3. Đối tượng nghiên cứu
1.3.2.Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các hợp chất phenolic từ Alpinia
từ Alpinia kadsumadai
Ba chất liên hợp monoterpen-chalcon, rubrain (50), isorubrain (51) và sumadain C (52) đã được phân lập từ hạt Alpinia kadsumadai. Cấu trúc và cấu hình tương đối của các hợp chất đã được chứng minh bằng phổ NMR và X-ray. Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất này đã được đánh giá trên các dòng tế bào HepG2, MCF-7 và MAD-MB-435, và 5-hydroxy-7-(4''-hydroxy-3- methoxyphenyl)-1-phenyl-3-heptanon đã được chứng minh là có hoạt tính gây độc tế bào [18].
O O O OH (50) O O O OH (51)
Tám hợp chất đã được phân lập từ phần chiết etanol của Alpinia
kadsumadai Hayata, 1,7-dipheny-5-hydroxy-4,6-heptadien-3-on (52), 1,7-
diphenyl-1,4,6-heptadien -3-on (53), pinocembrin, cardamomin (54), alpinetin (55), 7,4-dihydroxy-5-methoxy flavanon (56) và β-sitosterol (57). Trong đó 2 hợp chất đầu và (58) đã được phân lập lần đầu tiên từ loài thực vật này [22].
O O
H
OH O
(58)
Tổng kết lại, các hợp chất phenolic mới vẫn tiếp tục được phân lập từ các loài
Alpinia officinarum, Alpinia galanga, Alpinia kadsumadai và Alpinia oxyphylla.
Các hợp chất này cho một tỷ lệ cao các hoạt chất chống viêm, kháng virut và chống ung thư.
Chương 2
PHƯƠNG PHÁP VÀ THỰC NGHIỆM 2.1. Phương pháp nghiên cứu
2.1.1. Phương pháp lấy mẫu
Mẫu thực vật được thu hái vào thời điểm thích hợp trong năm. Mẫu tươi sau khi lấy về được rửa sạch, để nơi thoáng mát hoặc sấy khô ở 400C. Mẫu được xử lý tiếp bằng phương pháp chiết chọn lọc với các dung môi thích hợp để thu được hỗn hợp các hợp chất dùng cho nghiên cứu được nêu ở phần thực nghiệm.
2.1.2. Phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập cáchợp chất hợp chất
Để phân tích và phân tách cũng như phân lập các hợp chất, sử dụng các phương pháp sắc ký như:
- Sắc ký cột thường, sử dụng silicagel cỡ hạt 230-400/mesh.
- Sắc ký lớp mỏng (TLC) phân tích được tiến hành trên bản mỏng kính silicagel Merck 60 F254 tráng sẵn, độ dày 0,2 mm.
Hiện màu: hơi iot và đèn UV 254 nm. - Các phương pháp kết tinh phân đoạn.
2.1.3. Phương pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất
Cấu trúc của các hợp chất được khảo sát nhờ sự kết hợp các phương pháp phổ:
- Phổ khối lượng phun mù electron (ESI - MS). - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR. - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR. - Phổ DEPT. - Phổ HSQC. - Phổ HMBC. 2.2. Hoá chất, dụng cụ và thiết bị
2.2.1. Hoá chất
Các dung môi dùng để ngâm chiết mẫu thực vật đều dùng loại tinh khiết (pure), khi dùng cho các loại sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột sử dụng loại tinh khiết phân tích (PA). Dung môi được sử dụng là: hexan, metanol, butanol, etylaxetat, axeton, nước cất.
2.2.2. Dụng cụ và thiết bị
Nhiệt độ nóng chảy đo trên máy Yanaco MP-S3.
Phổ khối lượng ESI-MSđo trên máy LC-MS-Trap-00127.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR được đo trên máy Bruker 500MHz, phổ 13C-NMR, DEPT, HMBC, HSQC và COSY được đo trên áy Bruker 125 MHz. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.3. Nghiên cứu các hợp chất 2.3.1. Phân lập các hợp chất 2.3.1. Phân lập các hợp chất
Mẫu qủa câythảo đậu (Aplinia kadsumadai Hayt) thu hái ở Quỳ Hợp, Nghệ An vào tháng 4/2011, được TS Trần Huy Thái (Viện Sinh Thái và Tài nguyên Sinh vật-Viện Khoa Học và Công nghệ Việt Nam) xác định, tiêu bản được lưu giữ tại khoa Sinh, Trường Đại học Vinh.
Quả cây thảo đậu (10,8 kg), được phơi khô, xay nhỏ và ngâm chiết với metanol ở nhiệt độ phòng (7 ngày). Dịch chiết được cất loại dung môi, cho 986g cao metanol. Phân bố cao metanol trong nước, sau đó lắc lần lượt với hexan, etyl axetat và butanol. Cất loại dung môi, cho 138, 269, 192 g các cặn dịch chiết tương ứng.
Cao etyl axetat được phân tách trên cột silica gel, dung môi rửa giải là hexan : axeton (100:0, 25:1: 15:1; 9:1; 4:1, 2:1), cho 12 phân đoạn chính. Phân đoạn 6 được phân tách bằng sắc ký cột với hệ dung môi rửa giải hexan : axeton (19:1) thu được chất A (62 mg).
Hình 2.1: Sơ đồ phân lập hợp chất trong quả cây thảo đậu 2.3.2. Một số dữ kiện về phổ tử ngoại, phổ khối và phổ cộng hưởng từ hạt nhân của chất đã phân lập Hợp chất A:Tinh thể màu vàng, đ.n.c. 112-113 0C. ESI-MS m/z: 315 [M+H]+ và và 313 [M-H]+ IR νmaxKBr cm-1: 3194, 1625, 1508, 1444, 1257, 1089, 1016. 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ (ppm): δ 14,38 (1H, s, HO-2’), 7,79 (2H, s, H-α và H-β), 7,57 (2H, d, J=8,5 Hz, H-2 và H-6), 6,92 (2H, d, J=8,5 Hz, H-3 và H-5), 6,11 (1H, d, J=2,0 Hz, H-3’), 5,96 (1H, d, J=2,5 Hz, H-5’), 3,91 (3H, s, 6’-OCH3), 3,85 (3H, s,-OCH3), 3,83 (3H, s, 4’-OCH3). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ (ppm): xem bảng 3.1. - Ngâm với metanol - Cất thu hồi metanol - Phân bố trong nước - Chiết lần lượt với hexan, etyl axetat, butanol - Sắc kí cột cloroform : metanol
(42g)
Quả cây thao đậu
(10,8 kg) Cao metanol (986g) Cao hexan (138g) Cao butanol (192g) Cao etylaxetat (269g) Phân đoạn 6 Chất A (62 mg) Phân đoạn 10 - SKC hexan: axeton
Chương 3
KẾT QỦA VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập
Từ dịch chiết etyl axetat của lá cây cây dủ dẻ, bằng các phương pháp sắc ký cột trên silica gel đã phân lập được 01hợp chất flavonoit A. Cấu trúc của chúng được xác định bằng các phương pháp phổ như sau:
3.2. Xác định cấu trúc hợp chất A
Hợp chất A là tinh thể màu vàng, nhiệt độ nóng chảy 112oC-113oC. Phổ khối lượng (ESI-MS) của hợp chất A cho pic ion phân tử proton hóa m/z 315 [M+H]+, ứng với công thức C18H18O5.
Phổ 1H-NMR 7,79 (2H, s, H-α và H-β), 7,57 (2H, d, J=8,5 Hz, H-2 và H- 6), 6,92 (2H, d, J=8,5 Hz, H-3 và H-5), 6,11 (1H, d, J=2,0 Hz, H-3’), 5,96 (1H,
d, J=2,5 Hz, H-5’), các tín hiệu ở δH 3,91, 3,85 và 3,83 ppm là của 3 nhóm OCH3. Phổ 1H-NMR cho thấy 2 tín hiệu tương tác doublet ở δ 6,11 (1H, d, J = 2,0 Hz) và 5,96 (1H, d, J = 2,5 Hz) được thừa nhận là H-3’ và H-5’. Trên phổ 1H-NMR cho thấy tín hiệu kiểu A2B2 ở δ 7,57 (2H, d, J = 8,5 Hz) và 6,92 (2H, d,
J = 8,5 Hz) được gán cho H-2, -6 và H-3, -5. Phổ 1H-NMR còn cho thấy một tín hiệu singlet sắc nét của một proton thuộc nhóm hydroxy hình thành liên kết cầu hydro nội phân tử với nhóm cacbonyl ở δH 14,38 ppm.
Phổ 13C-NMR cho thấy tín hiệu 18 cacbon, trong đó có các tính hiệu CH của vòng C bị chập với cường độ cao gấp đôi các tín hiệu CH khác, tín hiệu của 3 nhóm metoxy (δ 55,4, 55,6 và 56,8 ppm), hai nhóm CH (δ 125,2 và 145,2) tại hai vi trí α và β và nhóm cacbonyl tại β’ (δ 192,6) rất điển hình của một chalcon.
Vị trí còn lại của 3 nhóm metoxy tại các vị trí 4, 4’ và 6’ được xác định chính xác nhờ phân tích 2D (HSQC và HMBC).
C DEPT δC δC* 1 C 128,4 128,5 2 CH 130,1 130,1 3 CH 114,4 114,4 4 C 161,4 161,5 5 CH 114,4 114,4 6 CH 130,1 130,1 1’ C 106,4 106,5 2’ C 162,5 162,6 3’ CH 93,9 93,9 4’ C 168,4 168,5 5’ CH 91,2 91,3 6’ C 166,0 166,1 α CH 125,2 125,3 β CH 142,5 142,4 C=O 192,6 192,6 4-OCH3 CH3 55,4 55,2 4’-OCH3 CH3 55,6 55,6 6’-OCH3 CH3 55,8 55,8
δC (Đo ở 125 MHz trong CDCl3), δC* (Đo ở 125 MHz trong CDCl3)
Từ dữ liệu phổ UV, IR, ESI-MS, 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HMBC, HSQC, COSY và so sánh với tài liệu tham khảo [10, 17], cho phép xác định cấu trúc của chất A là 2'-hydroxy-4,4',6'-trimetoxy chalcon hay flavokawain A. Hợp chất này đã được tìm thấy trong các loài Piper methysticum (kava), Dahlia
tenuicaulis và nhựa của Xanthorrhoea preissi. Hợp chất này có khả năng ứng chế
tế bào ung thư bàng quang [11].
5 6 1 2 3 4 1' 2' 3' 4' 5' 6' OCH3 OCH O OH H CO3 3 (A) Flavokawain A
Hình 3.1: Phổ khối lượng ESI-MS (negative) của hợp chất A
Hình 3.3: Phổ 1H-NMR của hợp chất A
Hình 3.5: Phổ 13C-NMR của hợp chất A
Hình 3.7: Phổ DEPT của hợp chất A
KẾT LUẬN (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nghiên cứu thành phần hoá học quả cây thảo đậu ở Việt Nam chúng tôi đã thu được một số kết quả như sau:
- Bằng các phương pháp ngâm chiết với các dung môi chọn lọc rồi cất thu hồi dung môi đã thu được các cao tương ứng là cao hexan (138), cao etylaxetat (269g), cao butanol (192g), pha nước.
- Phân lập hợp chất từ cao etyl axetat bằng các phư ơng pháp sắc ký silicagel và kết tinh phân đoạn thu được chất A.
- Đã tiến hành sử dụng các phương pháp phổ hiện đại: phổ khối lượng (ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HMBC và HSQC để xác định cấu trúc hợp chất tách được. Các kết quả phổ đã cho phép khẳng định chất A là 2'-hydroxy-4,4',6'-trimetoxy chalcon (flavokawain A). Các hợp chất này lần đầu tiên được phân lập từ cây thảo đậu.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam, 986-990, Nhà xuất bản Y học, TP Hồ Chí Minh.
2. Võ Văn Chuyên (1976), Tóm tắt đặc điểm các họ cây thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
3. Phạm Hoàng Hộ (1997), Cây cỏ Việt Nam, Nhà xuất bản Trẻ, Thành phố Hồ Chí Minh.
4. Đỗ Tất Lợi (2001), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, 379-381, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
5. Lê Huyền Trâm (2007), “Nghiên cứu các terpenoit, ancaloit và
flavonoit từ một số loài cây có giá trị của Việt Nam”, Luận án Tiến sĩ
Hóa học, Đại học Quốc gia Hà Nội.
Tiếng Anh
6. An N., Zou Z. M., Tian Z., Luo X. Z., Yang S. L., Xu L. Z., (2008), “Diarylheptan oids from the rhizomes of Alpinia officinarum and their anticancer activity”, Fitoterapia, 79 (1), 27-31.
7. An N., Xu L. Z., Zou Z. M., Yang S. L. (2006), “Diarylheptanoids from
Alpinia officinarum”, J. Asian Nat. Prod. Res., 8 (7), 637-641.
8. Bu X., Xiao G., Gu L. (2000) “Study of Alpinia officinarum”, Zhong Yao Cai, 23 (2), 84-87.
9.
Brand-Williams W., Cuveliver M. E., Berset C. (1995), “Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity”, Lebensmittel
Wissenschaft und Technologie, 28, 25-30.
10. Dharmaratne H.R., Nanayakkara N.P, Khan I.A. (2002), Kavalactones from Piper methysticum, and their 13C NMR spectroscopic analyses,
Phytochemistry, 59(4) 429-433.
11. Dictionary of Natural product on CD-Rom, Chapman and Hall-CRC
(2005).
12. Fan G. J., Kang Y. H., Han Y. N., Han B. H. (2007), “Platelet- activating factor (PAF) receptor binding antagonists from Alpinia officinarum”, Bioorg. Med. Chem. Lett., 17 (24), 6720-6722.
13. Kubota K., Someya Y., Yoshida R., Kobayashi A., Morita T., Koshino H. (1999), “Enantiomeric purity and odor characteristics of 2- and 3-
acetoxy-1,8-cineoles in the rhizomes of Alpinia galanga Willd.”, J.
Agric. Food Chem. 47 (2), 685-689.
14. Matsuda H., Ando S., Kato T., Morikawa T., Yoshikawa M. (2006), “Inhibitors from the rhizomes of Alpinia officinarum on production of nitric oxide in ipopolysaccharide-activated macrophages and the structural requirements of diarylheptanoids for the activity”, Bioorg.
Med. Chem., 14 (1), 138-142. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
15. Matsuda H., Nakashima S., Oda Y., Nakamura S., Yoshikawa M. (2009), “Melanogenesis inhibitors from the rhizomes of Alpinia officinarum in B16 melanoma cells”, Bioorg. Med. Chem., 17 (16), 6048-6053.
16. Phitak T., Choocheep K., Pothacharoen P., Pompimon W.,
Premanode B. (2009),”The effects of p-hydroxycinnamaldehyde from
Alpinia galanga extracts on human chondrocytes”, Phytochemistry, 70
(2), 237-243.
17. Seidel V., Bailleul F., Waterman P. G. (2000), (Rel)-1β,2α-di-(2,4- dihydroxy-6-methoxybenzoyl)-3β, 4α-di-(4-methoxyphenyl)- cyclobutane and other flavonoids from the aerial parts of
Goniothalamus gardneri and Goniothalamus thwaitesii, Phytochemistry,
55 (5) 439-446.
18. Shen Q., Li W. (2000), ”The study on rhizome Alpinia officinarum and other herbs as penetration enhancer for the permeation of 5- fluorouacil”, Xu Zhong Yao Cai, 23 (11), 697-699.
19. Sun Y., Tabata K., Matsubara H., Kitanaka S., Suzuki T., Yasukawa K. (2008), “New cytotoxic diarylheptanoids from the rhizomes of Alpinia officinarum”, Planta Med., 74 (4), 427-431.
20. Xu J., Tan N., Zeng G., Han H., Huang H., Ji C., Zhu M., Zhang (2009), “Studies on chemical constituents in fruit of Alpinia oxyphylla”,
Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, 34 (8), 990-993.
21. Yu Y. S., Hsu C. L., Yen G. C. (2009), ”Anti-inflammatory effects of the roots of Alpinia pricei Hayata and its phenolic compounds”, J.
Agric. Food Chem, 17, 6048-6053.
22. Wang X. Q., Yang X. J., Li J. S., (2008), “Studies on chemical constituents of Alpinia katsumadai”, Zhong Yao Cai, 31 (6), 853-855.