Sắc ký khí là một quá trình dựa trên cơ sở của sự chuyển dịch một lớp gián đoạn chất dọc lớp chất hấp hấp phụ trong một dòng pha dộng và liên hệ với sự lặp lại nhiều lần các giai đoạn hấp phụ và giải hấp phụ.
Quá trình sắc ký xảy ra khi có sự phân bố hấp phụ chất giữa hai pha, trong đó một pha chuyển dịch so với pha kia. Nói cách khác cơ sở của sắc ký khí là quá trình hấp phụ hoặc hấp thụ với quá trình giải hấp.
Nguyên tắc của sắc ký khí dựa trên sự phân chia các thành phần chất cần phân tích vào hai pha không trộn lẫn vào nhau. Pha cố định ( pha tĩnh) là chất lỏng hoặc chất rắn đựoc tẩm lên trên bề mặt của chất mang ( cột nhồi ) hoặc tráng thành lớp mỏng trong lòng cột tách ( cột mao quản ). Pha động là chất khí ( H2, He, Ar, N2, )…
Khi đa vào cột một hỗn hợp cần phân tích, muốn đạt đợc mức độ tách hoàn toàn trớc hết bề mặt tiếp xúc giữa hai pha phải đủ lớn ( do quá trình khuyếch tán chất, sẽ làm giảm hiệu quả tách) và sau cùng là sự chuyển dịch hớng của một pha ( pha động) so với pha kia ( pha tĩnh) nh thế nào đó để mỗi cấu tử trong hỗn hợp đợc phân bố giữa hai pha phù hợp với tính chất hấp phụ hoặc hấp thụ của nó.
Do pha động chuyển dịch liên tục nên ngoài nhiệm vụ đa các chất lên mặt pha tĩnh. Nó còn tiếp nhận các phần tử chất phân tích đã đợc hấp phụ trớc đó bị giải hấp phụ tới tơng tác với phần khác của bề mặt pha tĩnh. Nói cách khác đó là quá trình chuyể chất từ đĩa lí thuyết này đến đĩa lí thuyết khác mà tồn tại một cân bằng. Quá trình chuyển chất trên các đĩa lí thuyết diễn ra liên tục giữa pha tĩnh và pha động; chuyển dịch từ đầu cột đến cuối cột kéo theo sự phân vùng riêng biệt ( có màu hoặc không màu ) các chất trong cột sắc ký. Nếu bằng một cách nào đó, ta gi đợc sự phân bố nồng độ các chất dọc theo cột ta thu đợc một đờng cong gọi là sắc phổ ( hay gọi là sắc ký đồ )
Từ sắc đồ để phân tích thành phần của hỗn hợp có thể dùng các phơng pháp sau:
- Dựa vào giá trị thời gian lu Rt ( thời gian lu của một chất là thời gian của chất đó đợc lu trong cột tách tính từ khi bơm mẫu vào máy đến khi phát hiện ở Đetectơ, tính bằng phút ). So sánh thời gian lu của chất chuẩn ta sẽ nhận ra chất cần phân tích. Tuy vậy phơng pháp này có thể gây nhầm lẫn vì có nhiều thành phần khác nhau nhng thời gian lu lại nh nhau vì thế cần phải tiến hành so sánh trên nhiều cột tách có tính chất khác nhau ( phân cực hoặc không phân cực).
- Phơng pháp phân tích cộng: Trộn chất cần so sánh vào tinh dầu và tiến hành sắc ký, so sánh hai bản sắc ký đồ tu đợc, đỉnh của chất dự kiến sẽ tăng lên nhiều so với bản sắc ký nguyên mẫu.
- Phơng pháp phân tích trừ: Loại chất cần phân tích bằng phơng pháp hoá học, so sánh với hai bản sắc ký đồ tinh dầu nguyên mẫu và tinh dầu đã loại chất cần định tính. ở sắc đồ thứ hai đỉnh đó sẽ mất đi hoặc còn lại rất nhỏ. Phơng pháp này có thể áp dụng để định tính các thành phần: Phenol, Andehit, Xeton.
- Phơng pháp chuyển dịch đỉnh: Tạo các chất mới bằng các phản ứng hoá học xẩy ra với chất dự kiến định tính. So sánh hai sắc ký đồ ở bản thứ hai, đỉnh
của chất dự kiến bị mất đi, xuất hiện thêm một đỉnh mới. phơng pháp này thờng dùng để xác định các hợp chất Ancol.
- Kết hợp giữa sắc ký khí với các phơng pháp phân tích phổ: đây là phơng pháp dùng rất phổ biến, có ứng dụng rất lớn. Ví dụ: sắc ký khí kết hợp với sắc khối phổ ký ( GC/MS ), sắc ký khí kết hợp với phổ hồng ngoại.
Hình 3: Sơ đồ thiết bị sắc ký khí.
Hai bộ phận quan trọng nhất của thiết bị sắc ký khí là hệ thống cột tách (5) và detectơ (6). Nhờ có khí mang đợc chứa trong bình bom (1), mẫu từ buồng bay hơi đợc dẫn vào cột tách nằm trong buông điều nhiệt, quá trình sắc ký xảy ra ở đây. Sau khi rời bỏ cột tách tại các thời điểm khác nhau. Các cấu tử lần lợt vào detectơ tại đó chúng đợc chuyển thành tín hiệu, tín hiệu này đợc khuyếc đại ở (7) rồi, hoặc chuyển sang bộ phận ghi (8) ở loại máy đơn giản hoặc chuyển sang tích phân kế có gắn máy tính (9) các tín hiệu đợc xử lý rồi chuyển sang bộ phận kết quả ( loại máy hiện đại).
I. 5. 1. 2. u điểm của phơng pháp.
Phơng pháp sắc ký khí dùng để tách các hợp chất có thể bay hơi ở nhiệt độ cao mà không bị phân huỷ kết quả phân tích. Sắc ký khí có thể cung cấp nhiều kết luận bổ ích về cấu trúc của các hợp chất.
Phơng pháp sắc ký khí cho phép phân tích định tính và định lợng nhanh chóng các thành phần cũng nh thực hiện việc tách điều chế các hỗn hợp chất.
Khả năng tách của phơng pháp sắc ký khí tốt, nhanh. Nó có thể tách nhiều hỗn hợp mà các kỹ thuật khác ( sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng, cất phân đoạn ) không giải quyết đợc.
Kỹ thuật tơng đối đơn giản, dễ vận hành, cho kết quả nhanh. Độ nhạy của sắc ký khí cao. Các máy thông thờng có thể xác định đợc đến 0, 01% chất thử. Với loại máy tinh vi hơn có thể phân tích với lợng một phân tử gam.
I. 5. 2. Phơng pháp khối phổ:
I. 5. 2. 1. Bản chất của phơng pháp:
Khối phổ là phơng pháp phân tích mà trong đó một hợp chất xét nghiệm đ- ợc ion hoá và phá thành các mảnh nhỏ trong thể tích khí dới dạng chân không cao 10-6mmHg. Sau quá trình ion hoá các điện tích đó đợc gia tốc trong điện tr- ờng. Đợc tách trong một từ trờng theo cờng độ của các hạt đó.
Quá trình ion hoá đợc thực hiện bằng cách cho một dòng electron có tốc độ cao va đập vào một mẫu hợp chất hữu cơ trong thể hơi và ion hóa hoá học. Trong quá trình này thông thờng một ( hoặc hai ) electron của lớp ngoài bị bật ra khỏi phân tử và ion phân tử đợc tạo thành.
M+ + 2e M + e
M2+ + 2e
Để tách một electron nh vừa nói thì động năng của electron va đập it nhất phải tơng ứng thế ion hóa của phân tử, tức là khoảng 8 – 15 ev.
Nếu trong quá trình đó một phân tử tiếp tục va chạm với dòng electron có năng lợng lớn ( lớn hơn năng lợng cần thiết để ion hoá) thì khi đó phân tử đợc
chuyển giao nhiều năng lợng đến mức cá ion phân tử đợc hình thành bị phá ra thành các mảnh nhỏ gọi là quá trình phân mảnh. Trong quá trình này một ion phân tử có thể phân huỷ thành một gốc tự do ( F0) và một ion dơng khác:
M+ → F0 + F+
Rồi các mảnh đó tiếp tục bị phá để cho một loạt các tiểu phân khác. Trong quá trình ion hoá nói trên, các ion phân tử, các ion mảnh hoặc các ion tiểu phân không có điện tích ( ví dụ: gốc ) đợc u tiên tạo thành trớc.
Dới những điều kiện đã cho xác suất để tạo thành nhũng ion có điện tích âm thấp hơn 104 lần. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phơng pháp phổ khối lợng dựa trên nguyên tắc chung là tách và đo khối l- ợng của tất cả các ion và ghi chúng trên một bản phổ. Sau đó dựa vào quy luật chung để phân tích thành phần các chất theo bản phổ ghi đợc.
Về kỹ thuật, quá trình phân tích khối phổ phải đợc thực hiện qua các bớc sau:
- Hoá khí mẫu phân tích. - Ion hoá mẫu.
- Tách các ion theo khối lợng. - Ghi nhận các ion.
- Xử lý số liệu.
Nói chung phổ khối lợng đợc ghi lại dới dạng phổ vạch hoặc dới dạng các bảng, trong đó cờng độ của các đỉnh đợc đo bằng phần trăm so với cờng độ đỉnh cao nhất ( gọi là đỉnh cơ sở ). Thờng là đỉnh cao nhất trong nhóm các đỉnh có số khối lợng cao nhất của phổ ( vì m/e ≈ m), vì vậy đỉnh này tơng đơng với khối l- ợng phân tử chính xác của hợp chất khảo sát. Do đó, để đánh giá khối phổ của một hợp chất cha biết, ta phải bắt đầu giải thích đỉnh có số khối lợng cao nhất. Các đỉnh của những mảnh bền hoá hơn là các đỉnh có khối lợng thấp. Đối với một chất sẽ cho ta nhận đợc một phổ các mảnh điển hình ( mảnh chìa khoá ) và căn cứ vào mô hình phân huỷ để ráp lại các mảnh đó, sẽ cho phép ta suy ra cấu chất của hợp chất khảo sát.
Hình 4: Giản đồ một khối phổ kế.
Phơng pháp phổ khối lợng có u điểm nổi bật là độ nhạy cao hơn các kỹ thuật phân tích khác, đặc biệt rất hữu ích trong việc nhận dạng hợp chất cha biết và khẳng định sự có mặt của hợp chất đã biết. Đồng thời nó là phơng pháp duy nhất đa ra trọng lợng phân tử chính xác.
Việc kết hợp phơng pháp sắc ký khí với phơng pháp khối phổ đã tạo ra ph- ơng pháp phân tích mới ( phơng pháp GC/MS ) có ý nghĩa rất lớn ngày càng đợc ứng dụng trong nhiều lĩnh vực.
I. 6. Phơng pháp thực nghiệm:
I. 6. 1. Phơng pháp thu hái và bảo quản cây mẫu:
Trong cây tinh dầu ở trạng thái tự do, thờng tập trung cao ở những cơ quan bài tiết nh lông tiết của cây họ hoa môi, dới lớp cutin trong túi tiết của cây họ hoa cúc, ……
Trong cùng một loại cây, thành phần tinh dầu của những bộ phận khác nhau có thể khác nhautuỳ theo điều kiện sinh sống, điều kiện thu hái. ở vùng khí hậu nhiệt đới hàm lợng tinh dầu cao hơn những vùng khí hậu khác.
Về phân bố, tinh dầu có trong tất cả các bộ phận của cây, nhiều nhất ở ngọn, nhng cũng có trong thân, rễ, vỏ, hạt, củ. Thờng vào thời kỳ sắp và trong khi ra hoa hàm lợng tinh dầu trong cây là lớn nhất. Chính vì vậy, cần tiến hànhthu hái mẫu trong thời kỳ này là tốt nhất.
Việc lấy mẫu và bảo quản mẫu cây có ảnh hởng lớn đến chất lợng và hàm lợng tinh dầu. Tuỳ loại cây, có loại phải cất lúc tơi không đợc để khô vì tinh dầu sẽ giảm hàm lợng. Nhiệt độ và ánh sáng cũng làm thay đổi hàm lợng và tính chất của một số tinh dầu. Vì vậy, tốt nhất là nên thu hái mẫu cây vào buổi sáng sớm hoặc lúc chiều tối ( khi trời mát mẻ ). Mẫu lấy đợc cho vào các túi bóng màu nâu sẫm, cố gắng không để dập nát. Để lu giữ mẫu cây phải:
- Chụp ảnh mẫu cây.
- Chọn những cây, những cành có hoa đẹp làm tiêu bản [4]
I. 6. 2. Phơng pháp định lợng tinh dầu:
Các bộ phận thân lá, lá của cây đợc cắt nhỏ, cho vào bình cầu 2 lit, lắp ống sinh hàn ngợc, nối bình hứng có chia độ đến 0, 1ml. Tiến hành định lợng tinh dầu trong 2- 4 giờ, tuỳ từng loại cây, tới một lúc nào đó đun trong vòng 15 phút không thấy tinh dầu tăng thêm thì dừng lại. Để nguội, đọc thể tích tinh dầu thu đợc.
Hàm lợng tinh dầu ( d < 1 ) đợc tính theo công thức: X ( % ) = a.100b April2006
Trong đó: - a: thể tích tinh dầu tính bằng ml. - b: khối lợng tinh dầu đã trừ độ ẩm tính bằng gam.
Tinh dầu đợc làm khô bằng Na2SO4 khan, đựng trong các lọ tiêu chuẩn đậy kín, bảo quản ở nhiệt độ 0 – 50C trớc khi đem đi phân tích [14]
I. 6. 3. Phơng pháp xác định thành phần hoá học của tinh dầu:
Thành phần hóa học của tinh dầu đợc xác định bằng phong pháp sắc ký khí ( GC ) và sắc ký khí – khối phổ ký liên hợp ( GC/MS ).
Phần 2: Thực nghiệm
II. 1. Hoá chất, dụng cụ, thiết bị máy móc:
II. 1. 1. Hoá chất:
Natrisunfat khan: Na2SO4
II. 1. 2. Dụng cụ thiết bị máy móc:– - ống sinh hàn xoắn.
- Bình tam giác; bình định mức. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Các lọ tiêu chuẩn bảo quản tinh dầu. - Bếp điện.
- Bơm tiêm.
- Máy sắc ký khí - khối phổ.
II. 2. Lấy mẫu và bảo quản mẫu.
II. 2. 1. Cách chọn mẫu và bảo quản mẫu:
- Để bảo quản mẫu xác định tên khoa học, dùng cây tơi có những cành đẹp, vừa phải, không sâu, không quăn, ép làm tiêu bản.
- Chọn mẫu khô vừa, còn nguyên lá, không dập nát, không bị mốc.
II. 2. 2. Địa điểm và thời gian lấy mẫu:
- Mẫu thí nghiệm đợc lấy từ phần trên mặt đất của cây hơng nhu tía (đợc lấy ở dạng tơi và lúc đang ra hoa)
- Mẫu thứ nhất ( kí hiệu: QNA 1 ): cây hơng nhu tía lấy ở huyện Hng Nguyên – Nghệ An.
- Mẫu thữ hai (kí hiệu: QNA 2 ): cây hơng nhu tía lấy ở huyện Diễn Châu – Nghệ An.
Các mẫu cây đợc định danh bởi PGS.TS Ngô Trực Nhã - khoa Sinh, trờng Đại học Vinh.
II. 3. Thí nghiệm tách tinh dầu:
Đối với bộ phận lá và thân cây hơng nhu, để tách tinh dầu chúng tôi chọn phơng pháp lôi cuốn hơi nớc, với bộ dụng cụ gồm: nồi cất ( nồi áp suất ), ống sinh hàn xoắn, bình định mức lắp nh hình vẽ:
Hình 5. II. 3. 1. Cách tiến hành:
Cho 1kg nguyên liệu vào nồi áp suất có lót lớp vỉ dới đáy nồi để ngăn cách đáy nồi với nguyên liệu, cho thêm vào nồi một lit nớc, vặn nắp nồi vừa phải, đủ kín để tránh hiện tợng tinh dầu bị phân huỷ do nhiệt độ và áp suất trong nồi quá lớn. Đun nồi bằng bếp điện, một lúc sau hơi nớc và tinh dầu bốc sang bộ phận làm lạnh, ngng tụ lại thành giọt, chảy xuống bình định lợng, điều chỉnh nhiệt độ bếp vừa phải. Khi sang bình định lợng, tinh dầu nhẹ hơn nớc nổi lên trên, phần nớc ở dới theo nhánh của bình định lợng chảy sang bình tam giác. Đọc thể tích tinh dầu thu đợc ngng đọng lại, sau đó mở khoá, thu lấy tinh dầu vào lọ.
Chú ý: - Nếu không có bình định lợng thì hứng tinh dầu vào bình định mức ( cổ nhỏ ), để cho tinh dầu nổi hẳn lên trên mặt nớc, rồi dùng bơm tiêm hút tinh dầu vào lọ tiêu chuẩn.
- Không nên để hỗn hợp tinh dầu và nớc rơi từng giọt vào bình định mức mà hứng từ từ theo thành bình.
II. 3. 2. Cách làm khô và bảo quản tinh dầu:
Tinh dầu thu đợc ở trên thờng có lẫn một ít nớc nên cần làm khô bằng cách cho một ít tinh thể Na2SO4 khan vào lọ đựng tinh dầu rồi để yên một thời gian ( 10 – 15 phút ), sau đó hút lấy phần tinh dầu sang lọ tiêu chuẩn và bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ dới 50C trớc khi đem phân tích.
II. 4. Xác định thành phần hoá học của tinh dầu
Thành phần hoá học của tinh dầu cây hơng nhu tía đợc xác định bằng ph- ơng pháp sắc ký khí ( GC ) và sắc ký khí – khối phổ ký liên hợp (GC/ MS).
* Sắc ký khí (GC):
Đợc thực hiện trên máy HP 6890 Plus Gas Chromatogaph gắn với detector FID và đợc tách bằng cột HP - 5MS có kích thớc 30m x 0,25mm, lớp phim dày 0,25àm.
Điều kiện phân tích: khí mang Heli, nhiệt độ buồng bơm mẫu 2000C, nhiệt độ detector 2600C, chơng trình nhiệt độ cho cột phân tích từ 600C (2 phút) đến 2200C (10 phút) với tốc độ 40C/ phút.
* Sắc ký khí - khối phổ ký liên hợp (GS/ MS).
Đợc thực hiện bằng hệ thống thiết bị Hewlett Packard 6890 Plus Gas Chromatogaph đợc ghép với khối phổ ký HP 5970 N (70 ev) và đợc tách bằng cột HP - 5MS, kích thớc 30m x 0,25mm, lớp phim dày 0,25àm.
Điều kiện phân tích: khí mang heli, nhiệt độ buồng bơm mẫu 2000C, nhiệt độ detector 2600C, chơng trình nhiệt độ cho cột phân tích từ 600C (2 phút) đến 2200C (10 phút) với tốc độ 40C/ phút.
Các cấu tử đợc nhận dạng bằng cách so sánh khối phổ của chúng với khối phổ có trong th viện phổ: Nist 02. L, Flavor 2. L.
Phần 3: Kết quả và thảo luận (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
III. 1. Xác định thành phần hoá học của tinh dầu cây hơng nhu tía ở huyện Hng Nguyên- Nghệ An.
III. 1. 1. Hàm lợng tinh dầu
Phần trên mặt đất của cây hơng nhu tía (Ocimum sanctum L. ) đợc thu hái vào 5h chiều ngày 30/ tháng 11/ năm 2005 ở Hng Phú – Hng Nguyên – Nghệ