Chƣơng 3 KẾT QUẢ NGHIấN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.2. Nghiờn cứu xỏc định vai trũ của vi khuẩn E.coli và C perfringens
3.2.4. Kết quả giỏm định đặc tớnh sinh hoỏ của cỏc chủng vi khuẩn E.col
được cỏc loại vi khuẩn khỏc như: Salmonella, Clostridium và một số vi khuẩn đường ruột khỏc là rất thấp trong cỏc mẫu được kiểm tra.
3.2.4. Kết quả giỏm định đặc tớnh sinh hoỏ của cỏc chủng vi khuẩn phõn phõn
lập đƣợc
Mỗi loại vi khuẩn cú một số đặc tớnh sinh học riờng biệt như: tớnh chất mọc của vi khuẩn trờn cỏc mụi trường nuụi cấy thụng thường và mụi trường đặc hiệu, chuyển hoỏ cỏc loại đường và sinh sản cỏc hợp chất sinh học trung gian trong mụi trường nuụi cấy. Do đú sau khi đó tiến hành giỏm định cỏc đặc điểm về hỡnh thỏi và nuụ i cấy trờn mụ i trường nước thịt, thạch thường, macconkey, thạch mỏu, Endo của cỏc chủng vi khuẩn phõn lập nhằm phõn loại và xỏc định đỳng loài, trờn cơ sở đú cú những nghiờn cứu tiếp theo.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi
Nguyờn tth p ://ww w .l r c - t nu . e d u . v n
Bảng 39: Kết quả giỏm định đặc tớnh sinh húa của cỏc chủng vi khuẩn
E. coli và C. perfringens phõn lập đƣợc Kết quả E. coli (n=30) Cl. perfringens (n=15) Số chủng dƣơng tớnh/Tổng số chủng kiểm tra Tỷ lệ % Số chủng dƣơng tớnh/Tổng số chủng kiểm tra Tỷ lệ % 1 Indol 30/30 100.0 0/15 0 2 MR 30/30 100.0 - - 3 VP 0/30 0 - - 4 Citrat 0/30 0 - - 5 Inositol 0/30 0 - - 6 Lactose 30/30 100.0 12/15 80.0 7 Maltose 30/30 100.0 13/15 86.7 8 Mannitol 30/30 100.0 - - 9 Mannose 30/30 100.0 - - 10 Sorbitol 30/30 100.0 - - 11 Xylose 30/30 100.0 - - 12 Glucose 30/30 100.0 14/15 93.3 13 Sucrose 22/30 73.3 15/15 100.0
Ghi chỳ: - : Khụng kiểm tra
Kết quả của bảng 3.9 cho thấy:
+ Tất cả cỏc chủng E. coli phõn lập được (100%) đều cú khả năng gõy dung huyết trờn mụi trường thạch cú bổ sung 5% mỏu cừu. 100% cỏc chủng
E. coli được kiểm tra cho phản ứng sinh Indol và MR dương tớnh, cũn cỏc phản
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi
Nguyờn tth p ://ww w .l r c - t nu . e d u . v n
ứng VP và Citrat thỡ đều cho kết quả õm tớnh. Tỷ lệ cỏc chủng lờn men đường Lactose, Maltose, Mannitol, Mannose, Sorbitol, Xylose là 100%. Riờng với đường sucrose tỷ lệ lờn men 73,3%, cũn đường inositol thỡ cho kết quả õm tớnh.
+ Tất cả cỏc chủng C. perfringens được kiểm tra đều cú phản ứng Indol õm tớnh. Tỷ lệ cỏc chủng vi khuẩn lờn men đ ường sucrose là 100%, cũn với
cỏc loại đường Lactose, Maltose, Glucose thỡ tỷ lệ lờn men lần lượt là
80,0%, 86,7% và 93,3%.
So sỏnh kết quả giỏm định đặc tớnh sinh hoỏ của 30 chủng vi khuẩn
E. coli và 15 chủng C. perfringens phõn lập được với bảng sinh hoỏ chuẩn của cỏc loại vi khuẩn này thỡ thấy cỏc chủng vi khuẩn phõn lập được từ lợn tiờu chảy tại Hưng Yờn đều cú cỏc đặc điểm chung, rất điển hỡnh của vi khuẩn E. coli hoặc C. perfringens như đó được cỏc tài liệu trong và ngoài nước mụ tả.
3.2.5. Kết quả xỏc định serotyp khỏng nguyờn O của cỏc chủng E. coli
phõn lập đƣợc
Serotyp O của 30 chủng vi khuẩn E. coli đó được xỏc định bằng phản ứng ngưng kết nhanh trờn phiến kớnh. Kết quả được trỡnh bày ở bảng 3.10.
Bảng 3.10: Kết quả xỏc định serotyp khỏng nguyờn O của cỏc chủng vi khuẩn E. coli phõn lập đƣợc từ lợn bệnh TT Serotyp O Kết quả (n=30) Số chủng dƣơng tớnh Tỷ lệ (%) 1 O8 3 10,0 2 O101 4 13,3 3 O138 3 10,0
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn tth p ://ww w .l r c - t nu . e d u . v n 4 O139 4 13,3 5 O141 4 13,3 6 O149 12 40,0 Tổng số 30 100
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi
Nguyờn tth p ://ww w .l r c - t nu . e d u . v n
Kết quả ở bảng 3.10 cho thấy tất cả 30 chủng vi khuẩn E. coli được kiểm tra đều cho phản ứng dương tớnh với 1 trong 6 serotyp khỏng huyết thanh O. Trong đú, số chủng thuộc serotyp O149 là 12 chủng, chiếm tỷ lệ cao nhất là 40, 0%; số chủng thuộc cỏc serotyp O141, O101 và O139 là bằng nhau, 4 chủng, chiếm tỷ lệ 13,3%. Serotyp O8 và O138 cú tỷ lệ thấp nhất, chỉ chiếm 10,0%.
Theo tỏc giả Nguyễn Thị Nội (1985)[28] cỏc chủng E. coli phõn lập được từ lợn con chủ yếu thuộc cỏc serotyp O149: K88; O147: K88; O141: K88. Theo Lờ Văn Tạo và cs (1993)[46], từ 50 chủng E. coli phõn lập từ lợn con theo mẹ thỡ 15 chủng mang khỏng nguyờn bỏm dớnh K88 chủ yếu thuộc cỏc serotyp: O141, O1, O149, O86, O111, O55, O26.
Theo Bertschinger và cs (1992)[66] nghiờn cứu ở Thụy Điển thỡ thấy đa số cỏc chủng E. coli phõn lập được thuộc serotyp O139 (25/32), ngoài ra cũn cú cỏc serotyp O141, O149, O138.
Theo Fairbrother, J, M (1992) [74], cỏc seroyp O138, O139, O141 và O149 thuộc nhúm vi khuẩn ETEC và VTEC là cỏc nhúm thường hay gặp nhất gõy tiờu chảy cho lợn con sau cai sữa.
Tỏc giả Vũ Khắc Hựng và cs (2004) [20] khi xỏc định serotyp khỏng nguyờn O của cỏc chủng E. coli phõn lập từ lợn con bị tiờu chảy ở Cộng hoà Slovakia lại thấy rằng: Serotyp O149 chiếm tỷ lệ cao nhất (77%) trong tổng số
220 chủng vi khuẩn được kiểm tra, serotyp O141 cú tỷ lệ thấp hơn 4,5%. Cỏc serotyp O2, O15, O101 và O157 cú cựng tỷ lệ là 1,8%, cũn lại cỏc serotyp O8, O54, O84, O147 chiếm cỏc tỷ lệ tương ứng là 6,3%; 2,2%; 2,7%; 2,2%.
Cũng xỏc đ ịnh serotyp khỏng nguyờn O của cỏc chủng E. coli phõn lập được ở lợn sau cai sữa ở những địa điểm lấy mẫu khỏc là khu vực đồng
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi
Nguyờn tth p ://ww w .l r c - t nu . e d u . v n
bằng sụng Cửu Long, Nguyễn Khả Ngự (2000) [32] cho biết, trong số 11 serotyp
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi
Nguyờn tth p ://ww w .l r c - t nu . e d u . v n
được xỏc định, O26 chiếm tỷ lệ cao nhất 27,8%, tiếp theo là O139 chiếm tỷ lệ
13,9%, cỏc serotyp O127, O111, O124, O125, O126, O86, O149 đều chiếm tỷ lệ 8,3%, cũn serotyp O55, O128 chỉ chiếm tỷ lệ 2,8%. Kết quả của tỏc giả Nguyễn Khả Ngự ớt nhiều cú sự sai khỏc với cỏc kết quả của nghiờn cứu này, vỡ cỏc mẫu được điều tra trong nghiờn cứu của Nguyễn Khả Ngự cú nguồn gốc là lợn mắc bệnh phự đầu, cũn trong nghiờn cứu này là mẫu được lấy từ cỏc lợn sau cai sữa bị mắc bệnh tiờu chảy.
Ở tỉnh Tiền G iang, cỏc tỏc giả Bựi Trung Trực và cs (2004) [60] lại thấy cỏc serotyp O8, O64, O142, O138 và O139 là phổ biến, trong đú O139 chiếm tỷ lệ cao nhất. Tỏc giả cũng đó suy luận là đàn lợn của tỉnh T iền Giang cú nguy cơ mắc bệnh phự đầu.
Kết quả của chỳng tụi cú sự khỏc biệt so với cỏc nghiờn cứu trờn, nhưng hầu hết cỏc nghiờn cứu đều chỉ ra rằng serotyp khỏng nguyờn O149 chiếm tỷ lệ cao và là một serotyp chớnh gõy bệnh cho lợn.
3.2.6. Kết quả xỏc định cỏc yếu tố gõy bệnh của cỏc chủng vi khuẩn E.
coli
Để gõy bệnh cho lợn vi khuẩn E. coli thuộc nhúm ETEC phải bỏm dớnh được vào tế bào nhung mao ruột non của lợn, từ đú xõm nhập vào tế bào biểu mụ, ở đõy vi khuẩn sản sinh độc tố đường ruột. vỡ vậy yếu tố bỏm dớnh cú vai trũ quan trọng đối với quỏ trỡnh gõy bệnh của vi khuẩn E. coli.
Fairbrother. J.M (1992)[74] coi yếu tố bỏm dớnh là yếu tố quan trọng chỉ sau enterotoxin trong việc xỏc định vai trũ gõy bệnh của cỏc chủng vi khuẩn E. coli .
Cỏc yếu tố bỏm dớnh F4, F5, F6, F18, F41, độc tố chịu nhiệt STa, STb, độc tố khụng chịu nhiệt LT và độc tố verotoxin VT2e đó được xỏc định trong số 30 chủng E. coli phõn lập được bằng phản ứng PCR. Kết quả được trỡnh
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi
Nguyờn tth p ://ww w .l r c - t nu . e d u . v n
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi
Nguyờn tth p ://ww w .l r c - t nu . e d u . v n
Bảng 3.11: Tỷ lệ cỏc chủng vi khuẩn E. coli mang cỏc yếu tố gõy bệnh
C ỏ c y ế u t ố g õ y b ệ n h
Số chủng mang cỏc yếu tố gõy bệnh (n=30) Số chủng dƣơng tớnh Tỷ lệ (%) F4 12 40,0 F5 0 0 F6 0 0 F18 9 30,0 F41 0 0 STa 11 36,7 STb 15 50,0 LT 7 23,3 VT2e 12 40,0
Trong 5 loại khỏng nguyờn bỏm dớnh, cú 12 chủng mang yếu tố gõy bệnh là F4, chiếm tỷ lệ 40, 0% và 9 chủng mang F18, chiếm tỷ lệ (30,0%).
- Trong cỏc loại độc tố, số chủng mang độc tố STb chiếm tỷ lệ cao nhất (50, 0%), tiếp theo là độc tố VT2e (40,0%), STa (36, 7%), và thấp nhất là LT (23,3%).
Cự Hữu Phỳ và cs (2003)[40] khi nghiờn cứu trờn 84 chủng E. coli cú 38/84 chủng, chiếm 42,5% mang khỏng nguyờn F4 và 14/84 chủng, chiếm
16,7% mang khỏng nguyờn F5 và khụng cú chủng nào mang khỏng nguyờn F6 (987P) và F41. Trong số 3 loại độc tố đường ruột là STa và STb và LT thỡ số chủng cú khả năng sản sinh STb chiếm tỷ lệ cao nhất (70/84chủng), sau đú đến STa (57/84 chủng) và LT (40/84 chủng).
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi
Nguyờn tth p ://ww w .l r c - t nu . e d u . v n
Kết quả xỏc định khả năng bỏm dớnh của vi khuẩn E. coli của chỳng tụi thấp hơn nhiều so với kết quả nghiờn cứu của Do và cs (2006) [71] Khi tiến hành một nghiờn cứu với 85 chủng vi khuẩn E. coli thu thập được từ một số tỉnh của miền Bắc đó kết luận: cú 94,1% số chủng mang khỏng nguyờn bỏm dớnh (F4 hoặc F18) và 5,9% số chủng khụng mang khỏng nguyờn bỏm dớnh. Hiện tượng này xảy ra tại Hưng Yờn cú thể được giải thớch là do lấy mẫu ở cỏc địa phương khỏc nhau, thời gian địa điểm lấy mẫu khỏc nhau do việc sử dụng vaccin của cỏc địa phương khỏc nhau dẫn tới tỷ lệ cỏc chủng mang cỏc loại khỏng nguyờn bỏm dớnh cũng khỏc nhau.
3.2.7. Kế t quả k iể m tra độc lực c ủa mộ t số c hủng vi k huẩ n E . coli và
C. perfringens phõn lập đƣợc trờn động vật thớ nghiệm
Từ cỏc kết quả nghiờn cứu về nuụ i cấy, giỏm định đặc tớnh sinh vật học hoỏ học, xỏc định một số yếu tố gõy bệnh của cỏc chủng vi khuẩn E. coli và C. perfringens phõn lập được từ lợn con mắc bệnh phõn trắng ở lứa tuổ i 1- 60 ngày tuổ i tại Hưng Yờn, chỳng tụ i đó chọn 5 chủng E. coli đại diện cho cỏc serotyp và cỏc yếu tố gõy bệnh và 5 chủng C. perfringens để tiến hành kiểm tra độc lực trờn chuột bạch. Kết quả được trỡnh bày ở bảng 3.12.
- 7
6-
Bảng 3.12: Kết quả xỏc định độc lực trờn chuột bạch của một số chủng E. coli và C.
perfringens phõn lập đƣợc từ lợn bệnh TT Loại vi Ký hiệu chủng vi Số chuột tiờm Liều tiờm và đƣờng
Số chuột chết theo thời gian (con) < 12 giờ > 12 - 24 giờ > 24 - 36 giờ > 36 - 48 giờ > 48 giờ 1 E-HY5 2 0.2 ml 2 100 2 E-HY7 2 1 50 3 E-HY12 2 2 100 4 E-HY19 2 2 100 5 E-HY23 2 2 100 11 C-HY5 2 0.2ml dịch ly tõm từ 2 100 12 C-HY7 2 2 100 13 C-HY9 2 2 100 14 C-HY11 2 2 100 15 C-HY15 2 2 100
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi
Nguyờn tth p ://ww w .l r c - t nu . e d u . v n
Kết quả bảng 3.12 cho thấy:
+ Đối với vi khuẩn E. coli: Trong số 5 chủng vi khuẩn E. coli được kiểm tra, cú 4 chủng giết chết 100% số chuột được tiờm trong thời gian từ 12
- 48 giờ, chỉ cú chủng E-HY7 chỉ gõy chết 50% số chuột được tiờm trong thời gian 12 - 24 giờ, chứng tỏ cỏc chủng vi khuẩn E. coli được kiểm tra cú độc lực cao.
+ Đối với vi khuẩn C. perfringens: Cả 5 chủng vi khuẩn C. perfingens
đều gõy chết 100% số chuột được tiờm. Riờng chủng C-HY7 cú thời gian gõy chuột chết sớm nhất là 12 giờ sau khi tiờm, cũn chủng C-HY5 cú thời gian gõy chết chuột muộn nhất là từ 36 - 48 giờ.
Cỏc chuột chết đều cú bụng chướng to. Khi mổ khỏm cú cỏc bệnh tớch như phổi viờm, xuất huyết trờn bề mặt gan, lỏch sưng to, ruột xuất huyết, tim nhóo. Lấy mỏu tim, ria cấy trờn đĩa thạch mỏu, thạch Macconkey hoặc mụi trường yếm khớ thỡ đều phõn lập lại được vi khuẩn thuần khiết từ mỏu tim.
Tỏc giả Trương Quang (2005) [42] khi tiến hành kiểm tra độc lực của 30 chủng E. coli phõn lập được từ phõn của lợn từ 1 đến 60 ngày tuổi bị tiờu chảy cho kết quả: 27 chủng E. coli (chiếm 90%) giết chết 100% số chuột thớ nghiệm và 3 chủng giết chết 50% số chuột thớ nghiệm sau thời gian từ 24-72 giờ.
Kết quả nghiờn cứu của chỳng tụ i phự hợp với c ỏc tỏc giả Hồ Soỏi và Đinh Thị Bớch Lõn (2005) [44] cũng đó thụng bỏo cỏc kết quả tương tự khi kiểm tra độc lực với 5 chủng E. coli phõn lập từ phõn của lợn bị tiờu chảy, cú
4 chủng giết chết 100% và 1 chủng giết chết 50% số chuột được tiờm. Cỏc tỏc giả khỏc như: Nguyễn Thị Kim Lan (2004) [21], Bựi Trung Trực và cộng sự (2004) [62] cũng cú kết quả thử độc lực của vi khuẩn E. coli gõy chết 100% chuột thớ nghiệm.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi
Nguyờn tth p ://ww w .l r c - t nu . e d u . v n
Với nghiờn cứu của Trần Thị Hạnh và cs (2000)[16] cũng cho thấy cỏc chủng vi khuẩn C. perfingens phõn lập được ở lợn con tiờu chảy cú độc lực mạnh, hầu hết cỏc chủng vi khuẩn gõy chết chuột trong vũng 24 giờ.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi
Nguyờn tth p ://ww w .l r c - t nu . e d u . v n
Kết quả xỏc định độc lực của cỏc chủng vi khuẩn E. coli và C. perfringens trờn chuột bạch đó cho thấy: cỏc chủng vi khuẩn phõn lập được
từ lợn mắc tiờu chảy tại Hưng Yờn cú độc lực khỏ mạnh và là cỏc nguyờn nhõn quan trọng trong hội chứng tiờu chảy của lợn từ sơ sinh đến 60 ngày tuổ i tại tỉnh Hưng Yờn.
3.2.8. Kết quả xỏc định khả năng mẫn cảm với khỏng sinh của cỏc chủng vi khuẩn phõn lập đƣợc
Trong những năm gần đõy, hiện tượng khỏng khỏng sinh của cỏc chủng vi khuẩn đường ruột ngày càng tăng. Đõy cũng chớnh là lý do giải thớch cho việc tại sao kết quả đ iều trị bằng khỏng s inh đối với tiờu chảy trong thời gian gần đõy mang lại hiệu quả khụng cao.
Vỡ vậy, để lựa chọn loại khỏng sinh phự hợp giỳp cho việc đ iều trị bệnh tiờu chảy do E. coli và C. perfringens gõy ra cho lợn trờn đ ịa bàn tỉ nh Hưng Yờn cú kết quả tốt, chỳng tụ i đó tiến hành kiểm tra khả năng mẫn cảm với khỏng s inh đối với 30 chủng vi khuẩn E. coli và 15 chủng vi khuẩn C. perfringens với 13 loại khỏng sinh khỏc nhau. Kết quả được trỡnh bày ở bảng 3.13.
- 7
9 -
Bảng 3.13: Kết quả xỏc định khả năng mẫn cảm của khỏng sinh với 1 số chủng vi khuẩn E. coli và C.
perfringens phõn lập đƣợc từ lợn bệnh E. coli (n=30) C. perfringens. (n=15) Mẫn cảm Khỏng Mẫn cảm Khỏng Số chủng Tỷ lệ (%) Số chủng Tỷ lệ (%) Số chủng Tỷ lệ (%) Số chủng Tỷ lệ(%) 1 Tetracyclin (30 àg) 0 0 30 100 7 46,7 8 53,3 2 Sulfamethoxazo le/ Trimethoprim (25 àg) 2 6,7 28 93,3 2 13,3 13 86,7 3 Enrofloxacin (5 àg) 25 70,0 5 30,3 2 13,3 13 86,7 4 Gentamic in (10 àg) 22 73,3 8 26,7 10 66,7 7 46,6 5 Amp icillin (10 àg) 25 83,3 5 16,7 5 33,3 10 66,6 6 Cephalothin (30 àg) 28 93,3 2 6,7 8 53,3 7 46,7 7 Amikacin (30 àg) 30 100 0 0 2 13,3 13 86,7 8 Apramyc in (15 àg) 20 66,7 10 33,3 0 0 15 100 9 Ceftiofur (30 àg) 30 100 0 0 2 13,3 13 86,7 10 Neomycin (30 àg) 7 23,3 23 76,7 0 0 15 100 11 Spectinomyc in (109 àg) 1 3,3 29 96,7 0 0 15 100 12 Streptomycin (10 àg) 9 30,0 21 70,0 0 0 15 100 13 Lincomycin (15 àg) 20 66,7 10 33,3 11 73,3 4 26,7
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi
Nguyờn tth p ://ww w .l r c - t nu . e d u . v n