Các phương pháp chiết rút và tinh sạch protein đều dựa trên những tính chất hóa lý của protein như độ tích điện, kích thước phân tử, độ hịa tan... của protein cần chiết rút. Nhiều protein còn liên kết với các phân tử sinh học khác nên việc chiết rút các protein này còn phụ thuộc vào bản chất của các liên kết.
Muốn thu nhận được các protein ngun thể tức là protein có tất cả tính chất tự nhiên đặc trưng của nó, cần sử dụng các biện pháp khác nhau.
1/Nhiệt ñộ
Để tách các protein khác nhau dựa trên kết tủa của chúng, người ta có thể sử dụng phương pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt. Một điều cần lưu ý là chỉ nên dùng đối với trường hợp các protein enzyme bền với nhiệt. Dịch protein được giữ ở 50 - 700C trong thời gian xác định, sau đó protein tạp đã bị biến tính được loại bỏ bằng cách lọc hoặc ly tâm. Như vậy, dịch chiết protein thơ bền với nhiệt có thể được thu nhận bằng cách cho kết tủa không thuận nghịch phần lớn các protein tạp.
Để thu nhận chế phẩm protein theo phương pháp kết tủa thuận nghịch bằng các muối trung tính, cần tiến hành ở nhiệt độ thấp, đối với dung môi hữu cơ cần tiến hành ở nhiệt độ dưới 0oC tránh biến tính đặc biệt là protein enzyme.
2/pH
Protein là các chất lưỡng tính, vì vậy, trong các dung dịch acid và kiềm chúng sẽ bị phân ly:
Do các acid amin trong chuỗi polypeptide cịn tồn tại nhiều nhóm chức tự do dưới dạng các ion hóa là ngun nhân tạo ra tính đa điện của protein. Phân tử protein rất dài nên nhóm ion tự do tận cùng của chuỗi polypeptide khơng đáng kể, chủ yếu các nhóm chức tự do khác của chuỗi bên (R) quyết định tính chất tích điện của phân tử protein (nhóm cacboxyl của amino acid, OH của Tyrosine, ε-NH2 của lysine, guamidin của Arginine, inidazol của histidine).
Mức độ ion hóa của các nhóm này phụ thuộc vào giá trị pH. Các nhóm acid ở dạng anion trong mơi trường kiềm, các nhóm kiềm tồn tại ở dạng cation trong mơi trường acid.
Như vậy, ở một giá trị pH xác định, mỗi phân tử protein có một điện tích tổng số nào đấy mà độ lớn của nó phụ thuộc vào số lượng các nhóm tích điện dương và tích điện âm. Kết quả là ở giá trị nồng độ ion H+ cố định, các protein khác nhau trong hỗn hợp sẽ có tổng điện tích khác nhau. Nhiều phương pháp dùng để tách các hỗn hợp protein đều dựa vào đặc tính này. Các phân tử protein mang điện tích tổng số (dương hoặc âm) cùng dấu đẩy nhau ra xa nên dễ tan vào dung dịch. Mỗi một protein có một giá trị pH nhất định mà ở đó tổng số điện tích âm và điện tích dương trong phân tử bằng khơng. Giá trị đó gọi là điểm đẳng điện của protein. Điểm đẳng điện của các acid amin trung tính có giá trị pH từ 5,6 - 7,0; đối với các acid amin có tính acid (dicarboxylic) là từ 3,0 - 3,2; đối với các acid amin có tính kiềm (diamino) là từ 9,7 - 10,8. Ở điểm đẳng điện, độ hòa tan của protein là thấp nhất, protein dễ bị kết tủa. Dựa vào tính chất này, người ta có thể tách từng phần các protein enzyme trong hỗn hợp.
Cũng giống như trường hợp tác dụng của nhiệt độ trong việc tách chiết protein, có thể dùng phương pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụng của pH của môi trường. Dịch protein được giữ ở
pH ≤ 5 trong thời gian xác định. Protein tạp bị biến tính cũng được loại bỏ bằng cách lọc hoặc ly tâm.
3/Tác nhân hóa học
Có thể dùng muối trung tính hoặc các dung mơi hữu cơ để tách chiết các protein. Phương pháp này được tiến hành dựa trên cơ sở: độ hòa tan của protein phụ thuộc vào sự tương tác của các nhóm tích điện trong phân tử protein với các phân tử nước. Sự tương tác đó (cịn gọi là sự hydrate hóa) sẽ bị giảm xuống khi thêm vào dung dịch protein các dung môi hữu cơ hoặc các muối trung tính. Dung mơi hữu cơ thường dùng là etanol, isopropanol, acetone hoặc hỗn hợp các loại rượu.
Khi sử dụng các dung môi hữu cơ, cần chú ý tiến hành ở nhiệt độ thấp (từ 5oC trở xuống). Dùng dung mơi hữu cơ có thể tiến hành tách phân đoạn dưới 0oC và có thể đến -20oC, như vậy có tác dụng tốt đến độ ổn định của protein.
Khi đã có kết tủa, chú ý lấy nhanh kết tủa ra khỏi dung môi bằng cách dùng máy ly tâm lạnh. Các muối trung tính có thể dùng là (NH4)2SO4, Na2SO4, MgSO4... Tuy nhiên, người ta đã nhận thấy muối (NH4)2SO4 là tốt nhất vì nó khơng làm hại mà làm ổn định (làm bền) hầu hết các loại protein. Loại muối này lại rẻ tiền và phổ biến. Độ hịa tan của nó lại rất lớn (bão hịa 767g/l ở 25oC)
Ngoài ra, nồng độ (NH4)2SO4 cần thiết để kết tủa protein khác nhau thì khác nhau nhiều.
Ví dụ: Protease của nấm mốc dễ bị kết tủa ở 70% của (NH4)2SO4 bão hịa hồn tồn, cịn amilase của mầm lúa bị kết tủa ở 50% độ bão hịa của dung dịch muối này. Điều đó nói lên tính kết tủa lựa chọn của (NH4)2SO4 cao hơn các muối khác.
Có thể dùng (NH4)2SO4 ở cả 2 dạng: dạng bột và dạng dung dịch bão hòa. Khi dùng bột, người ta cho từng ít một vào dịch chiết protein. Cách cho cũng ảnh hưởng lớn đến lượng kết tủa ban đầu của protein enzyme. Khi cho muối vào dịch chiết cần phải có máy khuấy từ để đảm bảo sự hòa tan của muối.
Khái niệm về số phần trăm của độ bảo hịa hồn tồn đã được đề cập đến. Protein có thể bị kết tủa ở 50% (0,5) hoặc 70% (0,7) của độ bão hịa hồn tồn của (NH4)2SO4 . Khi cho dung dịch (NH4)2SO4 bão hịa vào dịch chiết protein thì nồng độ (NH4)2SO4 khơng tăng đột ngột. Sau khi kết tủa xong người ta thường để lắng khoảng 2 giờ hoặc qua đêm, mục đích là tạo kết tủa hoàn toàn. Kết tủa được lấy ra bằng cách ly tâm hoặc lọc. Khi hòa tan kết tủa lại người ta thường thêm ion Ca2+ để làm bền protein (dùng CaCl2 hoặc Ca(CH3COO)2).