a. Mục đích
Sau khi xác định được điều kiện môi trường và thời gian nuôi Aspergillus oryzae
sinh tổng hợp amylase mạnh nhất thì tiến hành sấy nhằm bảo quản chế phẩm lâu dài.
b. Tiến hành
Nấm mốc được nuôi cấy ở những điều kiện thích hợp, chế phẩm enzyme thô thu được đem đi sấy chân không nhằm hạn chế nhiệt độ cao ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme.
Thực hiện ở ba mức nhiệt độ sấy: 400C, 450C, 500C. Số nghiệm thức: 3 nghiệm thức
Số mẫu thí nghiệm: 3 mẫu Đo lại hoạt tính của enzyme amylase.
400C 450C 500C Hình 6: Sơđồ bố trí thí nghiệm 2 Đo hoạt tính amylase Giống (0.2%) Làm nguội Nguyên liệu (100g) Ngâm (1 giờ) Nấu Phối trộn Tủ nuôi cấy Sấy Điều chỉnh ẩm (60%) Thanh trùng (1210C, 15 phút)
Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Hoạt tính enzyme amylase trong quá trình nuôi cấy ở nhiệt độ môi trường,
độ ẩm môi trường và thời gian nuôi cấy khác nhau
Ba nhân tố nhiệt độ, độ ẩm và thời gian được bố trí thí nghiệm theo sơđồ hình 5. Mốc giống Aspergillus oryzaeđược nuôi cấy trên môi trường nếp than đã được hồ hóa ở những độ ẩm nhất định, chúng được ủ ở 3 mức nhiệt độ khác nhau và sau mỗi ngày được thử hoạt tính. Kết thúc thí nghiệm kết quả thu được là giá trị trung bình của 3 lần lập lại.
Bảng 3: Hoạt tính của enzyme amylase
Nhiệt độ (0C) Độẩm (%) Thời gian (ngày) Hoạt tính (đv/g)
27 50 1 4,382 27 50 2 6,808 27 50 3 7,963 27 60 1 5,381 27 60 2 6,354 27 60 3 8,459 27 70 1 1,926 27 70 2 4,646 27 70 3 4,574 30 50 1 5,934 30 50 2 7,078 30 50 3 6,273 30 60 1 6,164 30 60 2 8,614 30 60 3 7,328 30 70 1 5,014 30 70 2 6,372 30 70 3 6,247 35 50 1 2,759 35 50 2 6,495 35 50 3 6,052 35 60 1 3,268 35 60 2 6,349 35 60 3 5,054 35 70 1 4,705 35 70 2 2,546
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Hoạt tính (đv/g) 1 ngày 2 ngày 3 ngày 50% 60% 70% 50% 60% 70% 50% 60% 70% 270C 300C 350C Hình 7: Hoạt tính enzyme amylase
Bảng được trình bày theo hình 7 cho thấy:
- Hoạt tính enzyme amylase được sinh ra cao nhất sau 2 ngày nuôi cấy, ở nhiệt độ môi trường 300C và 60% ẩm của nếp than.
- Hoạt tính enzyme amylase cũng được tổng hợp mạnh sau 3 ngày nuôi cấy, ở nhiệt độ 270C và 60% ẩm của nếp than.
- Nhiệt độ môi trường 350C kiềm hãm sự phát triển của mốc làm giảm khả năng tổng hợp enzyme amylase, đặc biệt khi độ ẩm cao (70%) thì hoạt tính giảm theo từng ngày.
- Nhiệt độ môi trường 270C cho thấy hoạt tính enzyme amylase tăng chậm qua từng ngày, ngày thứ 3 cho hoạt tính cao hơn 2 ngày đầu.
- Nhiệt độ môi trường 300C, hoạt tính enzyme cao hơn so với hai mức độ trên. - Độẩm 50% và 70% đều cho hoạt tính thấp.
Nhiệt độ môi trường ảnh hưởng rất nhiều đến khả năng tổng hợp enzyme amylase của nấm mốc Aspergillus oryzae trong quá trình nuôi cấy. Nhiệt độ cao 350C thì mốc khó phát triển, hoạt tính enzyme thấp. Nhiệt độ thấp 270C mốc phát triển chậm, thời gian tổng hợp enzyme kéo dài.
Cùng với nhiệt độ môi trường, độ ẩm nếp than sau thanh trùng có ý nghĩa quan trọng nhất định đến sự phát triển của nấm mốc cũng như khả năng sinh enzyme.
Aspergillus oryzae là loài hiếu khí bắt buộc do đó 70% ẩm trong nếp than làm giảm mức độ thoáng khí của môi trường, mốc phát triển kém đồng thời quá trình nuôi cấy không phải là vô trùng tuyệt đối, với độ ẩm cao sẽ tạo điều kiện cho các vi khuẩn tạp phát triển. Ngoài ra để sinh trưởng và phát triển trên môi trường nếp than thì nấm mốc cần phải tiết enzyme amylase thực hiện phản ứng thủy phân nguồn dinh dưỡng từ nếp than nên rất cần sự hiện diện của nước trong nguyên liệu. Khi độ ẩm 50%, môi trường nuôi cấy khô thì mốc sẽ sinh nhiều bào tử làm hoạt tính bị giảm.
Thời gian nuôi cấy hay thời điểm thu nhận chế phẩm enzyme là một trong những nhân tố quyết định hoạt tính enzyme thu được cao hay thấp. Ngay sau khi nuôi cấy (1ngày) nấm mốc chưa gia tăng mật số, có thểđây là thời gian chúng làm quen với môi trường nuôi sống và chuẩn bị cho sự tăng trưởng vượt bậc sau đó, cho nên thu chế phẩm quá sớm thì mốc chưa tổng hợp nhiều enzyme. Từ 2 – 3 ngày khi nấm mốc đã thích nghi với môi trường mới thì bắt đầu nhân mật số lên với tốc độ rất nhanh, quá trình này diễn ra đồng thời với lượng enzyme được mốc tiết ra môi trường càng nhiều để lấy thức ăn. Đây chính là thời điểm tốt nhất để thu chế phẩm enzyme. Từ ngày thứ 3 trở đi có thể mốc đã làm cạn dần thành phần dinh dưỡng thì mốc chết dần hay tạo bào tử làm lượng enzyme hiện diện trong canh trường sẽ giảm đáng kể. Ngoài ra enzyme có bản chất là protein, theo thời gian protein sẽ bị phân hủy làm giảm hoạt tính enzyme.
Qua hình 7 ta có thể rút ra các thông số thích hợp trong quá trình nuôi cấy: - Nhiệt độ môi trường: 300C
- Độẩm nếp than: 60% - Thời gian: 2 ngày
Kết quả trên bảng còn được thống kê với tiêu chí tìm ra sự khác biệt cũng như tổ hợp nghiệm thức tốt nhất cho quá trình nuôi cấy.
Bảng 4: Biến đổi hoạt tính của enzyme amylase theo nhiệt độ môi trường, độẩm môi trường và thời gian nuôi cấy.
Kết quả thống kê cho thấy các mẫu nuôi ở nhiệt độ 300C, 60% ẩm, thời gian 2 ngày sẽ cho hoạt độ amylase cao nhất là 8,614 đv/g và khác biệt không ý nghĩa với các mẫu nuôi ở nhiệt độ 270C, 60% ẩm, thời gian 3 ngày là 8,46 đv/g.
Các mẫu nuôi ở 300C, 50% ẩm, 2 ngày; 300C, 60% ẩm, 3ngày và mẫu ở 270C, 50% ẩm, 3 ngày cũng có hoạt tính cao (7,007 – 7,962 đv/g) nhưng thấp hơn các mẫu ở hai tổ hợp nghiệm thức trên.
Ở tổ hợp nghiệm thức 270C, 70% ẩm, 1 ngày các mẫu cho hoạt tính enzyme thấp nhất là 1,926 đv/g và khác biệt có ý nghĩa so với các mẫu khác.
Như vậy thông qua hình 7 và bảng 4 có thể rút ra 2 tổ hợp nghiệm thức tối thích cho sự phát triển của nấm mốc cũng như khả năng tổng hợp enzyme nhiều nhất như sau:
- Tổ hợp 1: Nhiệt độ môi trường 300C, độ ẩm nếp than 60% sau 2 ngày nuôi cấy.
- Tổ hợp 2: Nhiệt độ môi trường 270C, độ ẩm nếp than 60% sau 3 ngày nuôi cấy.
Xét về tính kinh tế thì tổ hợp 1 thích hợp nhất cho quá trình chế biến koji nếp than.
Thời gian nuôi cấy (ngày)
1 2 3 27 4,382i 6,808cde 7,963ab 50 27 5,381gh 6,354ef 8,46a 60 27 1,926l 4,646i 4,547i 70 30 5,933fg 7,077cd 6,273ef 50 30 6,164ef 8,614a 7,328bc 60 30 5,014hi 6,372def 6,25ef 70 35 2,76jk 6,494def 6,052fg 50 35 3,268j 6,35ef 5,054hi 60 35 4,705hi 2,545kl 2,259kl 70 Nhiệt độ (0C) Độẩm (%)
Hình 8: Chế phẩm koji nếp than (300C, 60%, 2ngày)
Hình 9:Phản ứng thủy phân tinh bột của enzyme amylase (chế phẩm nuôi ở 300C, 60% ẩm, 2ngày)
4.2 Hoạt tính của enzyme amylase trong quá trình sấy chân không ở nhiệt độ khác nhau
Với kết quả nhận được từ thí nghiệm trước, nấm mốc phát triển tốt và cho hoạt tính enzyme amylase mạnh nhất ở 300C, 60% ẩm và thời gian 2 ngày. Chế phẩm koji được thu nhận lúc này nếu để trong môi trường tự nhiên thì nấm mốc sẽ chết dần kéo theo hoạt tính enzyme giảm. Vì vậy, đểđảm bảo chất lượng chế phẩm koji sẽ tiến hành sấy chế phẩm ở những nhiệt độ khác nhau (400C, 450C và 500C) làm giảm lượng ẩm có trong chế phẩm, kéo dài thời gian bảo quản.
Hướng tới tiêu chí hạn chế sựảnh hưởng của nhiệt độđến tế bào nấm mốc và hoạt tính enzyme amylase, trong thí nghiệm này chế phẩm koji tươi được sấy bằng thiết bị sấy chân không. Trong quá trình sấy, sau mỗi 2 giờ chế phẩm sẽđựơc cân và đo hoạt tính. Kết thúc quá trình sấy, sản phẩm khô được đem đi nghiền, đo hoạt tính và bảo quản.
Bảng 5: Thay đổi trạng thái ẩm (%) của sản phẩm koji nếp than trong khi sấy
Nhiệt độ sấy (0C) 400C 450C 500C 0 62,88 64,54 61,91 2 52,95 54,69 52,78 4 44,51 47,37 39,47 6 34,02 33,76 2415 8 25,16 14,41 10,31 10 18,06 7,608 7,436 12 14,33 4,831 4,368 14 5,787 3,615 4,20 16 4,649 3,168 3,91 18 4,231 3,062 3,764 Thời gian sấy (giờ)
0 10 20 30 40 50 60 70 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Thời gian (giờ) Độẩm tương đối (%) Series1 Series2 Series3 400C 450C 500C
Hình 11: Thay đổi độẩm của chế phẩm theo thời gian sấy
Quan sát bảng 5 và hình 11cho thấyở 500C tốc độ mất ẩm cao nhất và thấp nhất ở 400C. Khi sấy ở nhiệt độ càng cao thì ẩm trong vật được gia nhiệt (quá trình truyền nhiệt) đến nhiệt độ sôi ứng với áp suất hơi nước trong môi trường không khí trong buồng sấy càng nhanh thúc đẩy quá trình trao đổi chất giữa chế phẩm và môi trường diễn ra với tốc độ cao hơn và lượng ẩm mất nhiều hơn.
Từ 0 – 8 giờ tốc độ mất ẩm diễn ra rất nhanh, ở chế độ nhiệt độ 500C ẩm giảm tuyến tính theo một đường thẳng, còn ở mức 450C tốc độ bay hơi ẩm từ 0 – 4 giờ chậm hơn so với mẫu được sấy ở 400C nhưng sau 8 giờ thì nhanh hơn.
Từ 8 – 12 giờ kế tiếp lượng ẩm thoát ra càng chậm do ẩm tự do đã bay hơi hết còn lại trong vật là ẩm liên kết. Nhìn vào đồ thị lúc này thì tốc độ mất ẩm ở 450C và 500C gần bằng nhau và nhanh hơn so với ở 400C.
Từ 14 giờ trởđi ẩm giảm rất ít, quá trình sấy càng tiếp diễn thì độẩm của vật càng giảm đến khi độ ẩm của vật giảm đến độ ẩm cân bằng ứng với điều kiện môi trường không khí ẩm trong buồng sấy. Lúc này khối lượng của chế phẩm không thay đổi giữa 2 lần sấy gần nhất, mẫu sấy ở 400C không thay đổi khối lượng sau 18 giờ còn mẫu sấy ở 450C và 500C là sau 16 giờ và quá trình sấy kết thúc.
Nhìn chung ở mức nhiệt độ 500C, 16 – 18h thì sản phẩm được sấy nhanh nhất. Sản phẩm koji nếp than khô có độ ẩm nhỏ hơn độ ẩm cân bằng ứng với không khí trong phòng ta không thểđể sản phẩm trong điều kiện này và như vậy sản phẩm sẽ hấp thu ẩm làm độ ẩm của nó tăng lên dẫn đến giảm đáng kể thời gian bảo quản an
Hình 12: Chế phẩm koji nếp than trước khi đem sấy (300C, 60%, 2 ngày)
Hình 13: Chế phẩm koji nếp than sau khi sấy ở 500C
Bảng 6: Hoạt tính của enzyme trong quá trình sấy ở những nhiệt độ sấy khác nhau Nhiệt độ sấy (0C) 400C 450C 500C 0 7,059 7,092 6,967 2 7,021 6,782 6,864 4 6,829 6,229 6,777 6 7,103 6,174 6,820 8 7,092 5,805 6,945 10 6,902 6,402 7,037 12 6,728 5,045 7,287 14 6,956 6,087 6,798 16 6,912 5,729 7,227 18 6,945 6,011 7,707 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Thời gian (giờ) Hoạt tính (đv/g) Series1 Series2 Series3 400C 450C 500C
Hình 15: Thay đổi hoạt tính của enzyme amylase theo nhiệt độ sấy
Qua hình15 thể hiện hoạt tính của enzyme amylase trong quá trình sấy ở nhiệt độ 400C và 500C không thay đổi lớn. Còn ở 450C thì hoạt tính giảm bất thường, điều này do chế phẩm koji khi được đem xác định hoạt tính sau mỗi 2 giờ sấy đã không được ngâm đúng thời gian (1 giờ) làm cho chế phẩm hút nước và trương nở tạo điều kiện thuận lợi cho công đoạn trích ly enzyme amylase tiếp theo.
Ở nhiệt độ 400C và 500C hoạt lực của enzyme không thay đổi theo thời gian sấy. Nh ng 500C thì s n ph m t tr ng thái cân b ng nhanh h n. Vì th chúng tôi
Hình 15: Hoạt tính enzyme amylase theo thời gian sấy ở 400C
Chương 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1 Kết luận
Chế phẩm koji nếp than là một chế phẩm enzyme ở dạng thô. Trong quá trình nuôi cấy nếu không đảm bảo các điều kiện tối thích cho sự phát triển của nấm mốc
Aspergillus oryzae dẫn đến làm giảm khả năng tổng hợp hoạt tính enzyme amylase, hay kéo dài thời gian nuôi cấy làm giảm năng suất sản xuất. Ở công đoạn sấy cần phải chú ý đến nhiệt độ sấy, nhiệt độ quá cao làm hoạt tính giảm, nhiệt độ thấp thì mốc sẽ tiếp tục phát triển.
Qua thời gian nghiên cứu, những thông số tối ưu cho qui trình sản xuất chế phẩm koji nếp than như sau:
- Độẩm nếp than sau khi hồ hoá: 60% - Nhiệt độ tủủ: 300C
- Thời gian nuôi: 2 ngày - Nhiệt độ sấy: 500C, 16 – 18h
5.2 Đề nghị
Với thời gian nghiên cứu có hạn nên không thể nghiên cứu quá trình bảo quản sản phẩm sau khi sấy. Vì vậy, tôi xin đề nghị một số vấn đề cần nghiên cứu tiếp theo: - Khảo sát hoạt tính protease được sinh ra trên môi trường nếp than sau nuôi cấy. - Khảo sát ở nhiệt độ sấy cao hơn và thử hoạt tính.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của các loại bao bì chứa chế phẩm sau khi sấy và nhiệt độ bảo quản chế phẩm.
- Xác định hàm lượng enzyme có trong chế phẩm sau khi sấy.
- Nghiên cứu khả năng phát triển của nấm mốc và hoạt lực enzyme amylase trong chế phẩm sau khi sấy.
- Nghiên cứu thử nghiệm chế phẩm khô thu được trong sản xuất rượu nếp than và so sánh với rượu nếp than được làm từ các nguồn enzyme thương mại.
Qui trình sản xuất đề nghị
Hình 17: Qui trình chế biến koji nếp than đề xuất
Giống (0.2%) Làm nguội Nguyên liệu Ngâm (1giờ) Nấu Phối trộn Nuôi cấy
(300C, 60% ẩm, thời gian nuôi:2 ngày)
Sấy (500C, 16 – 18h) Điều chỉnh ẩm (60%)
Thanh trùng (1210C, 15 phút))
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
Nguyễn Đức Lượng,2004, Công nghệ enzyme, NXB Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh. Nguyễn Đức Lượng, 2004, Thí nghiệm công nghệ sinh học tập 2, Thí nghiệm vi sinh vật học, đại học Quốc gia Tp.HCM, NXB Đại học Quốc Gia Tp.HCM.
Đặng Thị Thu, 2004, Thí nghiệm vi sinh vật học, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.
Nguyễn Văn May, 2002, Kỹ thuật sấy nông sản thực phẩm, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. Nguyễn Văn Lụa, Kỹ thuật sấy vật liệu, trường Đại học Bách Khoa Tp.HCM.
Hoàng Văn Chước, 2004, Kỹ thuật sấy, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.
Nguyễn Đình Thưởng, Nguyền Thanh Hằng, 2005, Công nghệ sản xuất và kiểm tra cồn etylic, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.
Nguyễn Thị Hồng Ngân, luận văn 2006, ngành Công nghệ thực phẩm, GVHD Lý Nguyễn Bình.
Tiếng Anh
Microbiology of Fermented Foods, Blackie Academic and Professional, 1998, Volume 2, Edited by Brian J.B. Wood.
Cong Ha Nguyen, Ryoji Tsurumizu, Tsutomu Sato, and Michio Takeuchi, 2005, Take – Amylase A in the Conidia of Aspergillus oryzae RIB40.
PHỤ LỤC
Xác định hoạt tính của enzyme amylase theo phương pháp so màu bằng điện quang sắc kế
Nguyên tắc:
Hoạt tính của enzyme amylase được xác định dựa trên sự giảm cường độ màu xanh từ kết quả thủy phân tinh bột của enzyme amylase với iodine làm chất chỉ thị màu. Hoá chất:
Dung dịch enzyme: Cân chế phẩm sau khi nuôi cấy, nghiền nhỏ trong cối sứ hoặc dùng máy xay sinh tố và cho vào 100ml nước cất. Tiếp đó đem đi lọc, dịch thu được được xem là dịch enzyme và dùng để xác định hoạt độ.
Dung dịch iod cơ bản: Cân 0,25g I2 và 2,5g KI hòa tan trong cốc bằng 5-10 ml nước cất. Tiếp theo cho toàn bộ vào bình định mức 100 ml rồi thêm nước cất đến ngấn bình. Dung dịch cần bảo quản trong bình nâu hoặc đặc trong bóng tối.
Dung dịch phân tích được chuẩn bị từ dung dịch iod cơ bản bằng cách hút 2 ml