37 -
Hình 2 : Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ dung dịch và diện tích pic của tobramycin
Từ kết quả thu được ở hình 2 cho thấy:
Tất cả các giá trị thu được nằm trên đường hồi quy hoặc phân bố đồng đều cả 2 phía của đường hồi quy.
Hệ số tương quan r= 0,9999.
Khoảng tin cậy của y_intercept chứa gốc toạđộ. Nhận xét:
Phương pháp tuyến tính trong khoảng nồng độ khảo sát từ 2,4 đến 3,6 mg/ml (tính theo lượng tobramycin đưa vào) hay tuyến tính trong khoảng nồng độ từ 80 % đến 120% nồng độ làm việc.
2.2.4.2. Tính chính xác
Nguyên tắc: Tính chính xác của phương pháp được đánh giá bằng độ lệch chuẩn tương đối của 5 phép thử song song.
Cách tiến hành và kết quảđược trình bày như phần 2.2.3
Kết quả thử độ chính xác của phương pháp cho thấy trong các điều kiện sắc ký đã chọn độ lệch chuẩn tương đối của các kết quả rất nhỏ (RSD = 0,51% << 2%). Như vậy phương pháp là chính xác.
2.2.4.3. Tính đúng
Nguyên tắc: Đánh giá tính đúng của phương pháp được tiến hành trên việc khảo sát khả năng tìm lại của phương pháp.
Chuẩn bị các dung dịch chuẩn có nồng độ từ 80% đến 120% nồng độ định lượng. Khối lượng cân như bảng 6.
Tiến hành định lượng các mẫu này theo điều kiện đã chọn, mỗi mẫu định lượng 3 lần, lấy kết quả trung bình. Tính hàm lượng % của tobramycin có trong mẫu thử dựa trên chuẩn đã biết hàm lượng, từ đó tính % tìm lại của mẫu thử.
- 38 -
Kết quảđánh giá tính đúng của phương pháp được trình bày ở bảng 6 Mẫu đối chiếu: m = 29,0 mg; Sc = 12,1916 (mAU.min)
Bảng 6: Kết quảđánh giá tính đúng của phương pháp
Đồ thị biểu diễn phương trình hồi qui tuyến tính về mối tương quan giữa lượng cân và lượng hoạt chất tìm lại được ghi ở hình 3.
Hình 3: Đồ thị biểu diễn phương trình hồi qui tuyến tính về mối tương quan giữa lượng cân và lượng hoạt chất tìm lại
- Qua phân tích ta có: Phần trăm tìm lại = 99,71% (khoX ảng tin cậy 98,43 – 100,99) mcân(mg) mthực(mg) Diện tích pic trung bình (mAU.min) Khối lượng tìm lại trung bình (mg) % tìm lại = 23,2 22,0 9,7089 21,9 99,55 30,2 28,7 12,6349 28,5 99,30 35,8 34,6 15,1176 34,1 100,29 % 100 mmchovao timlai × Tính đúng y = 0.9686x + 0.6252 R2 = 0.9999 0 10 20 30 40 50 0 20 40 60
Khối lượng TB cho vào (mg)
K h ố i l ư ợ n g T B t ìm l ạ i (m g )
- 39 -
Độ lệch chuẩn tương đối: RSD = 0,52% (<< 2%)
- Phương trình hồi quy tuyến tính về mối tương quan giữa lượng cân và lượng hoạt chất tìm lại:
Phương trình: y = 0,9686x + 0,6252 Độ lệch chuẩn của a: Sa = 0,01
Độ lệch chuẩn của y_intercept: Sb = 0,298 - Với độ tin cậy 95% ta có:
Khoảng tin cậy của độ dốc: a ± 0,127 hay : 0,840 < a < 1,095 (a chứa 1=> không có sai số hệ thống tỷ lệ)
Khoảng tin cậy của y_intercept: b± 3,786
hay : -3,16 ≤ y_intercept ≤ 4,393 (y chứa gốc tọa độ => không có sai số hằng định).
Kết luận:
Qua các kết quả trên ta thấy phương pháp đúng trong khoảng khảo sát
2.2.4.4. Tính đặc hiệu
Để khảo sát tính đặc hiệu của phương pháp chúng tôi tiến hành như sau:
Chuẩn bị mẫu trắng (nước cất hai lần) và mẫu thử.
Tiến hành sắc ký mẫu trắng và mẫu thử theo quy trình đã chọn Sắc ký đồ mẫu trắng và mẫu thửđược trình bày nhưở hình 4 và 5
- 40 - Hình 4:Sắc kí đồ mẫu trắng
Hình 5: Sắc kí đồ mẫu thử Nhận xét:
Sắc ký đồ của mẫu đối chiếu cho một pic chính với tR=2,96 phút, cân đối.
Trên sắc ký đồ mẫu trắng, trong khoảng thời gian lưu của pic tạo bởi tobramycin không có pic nào xuất hiện.
Vậy phương pháp định lượng tobramycin trong nguyên liệu được xây dựng có tính đặc hiệu
- 41 -
Phương pháp HPLC là một phương pháp phân tích hiện đại, đang từng bước được đưa vào phòng kiểm nghiệm vào trung tâm kiểm nghiệm ở Việt Nam. Ưu điểm chung của phương pháp này là có sựổn định, độ chọn lọc, tính chính xác cao và cách tiến hành đơn giản, nhanh chóng có thểđịnh tính, định lượng đồng thời nhiều hoạt chất mà không cần phân tách trước khi đo.
Đối với tobramycin, ở Việt Nam, thường dùng phương pháp vi sinh để định lượng. Trong dược điển Mỹ, Anh dùng phương pháp HPLC, song phải tạo dẫn chất với thuốc thử nhập ngoại đắt tiền. Vì vậy chúng tôi đã nghiên cứu và xây dựng một phương pháp HPLC mới để định lượng tobramycin với hóa chất dễ kiếm, rẻ tiền, có thể áp dụng dễ dàng trong các phòng kiểm nghiệm trong nước. Quy trình định lượng như sau:
Điều kiện sắc ký
- Cột Nucleosil C18 (250x4,6 mm; 5µm) sẵn có ở bộ môn Hoá dược, trường Đại học Dược Hà Nội.
- Pha động: Đệm phosphat 0,01M pH 3,0.
- Tốc độ dòng: 0,6 ml/phút - Thể tích tiêm: 30 µl - Detector UV 195 nm
- Nhiệt độ phân tích: Nhiệt độ phòng Dung dịch thử
Cân chính xác khoảng 30,0 mg tobramycin nguyên liệu cho vào bình định mức 10,0ml. Hoà tan và pha loãng bằng nước vừa đủđến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 µm
- 42 -
Cân chính xác khoảng 30,0 mg tobramycin đối chiếu cho vào bình định mức 10,0ml. Hoà tan và pha loãng bằng nước vừa đủđến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 µm.
Mẫu trắng:
Nước cất 2 lần, lọc qua màng lọc 0,45 µm, siêu âm đuổi khí 15 phút Tính kết quả: Hàm lượng % tobramycin trong nguyên liệu được tính
theo công thức: %X = P m A m A t c c t × × × At , Ac: Diện tích pic của mẫu thử và mẫu chuẩn
mt , mc: Khối lượng cân của mẫu thử và mẫu chuẩn (mg). P : Là hàm lượng % ghi trên nhãn của tobramycin chuẩn.
Từ kết quả thực nghiệm và xử lý số liệu thống kê cho thấy, phương pháp mới xây dựng là chính xác (RSD = 0,51%), đúng, tuyến tính trong khoảng nồng độ khảo sát và đặc hiệu. Vì vậy, có thể áp dụng phương pháp này để định lượng tobramycin nguyên liệu. Do thời gian có hạn, chúng tôi chưa tiếp tục nghiên cứu áp dụng phương pháp này đểđịnh lượng tobramycin trong các chế phẩm.
- 43 -
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 3.1 KẾT LUẬN
Trong quá trình làm khóa luận tốt nghiệp chúng tôi đã thu được một số kết quả:
1. Xây dựng được một phương pháp định lượng tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) đơn giản, dễ thực hiện và kinh phí thấp. Kết quả nghiên cứu cho thấy phương pháp đáp ứng đầy đủ các chỉ tiêu của một phương pháp định lượng (tính đặc hiệu, tính chính xác, tính đúng và tính tuyến tính trong khoảng nồng độ khảo sát).
2. Xác định được hàm lượng của tobramycin trong nguyên liệu.
3. Học được cách tìm tài liệu, làm thực nghiệm và trình bày văn bản một cách khoa học về một vấn đề nghiên cứu. Tìm hiểu phương pháp HPLC, làm quen và sử dụng được máy HPLC đểđịnh lượng một sản phẩm; biết cách đánh giá một phương pháp định lượng.
3.2 ĐỀ XUẤT
1. Có thể áp dụng phương pháp này tại các cơ sở kiểm tra chất lượng trong cả nước để xác định về mặt hàm lượng tobramycin trong nguyên liệu.
2. Tiếp tục nghiên cứu, khảo sát để áp dụng định lượng tobramycin trong các thành phẩm như thuốc nhỏ mắt, thuốc tiêm ...