định)
Các phép thử hoạt tính sinh học kiểm định đợc tiến hành tại phòng Sinh học thực nghiệm - Viện hoá học các hợp chất thiên nhiên, Viện Khoa học va Công nghệ Việt Nam.
Việc thử tính kháng vi sinh vật đợc tiến hành theo phơng pháp của Vanden Berger và Vietlinck nh sau:
Bớc 1: Sàng lọc sơ bộ tìm chất có hoạt tính.
Bớc 2: Tìm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của chất có hoạt tính.
Kháng sinh kiểm định bao gồm: ampixilin đối với vi khuẩn Gr(+), tetracylin đối với vi khuẩn Gr(-), Nystatin đối với nấm sợi và nấm men. Nấm và vi khuẩn đợc duy trì trong môi trờng dinh dỡng: Saboraud dextrose both và Trypcase soya broth (TSB). Các chủng kiểm định đợc hoạt hoá trớc khi tiến hành thử nghiệm trên môi trờng dinh dỡng dịch thể (24 giờ đối với vi khuẩn, 48 giờ đối với nấm).
Mẫu thử đợc hoà tan trong dung môi dimetylsylfoxit (DMSO) 100%, với 4 - 10 thang nồng độ đợc pha từ dịch gốc rồi nhỏ sang phiến vi lợng 96 giếng. Vi sinh vật kiểm định sau khi hoạt hoá đợc pha loãng băbgf môi trờng dinh dỡng cho tới nồng độ tơng đơng 0,5 đơn vị Meland (khoảng 108 vsv/ml). Để trong tủ ấm
370C/24 giờ đối với vi khuẩn và 300C/48 giờ đối với nấm. Sau đó đọc kết quả và tibhs giá trị ức chế tối thiểu (MIC).
Mẫu thô có giá trị MIC ≤ 200àg/ml, mẫu tinh có giá trị MIC≤ 50àg/ml đợc xem là có hoạt tính.
Chơng 3: Thực nghiệm
3.1. Chuẩn bị hoá chất, dụng cụ, máy móc và dung dịch thí nghiệm. 3.1.1. Hoá chất.
Tất cả các hoá chất đều thuộc hạng tinh khiết phân tích Nớc cất hai lần.
3.1.2. Máy móc và dụng cụ.
- Máy đo pH 744-pH meter có độ chính xác 0.01, điện cực thuỷ tinh kết hợp. - Cân phân tích có độ chính xác 0.1mg.
- Phổ hấp thụ hồng ngoại đợc đo trên máy Impact 4100 Nicolet
- Phổ hấp thụ tử ngoại đợc đo trên máy quang phổ tử ngoại Shimadzu. - Máy khuấy từ, bếp điện, bình hút ẩm và các dụng cụ khác.
3.1.3. Chuẩn bị dung dịch thí nghiệm. 3.1.3.1. Dung dịch EDTA 0,01M.
Hoà tan hoàn toàn 10g EDTA(Na2C10H14O8N2. 2H2O) trong 100g nớc sau đó thêm rợu etylic cho đến khi ngừng tách kết tủa, lọc lấy kết tủa, rửa kết tủa bằng r- ợu etylic, ete. Sấy kết tủa trong không khí khopảng 12 giờ rồi cho vào tủ sấy ở nhiệt độ 800 tới trọng lợng không đổi, để nguội trong bình hút ẩm ta thu đợc EDTA hoàn toàn tinh khiết.
Cân chính xác 1,8610g EDTA thu đợc cho vào bình định mức 500ml pha nớc cất tới vạch, thu đợc EDTA 0,01 M.
3.1.3.2. Dung dịch NH4Cl 1M.
Cân 13,375g NH4Cl vào bình định mức 250ml. Cho nớc cất vào lắc kĩ sau đó cho nớc cất tới vạch đợc dung dịch NH4Cl 1M.
3.1.3.3. Dung dịch Ni2+ 0.1 M.
Cân chính xác 1,315g NiSO4.6H2O vào bình định múc 50ml, thêm nớc cất tới vạch thu đợc dung dịch Ni2+ 0,1 M.
3.2. Tổng hợp.
Hoà tan hoàn toàn 1,67g 4-phenyl thiosemicacbazit (0,01 mol) vào dung dịch chứa 120 ml etanol và 60 ml nớc. Cho từ từ 1,5 ml octanal (0,01 mol) và 5 ml dung dịch axit axetic khan và dung dịch trên, khuấy bằng máy khuấy từ khoảng 90 phút. Sau đó để yên ở nhiệt độ phòng khoảng 6-7 giờ. Từ dung dịch tách ra tinh thể màu trắng dạng vảy. Lọc, rửa tinh thể nhiều lần bằng hỗn hợp etanol – nớc (3/2). Làm khô trong bình hút ẩm chứa P2O5 đến khối lợng không đổi.
3.2.2. Tổng hợp phức chất.
3.2.2.1. Tổng hợp phức chất của phenylalanin và niken(II).
Khảo sát sự tạo phức.
Khảo sát về tỷ lệ: Trong quá trình thực nghiệm chúng tôi đã tiến hành tổng hợp phức chất với các tỷ lệ nh sau: Ni2+: Phen= 1:1; Ni2+: Phen= 1:2; Ni2+: Phen= 1:3. Kết quả cho thấy phức rắn tạo thành đều có màu xanh da trời. Kết quả cho thấy tỷ lệ Ni2+: Phen= 1:2 cho phức chất tạo thành nhiều hơn so với hai tỷ lệ kia.
Khảo sát về yếu tố pH: Ta tổng hợp phức theo tỷ lệ Ni2+: Phen= 1:2 ở các pH khác nhau cụ thể pH= 4, 5, 6. Kết quả cho thấy ở pH=6 phức chất tạo ra nhiều nhất.
Khảo sát về yếu tố nhiệt độ: Ta tổng hợp theo tỷ lệ Ni2+: Phen= 1:2 và ở pH = 6. Nhng bây giờ ta thay đổi nhiệt độ =300, 400,500 kết quả cho thấy ở nhiệt độ 400 C phức chất cho ra nhiều nhất. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Qua khảo sát các yếu tố trên chúng tôi đa lựa chọn cách tổng hợp phức chất của phenylalanin với niken(II) theo tỷ lệ Ni2+: Phen= 1:2, ở pH=6 và ở nhiệt độ 400 C bằng cách sau:
Cho 10ml Ni2+ vào cốc. Sau đó cho 30 ml phenylalanin vào, thêm từ từ vài giọt NaOH. Khuấy bằng máy khuấy từ trong 2h kết tủa xanh da trời từ từ xuất hiện. Để yên kết tủa trong 1 ngày, lọc kết tủa bằng rợu va nớc cất. Sau đó cho kết tủa thu đợc vào bình hút ẩm chứa P2O5.
3.2.2.2. Tổng hợp phức chất 4- phenyl thiosemicacbazon octanal với niken(II).
Khảo sát tỷ lệ rợu nớc cho thấy rằng với tỷ lệ rợu: nớc = 3:2 về thể tích thì cả phối tử và kim loại đều không bị tách, vì vậy chúng tôi tổng hợp phức trong môi rợu: nớc =3:2.
Khảo sát sự tạo phức:
Khảo sát về tỷ lệ: Trong quá trình thực nghiệm chúng tôi đã tiến hành tổng hợp phức chất với các tỷ lệ nh sau: Ni2+: H4phthioct= 1:1;
Ni2+: H4phthioct = 1:2; Ni2+: H4phthioct = 1:3. Kết quả cho thấy phức rắn tạo thành đều có màu xanh úa. Kết quả cho thấy tỷ lệ Ni2+: H4phthioct = 1:2 cho phức chất tạo thành nhiều hơn so với hai tỷ lệ kia.
Khảo sát về yếu tố pH: Ta tổng hợp phức theo tỷ lệ Ni2+: H4phthioct = 1:2 ở các pH khác nhau cụ thể pH= 5, 6,8. Kết quả cho thấy ở pH=5phức chất tạo ra nhiều nhất.
Khảo sát về yếu tố nhiệt độ: Ta tổng hợp theo tỷ lệ Ni2+: H4phthioct = 1:2 và ở pH = 5. Nhng bây giờ ta thay đổi nhiệt độ =300, 400,500 kết quả cho thấy ở nhiệt độ 400 C phức chất cho ra nhiều nhất.
Qua các yếu tố khảo sát trên ta tiến hành tổng hợp phức nh sau:
Hoà tan 0,554 g 4-phenyl thiosemicacbazon octanal (0,002 mol) vào dung dịch có chứa 100 ml etanol thu đợc dung dịch 1.
Hoà tan 0,300 g NiSO4.6H2O (0,001 mol) vào 20 ml nớc thu đợc dung dịch 2.
Đun nóng dung dịch 1 ở nhiệt độ khoảng 400C cho từ từ dung dịch 2 vào. Khuấy bằng máy khuấy từ trong 2 giờ, dung dịch chuyển sang màu xanh sẫm hơi vàng đồng thời xuất hiện vẫn đục màu vàng nhạt. Để yên hỗn hợp trong 12 giờ từ dung dịch tách ra tinh thể màu vàng nhạt. Lọc hút lấy tinh thể, rửa nhiều lần bằng etanol, nớc. Làm khô trong bình hút ẩm chứa P2O5 đến khối lợng không đổi.
3.2.3.2. Tổng hợp phức chất 4-phenyl thiosemicacbazon octanal và phenylalanin với niken(II).
Khảo sát về tỷ lệ: Trong quá trình thực nghiệm chúng tôi đã tiến hành tổng hợp phức chất với các tỷ lệ nh sau: Ni2+: H4phthioct: Phen= 1:1:1; Ni2+: H4phthioct : Phen = 1:2:1; Ni2+: H4phthioct: Phen = 1:1: 2. Kết quả cho thấy phức rắn tạo thành đều có màu xanh đất. Kết quả cho thấy tỷ lệ Ni2+: H4phthioct: Phen = 1:1:1 cho phức chất tạo thành nhiều hơn so với hai tỷ lệ kia.
Khảo sát về yếu tố pH: Ta tổng hợp phức theo tỷ lệ Ni2+: H4phthioct : Phen = 1:1:1 ở các pH khác nhau cụ thể pH= 4, 5, 6. Kết quả cho thấy ở pH=6 phức chất tạo ra nhiều nhất.
Khảo sát về yếu tố nhiệt độ: Ta tổng hợp theo tỷ lệ Ni2+: H4phthioct: Phen = 1:1:1 và ở pH = 6. Nhng bây giờ ta thay đổi nhiệt độ =300, 400,500 kết quả cho thấy ở nhiệt độ 400 C phức chất cho ra nhiều nhất.
Qua các yếu tố khảo sát trên ta tiến hành tổng hợp phức nh sau:
Hoà tan 2,63 g NiSO4 vào 20 ml đợc dung dịch 1. Hoà tan 1,65 g Phenylalanin vào 20 ml nớc đợc dung dịch 2. Hoà tan 2,01 g 4-phenyl thiosemicacbazon octanal vào 20 ml rợu thu đợc dung dịch 3. Trộn dung dịch 1,2,3 vào, thêm vài giọt NaOH. Khuấty bằng máy khuấy từ 2 h thấy kết tủa màu đất từ từ xuất hiện. Để yên kết tủa ở nhiệt độ phòng trong 6 h, lọc rử kết tủa cho vào bình hút ẩm chứa P2O5.
3.3.Kết quả.
3.3.1. Phổ khối lợng.
3.3.1.1. Phổ MS của [Ni(Phen)2].
Phổ khối lợng của chất đã tổng hợp xuât hiện ở pic [MS]+ với m/z= 387, phù hợp với công thức phân tử của phức niken(II) với phenylalanin Ni(C9H8O2N)2.
Giá trị m/z = 120 đó là giá trị của mảnh C6H5CHNH2CH-. Giá trị m/z =165.9 đó là giá trị của mảnh phối tử phenylalanin.
Hình 3.1. Phổ MS của phức [Ni(Phen)2]
Hình : Phổ MS của 4-phenyl thiosemicacbazon octanal
Trên phổ của phối tử xuất hiện cụm pic phân tử có số khối 278, 279,280 phù hợp với phân tử C15H23N3S. Trong trờng hợp này , trên phổ MS của 4-phenyl thiosemicacbazon octanal cũng chỉ xuất hiện cụm pic ion phân tử với cờng độ lớn và ít các mảnh pic. Để nghiên cứu cơ chế phá mảnh cần phải kết hợp với phổ MS lần hai của pic ion phân tử. Trên phổ MS2 của 4-phenyl thiosemicacbazon octanal xuất hiện rất nhiều các pic mảnh thuận lợi cho việc nghiên cứu cấu trúc và cơ chế phá mảnh. Từ sự phân tích phổ thực nghiệm và kết quả mô phỏng chúng tôi đa ra cấu trúc và sơ đồ phân tích mảnh của phối tử nh sau:
Trên phổ MS của phức chất Ni(II) thu đợc cụm pic phân tử [MH]+ với m/z= 511,512,513,514 tơng ứng với công thức phân tử là [Ni(4phthioct)2]. Pic mảnh m/z= 278 có cờng độ lớn ứng vớimảnh phối tử [H4phthioct+H]+, các pic khác đều có cờng độ bé. kết quả này cho thấy phức nghiên cứu có công thức phân tử nh dự kiến và khá bền. Trên phổ MS2 của mảnh ion phân tử xuất hiện nhiều cụm pic trong đó một số pic có cờng độ lớn ứng với một số mảnh đặc trng [ni(4phthioct)]+. Từ kết quả MS, MS2 chúng tôi đa ra cấu trúc và sơ đồ phân mảnh của phức chất [Ni(4phthioct)2] nh sau:
3.3.1.3. Phức đa phối tử 4-phenyl thiosemicacbazon octanal và phenylalanin với Niken (II).
3.3.2. Phổ hồng ngoại. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.3.2.1. Phổ IR của [Ni(phen)2]
Hình 3.3 : Phổ IRcủa phức[Ni(Phen)2].
Quang phổ hồng ngoại của phenylalanin tự do và phức của nó với niken (II) tổng hợp đợc đều xuất hiện các vạch hấp thụ đặc trng cho các nhóm chức chứa trong hợp chất.
Một số dải hấp thụ đặc trng trong phổ hồng ngoại của phenylalanin và phức của nó với niken(II).
Bảng : Tần số (cm-1) một số dải hấp thụ đặc trng trong phổ hồng ngoại của phenylalanin và phức của nó với niken(II).
Chất νOH νNH2 νCOtựdo νCOO- νNi-X(X=O,N)
Phen 3462 3081 1623 1587 526; 476 Ni(Phen)2 - 3067 1633 1591 594; 484
Các axit amin trong dung dịch thờng tồn tại ở hai dạng, phân tử và dạng ion nh sau:
R―CH―COOH → R―CH―COO-
│ │
NH2 NH3+
Vạch hấp thụ xuất hiện trong khoảng 3300→2900cm-1 có thể quy gán cho dao động hoá trị đối xứng và bất đối xứng của nhóm NH2. Trong phức chất tổng hợp đợc vạch hấp thụ ứng với dao động chuyển về bớc sóng ngắn, chứng tỏ đã có sự tạo liên kết giữa NH2 với ion kim loại trung tâm.
Vạch ứng với tần số dao động hoá trị của nhóm OH trong phân tử nớc thờng xuất hiện trong khoảng 3400 – 3600 cm-1. Trong phổ hồng ngoại của phối tử xuất hiện dải 3462 cm-1, còn trong phức không có chứng tỏ phức chất tạo ra không ngậm nớc.
Trong phổ hồng ngoại của phối tử giá trị của NH2 yếu hơn trong phức chất. ở trạng thái tự do phenylalanin tồn tại ở trạng thái cân bằng. Trên phổ hồng ngoại của phức chất có dải hấp thụ 3067 ứng với NH2 mạnh hơn rất nhiều so với phối tử chứng tỏ có sự tạo phức xảy ra và trong phức chất co chứa nhóm NH2.
Có sự biến đổi dao động của nhóm Co khi chuyển tùe phối tử sang phức chất chứng tỏ có sự tạo phức.
Xem xét trên phổ hồng ngoại của phức thấy xuất hiện hai dải vùng tần số thấp 594, 484 cm-1, cho thấy đây có thể là các dải hấp thụ ứng với liên kết Ni-N va Ni- O trong phức chất.
3.2.2.2. Phổ IR của octanal va 4-phenyl thiosemicacbazon octanal và phức [Ni(4phthioct)].
Hình : Phổ IR của 4-phenyl thiosemicacbazon octanal
Bảng :
Chất νNH δNH2 νCN νNN νCS νM-X(X=N,S)
H4phthioct 3225; 3146 1593 1546 1059 759
Ni(4phthioct)2 3390 1554 1514 1078 745 594;494
So sánh phổ hồng ngoại của phối tử và phức chất, đồng thời dựa vào kết quả qui kết phổ IR của một số tác giả đối với nhóm chất thiosemicacbazon và phức của nó, chúng tôi khẳng định phức chất đã tạo thành. Trên phhổ của phối tử các dải hấp thụ ở vùng tần số cao, ở 3225 cm_1 và 3246 cm_1 ứng với dao động hoá trị đối xứng và bất đối xứng của nhóm NH-amit, trong đó tần số của nhóm thấp hơn là của nhóm NH-hidrazin. Trên phổ hồng ngsội của phối tử không tồhn tại dải hấp thụ đạc trng cho dao động của nhóm SH ở vùng 2570 cm_1, chứng tỏ ở trạng thái tự do phối tử tồn tại ở dạng thion. Trên phổ IR của phức chất dải hấp thụ ứng với dao động của nhóm NH biến mất, điều này chứng tỏ prôtn của nhóm NH đã tách khỏi N thông qua quá trình enol hoá. Dải hấp thụ đặc trng của nhóm C=N chuyển dịch về tần số thấp hớno với dải hấp thụ tơng ứng của phối tử, cho thấy nguyên tử N của nhóm hidrazin đã tham gia tạo liên kết phối trí với ion kim loại. Dải hấp thụ của nhóm C=S xuất hiện trên phổ IR của phối tử ở tần số 749 cm-1, trên phổ IR của phức chất dịch chuyển đến 751cm-1
3.3.3. Phổ hấp thụ electron.
3.3.3.1. Phổ UV-VIS của [Ni(Phen)2]
Trên phổ UV của phối tử và phức chất thấy khác nhau chng tỏ đã có sự tạo phức.
3.3.4. Kết quả thử hoạt tính.
3.3.4.1. Phức [ Ni(Phen)2].
Bcillus cereus Bcillus pullmilus
Phen + + (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ni2+ ++ ++
[Ni(Phen)2] +++ ++
3.3.4.2. Phức
Hợp chất V.k Gr (-) V.k Gr (+)Các vi sinh vật thử nghiệmNấm men Nấm mốc
E P B S.u S.c C Asp F
NiSO4 - - - -
4phthioct + - - - +
Phức Ni(II) - - - -
E: E. Coli; P: P. Aeruginosa; B: B.subtillis; S.u: S. Uareus; Asp: Asp.niger F: F. Oxysporum; S.c: S.cerevisiae; C: C.albicans
kết luận
Sau một thời gian nghiên cứu, tổng hợp tài liệu và tiến hành, chúng tôi đã giải quyết đợc những vấn đề sau:
1. Đã tổng hợp đợc phối tử 4-phenyl thiosemicacbazon octanal. Tổng hợp phức chất của Niken(II) với phenylalanin và 4-phenyl thiosemicacbazon octanal.
2. Bằng phơng pháp phổ hồng ngoại , phổ khối lợng đã xác định đợc công thức của hai phức chất đơn phối tử Ni(Phen)2 và Ni(4phthioct)2.
3. Trên cơ sở nghiên cứu quang phổ hồng ngoại, phổ hấp thụ electron của các phức chất, chúng tôi đã đề nghị công thức cấu tạo số phối tử.
Tài liệu tham khảo.
Tiếng Việt.
[1]. Trần thị Ân và cộng sự (1973), Hoá sinh đại cơng, Nhà xuất bản Đại học và THCN.
[2]. Phạm Thị Trân Châu, Trần Thi áng (1972), Hoá sinh học, Nhà xuất bản Giáo dục Hà Nội.
[3]. Trịnh Ngọc Châu (1993), Luận án phó tiến sĩ Khoa học, Trờng Đại học tổng hợp Hà Nội.
[4]. Nguyễn Hữu Đỉnh, Trần Thị Đà(1999), ứng dụng một số phơng pháp phổ
[5 ]. Vũ Đăng Độ(2001), Cácphơng pháp vật lý trong hoá học, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội.
[6]. Trần ích (1979), Hoá sinh học, Nhà xuất bản Giáo dục Hà Nội.
[7]. G. Schwarzenbach, H. Flachka (1999), Chuẩn độ phức chất, NXB Khoa học và Kỷ thuật, Hà Nôi.
[8]. Lê Chí Kiên(2007), Hoá học phức chất, nhà xuất bản Đại học Quốc Gia Hà Nội.
[9]. Hoàng Nhâm (2000), Hoá học vô cơ, tập 3, Nhà xuất bản Giáo Dục.
[10]. Dơng Tuấn Quang (2002), Luận án tiến sĩ, Viện hoá học, Trung tâm và Khoa học tự nhiên và công nghệ Quốc Gia.
[11]. Phan Tống Sơn, Trần Quốc Sơn, Đặng Nh Tại (1980), Cơ sở hoá học hữu cơ, Nhà xuất bản Đại học và THCN Hà Nội.
[12]. Nguyễn Đình Thuông (1996), Hoá học các hợp chất phối trí, Phần II, Đại học s phạm Vinh.
[13]. Nguyễn Đình Triệu (2001), Các phơng pháp phân tích vật lý và hoá, Tập 1,Nhà xuất bản Khoa học và Kỷ thuật.
[14]. Nguyễn Đình Triệu (1999), Các phơng pháp vật lý ứng dụng trong hoáhọc, Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia Hà Nội. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
[15]. Jonh D, Roberts, Marjoriec(1981), i Hoá học hữu cơ hiện đại, NXB Khoa học kỷ thuật Hà Nội.