Dụng cụ và thiết bị - ỤC LỤC - Phân lập và định da- 123docz.net

M ỤC LỤC

3.1.4. Dụng cụ và thiết bị

đĩa petri. Tủủ.

Nồi thanh trùng. Lame, lamellae. Becher. Tủ sấy.

Que cấy móc. Kắnh hiển vi có thước trắc vi.

đèn cồn. Nút bông. 3.1.5. Hóa chất Glucose Agar-Agar Cồn 700 và 960 Nước cất NaOH 1N HCl 1N 3.1.6. Các loại môi trường

Môi trường Czapek. Môi trường PGA.

Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường đại Học Cần Thơ

Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 17

3.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

- Nuôi cấy mẫu trên môi trường PGA.

- Quan sát khuẩn lạc nấm mốc phát triển trên môi trường nuôi cấy, tách ròng loài nấm mốc nghi ngờ là Aspergillus bằng phương pháp cấy chuyền liên tục.

- Tiến hành phân lập trên môi trường Czapek.

- Thực hiện tiêu bản nấm mốc quan sát dưới kắnh hiển vi.

3.3. NỘI DUNG VÀ TIẾN TRÌNH THÍ NGHIỆM

3.3.1. Phân lập nấm mốc Aspergillus

Nhằm xác ựịnh các loài Aspergillus hiện diện trên ựậu phộng, tách riêng các loài nấm mốc từ quần thể ban ựầu và ựưa về dạng thuần chủng, tạo ựiều kiện thuận lợi cho quá trình quan sát hình thái sợi nấm, nhờựó việc ựịnh tên chúng sẽ chắnh xác hơn.

3.3.2. Tiến hành thắ nghiệm

a. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy

Môi trường PGA và Czapek ựược chuẩn bị, thanh trùng ựổ vào các ựĩa petri ựểựặc tự

nhiên trên mặt phẳng ngang.

b. Chuẩn bị mẫu

Thắ nghiệm ựược thực hiện với hai mẫu hạt khác nhau:

- Mẫu 1: Hạt ựậu phộng ựược rửa sạch bằng nước cất vô trùng ựể xác ựịnh những loài nấm mốc có trong bản thân hạt.

- Mẫu 2: Hạt ựậu phộng không ựược rửa, dùng xác ựịnh những loài nấm mốc bám lên hạt trong quá trình vận chuyển.

c. Phân lập nấm mốc

- Cho một vài hạt ựậu phộng còn nguyên vào ựĩa petri chứa sẵn môi trường PGA. - Cho ựĩa vào tủủở nhiệt ựộ phòng.

- Tiến hành quan sát sự phát triển của nấm mốc hàng ngày. Sau khoảng thời gian nuôi cấy từ 5-7 ngày, dùng que cấy vắt lấy một ắt bào tử nấm mốc nghi ngờ là

Aspergillus (dựa trên hình thái và màu sắc bào tử nấm mốc) cấy lên môi trường PGA trong ựĩa petri.

- Tiến hành ủở nhiệt ựộ phòng, và quan sát sự phát triển của nấm mốc hàng ngày. - Thao tác cấy truyền ựược thực hiện nhiều lần cho ựến khi mẫu hoàn toàn thuần

d. định danh

Tiến hành nhận xét ựại thể và vi thể nấm mốc

- đại thể: quan sát ựặc ựiểm hình thái sợi nấm bằng mắt thường.

- Vi thể: thực hiện tiêu bản nấm mốc, quan sát ở vật kắnh 40X cấu tạo khuẩn ty và bào tử của nó.

Dựa trên kết quả thu nhận ựược tra khóa phân loại, xác ựịnh tên loài nấm mốc tương

Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường đại Học Cần Thơ

Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 19

CHƯƠNG IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Sau quá trình tiến hành thắ nghiệm, chúng tôi quan sát thấy trên hạt ựậu phộng xuất hiện thường xuyên một số loài nấm mốc (ựược phân biệt chủ yếu dựa trên màu sắc) như sau:

- Nấm có hệ sợi bao phủ như mạng lưới, phát triển nhanh, bao trùm lên khắp ựĩa với

ựầu là những chấm màu ựen.

- Nấm có màu trắng, bề mặt li ti như bụi, không có hệ sợi khắ sinh. - Nấm có màu vàng nâu.

- Nấm có màu ựen. - Nấm có màu nâu.

- Nấm có màu xanh xám, bề mặt li ti như bụi, không có hệ sợi khắ sinh. - Nấm có màu vàng tươi, bề mặt li ti như bụi, không có hệ sợi khắ sinh. - Nấm có màu xanh lục.

- Các loài men dại.

Sau quá trình phân lập và ựịnh danh, chúng tôi xác ựịnh ựược bốn loài Aspergillus sau: - Aspergillus flavus

- Aspergillus oryzae

- Aspergillus niger

- Aspergillus ficuum

Hình 2. Mẫu hạt ựậu phộng có nấm mốc phát triển trên môi trường nuôi cấy PGA sau 3 - 5 ngày, nhiệt ựộ 27 - 320C .

a) b)

b) Mẫu hạt có rửa a) Mẫu hạt không rửa

4.1. Aspergillus flavus

TÊN: Aspergillus flavus

Xuất xứ: Hạt ựậu phộng chợ Xuân Khánh Nhiệt ựộ: 27- 320C Ánh sáng: thường Môi trường : Czapek

Tuổi nấm khi phân loại: 7 ngày

Khuẩn lạc:

Tốc ựộ mọc: Trung bình Kắch thước: 5 - 5.5 cm Dạng khuẩn lạc: Dạng bột rời.

Giọt tiết: Xung quanh rìa khuẩn lạc có giọt tiết màu trắng ựục và màu ựen, trong. Chúng ựược tiết ra sau 4 - 5 ngày nuôi cấy, bề trái các giọt tiết có màu ựen.

Màu sắc: Mặt phải: Ban ựầu khuẩn lạc có màu vàng nhạt sau chuyển sang màu xanh lục Mặt trái: Không màu

Sắc tố ra môi trường: Không

Giai ựoạn vô tắnh:

đầu: Cách sắp xếp: Mọc từ môi trường.

Hình dạng: Hình cầu, toả tia khi non và tạo thành các cột với những chuỗi bào tử rất dài khi già.

Kắch thước: (50 - 200) ộm.

Cuống: Hình dạng: Bề mặt cuống ráp, có nhiều gai mịn, ựều. Kắch thước: (380 - 800) x (12 - 18) ộm.

Màu sắc: Không màu.

Bọng: Hình dạng: Hình cầu ựến gần cầu. Kắch thước: (35 - 50) ộm. Vùng sinh sản: Khắp mặt bọng. Thể bình: Cách sắp xếp: Thể bình hai tầng và một tầng. Có cả hai loại thể bình trên cùng một bông. Lớp 1: Hình dạng: Kắch thước: Hình trụ. (10 - 20) x (3,75 - 5) ộm. Lớp 2: Hình dạng: Kắch thước: Hình chai. (5 - 7,5) x (3,75 - 5) ộm. Hình dạng: Bào tử: Kắch thước Hình cầu, bề mặt có vẻ trơn nhẵn. (3 - 5) ộm

Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường đại Học Cần Thơ

Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 21

Hình 3. Aspergillus flavus với những giọt tiết có màu trắng ựục xung quanh rìa khuẩn lạc sau 4 Ờ5 ngày nuôi cấy trên môi trường Czapek.

Hình 7. Các bào tử kết lại thành chuỗi rất dài Hình 6. Cấu tạo một bọng có hình gần cầu.

Hình 4. Aspergillus flavus có bông hình

Nguồn: Hình ảnh ựược chụp ởựiều kiện bình thường và ở vật kắnh 40X và 10X tại phòng thắ nghiệm bộ môn CNTP và bộ môn Bảo Vệ Thực Vật

Hình 8. Bào tử của A. flavus Hình 9. Cấu tạo một thể bình hai tầng với cuống

Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường đại Học Cần Thơ

Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 23

4.2. Aspergillus niger

TÊN: Aspergillus niger

Xuất xứ: Hạt ựậu phộng chợ Xuân Khánh Nhiệt ựộ: 27 - 320C Ánh sáng: thường Môi trường : Czapek

Tuổi nấm khi phân loại: 7 ngày

Khuẩn lạc:

Tốc ựộ mọc: Trung bình Kắch thước: 4,4 - 5,8 cm

Dạng khuẩn lạc: Dạng bột rời lấm tấm, tâm khuẩn lạc lồi, rìa là lớp tơ trắng. Giọt tiết: Không

Màu sắc: Mặt phải: Khuẩn lạc có màu ựen như than. Mặt trái: Không màu

Sắc tố ra môi trường: Không

Giai ựoạn vô tắnh:

đầu: Cách sắp xếp: Mọc từ môi trường.

Hình dạng: Hình cầu, toả tia khi non và xé rách tạo dạng cột khi già.

Kắch thước: (100 - 200) ộm

Cuống: Hình dạng: Bề mặt cuống nhẵn, không màu, có màu nâu gần bọng.

Kắch thước: (400 - 800) x (15 - 18) ộm

Màu sắc: Không màu

Bọng: Hình dạng: Hình cầu Kắch thước: (45 - 72) ộm Vùng sinh sản: Khắp mặt bọng Thể bình: Cách sắp xếp: Thể bình hai tầng với ựặc trưng là lớp thứ nhất dài gấp ựôi lớp thứ hai. Lớp 1: Hình dạng: Kắch thước: Hình trụ dài. (17,5 - 25) x (5 - 7,5) ộm Lớp 2: Hình dạng: Kắch thước: Hình chai. (5 - 8) x (3 - 3,75) ộm Hình dạng: Bào tử: Kắch thước Hình cầu, bề mặt có gai xù xì. (3,75 - 5) ộm

Hình 10. Aspergillus niger sau 3 ngày và sau 5 ngày nuôi cấy trên môi trường Czapek, nhiệt ựộ 27 - 320C.

Hình 11. Cấu tạo sợi nấm A. niger mang chức năng sinh sản có bông hình cầu toả tia.

Hình 12. Bông với thể bình hai tầng và bọng hình cầu.

và bọng có hình cầu.

Hình 13. Cấu tạo hiển vi một thể bình hai tầng với lớp thể bình thứ nhất dài gấp ựôi thể bình thứ hai. Lớp thứ nhất có hình trụ, lớp thứ hai có hình chai.

a) b)

a) sau 3 ngày b) sau 5 ngày

Hình 10. Aspergillus niger sau 3 ngày và sau 5 ngày nuôi cấy trên môi trường Czapek, nhiệt ựộ 27 - 320C.

Hình 11. Cấu tạo sợi nấm A. niger mang chức năng sinh sản có bông hình cầu toả tia.

Hình 12. Bông với thể bình hai tầng và bọng hình cầu.

và bọng có hình cầu.

a) b)

Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường đại Học Cần Thơ

Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 25

4.3. Aspergillus oryzae

TÊN: Aspergillus oryzae

Xuất xứ: Hạt ựậu phộng chợ Xuân Khánh Nhiệt ựộ: 27 - 320C Ánh sáng: thường Môi trường : Czapek

Tuổi nấm khi phân loại: 7 ngày

Khuẩn lạc:

Tốc ựộ mọc: Trung bình Kắch thước: 5 - 6 cm

Dạng khuẩn lạc: Dạng bột rời lấm tấm, khuẩn lạc tâm lồi, rìa thấp dần, ngoài là lớp tơ trắng. Giọt tiết: Không

Màu sắc: Mặt phải: Khuẩn lạc ban ựầu có màu vàng lục sau chuyển thành màu vàng lục nâu. Mặt trái: Không màu

Sắc tố ra môi trường: Không

Giai ựoạn vô tắnh:

đầu: Cách sắp xếp: Mọc từ môi trường.

Hình dạng: Hình cầu, toả tia khi non và xé rách thành những dãy tua rua với những chuỗi bào tử rất dài khi già.

Kắch thước: (140 - 170) ộm.

Cuống: Hình dạng: Bề mặt cuống có gai mịn. Kắch thước: (400 - 550) x (6,5 - 10) ộm.

Màu sắc: Không màu.

Bọng: Hình dạng: Hình cầu ựến gần cầu. Kắch thước: (16,25 - 25) ộm. Vùng sinh sản: Khắp mặt bọng.

Thể bình: Cách sắp xếp: Thể bình một tầng là chủ yếu. đặc biệt bông lớn hai thể bình, bông nhỏ một thể bình. đôi khi có cả hai thể

bình trên cùng một bông. Thể bình một tầng Hình dạng: Kắch thước: Hình chai. (7 - 8.75) x (3,75 - 5) ộm Hình trụ dài. (7,5 - 11) x (3,75 - 7,5) ộm Thể bình hai tầng: Lớp 1: Hình dạng: Kắch thước: Lớp 2: Hình dạng: Kắch thước: Hình chai. 12,5 x (7 - 7,5) ộm Hình dạng: Bào tử: Kắch thước:

Hình cầu, bề mặt có gai mịn, có kắch thước lớn, màu vàng nâu. Khi già gai trở nên xù xì, vách dày.

Hình 14. Aspergillus oryzae có màu vàng lục khi non và chuyển sang màu vàng lục nâu khi già

Hình 15. Aspergillus oryzae có bông hình cầu khi non và xé rách tạo hình trụ hay những chuỗi tua rua khi già.

Hình 16. Cấu tạo bông lớn với thể bình hai tầng và bọng có

hình cầu nhHình 17. Cỏ với thấểu t bình mạo bông ột

Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường đại Học Cần Thơ

Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 27

4.4. Aspergillus ficuum

TÊN: Aspergillus ficuum.

Xuất xứ: Hạt ựậu phộng chợ Xuân Khánh Nhiệt ựộ: 27 - 320C Ánh sáng: thường Môi trường : Czapek

Tuổi nấm khi phân loại: 7 ngày

Khuẩn lạc:

Tốc ựộ mọc: Nhanh. Kắch thước: 7 cm.

Dạng khuẩn lạc: Dạng mặt răng cưa, khuẩn lạc là những vòng tròn ựồng tâm thấp dần từ trong ra ngoài, rìa là lớp tơ trắng.

Giọt tiết: Không

Màu sắc: Mặt phải: Khuẩn lạc có màu nâu nhạt ựến nâu. Mặt trái: Không màu

Sắc tố ra môi trường: Không

Giai ựoạn vô tắnh:

đầu: Cách sắp xếp: Mọc từ môi trường.

Hình dạng: Hình cầu, toả tia rất ựều khi non và xé rách tạo dạng cột khi già.

Kắch thước: (150 - 200) ộm

Cuống: Hình dạng: Bề mặt cuống nhẵn, không màu, có màu nâu gần sát bọng. Cuống có ựặc trưng dài vượt trội so với những loài trên.

Kắch thước: (1200 - 1950) x (11 - 12,5) ộm

Màu sắc: Không màu, có màu nâu gần sát bọng.

Bọng: Hình dạng: Hình cầu ựến gần cầu, có kắch thước lớn. Kắch thước: (52 - 62) ộm Vùng sinh sản: Khắp mặt bọng Thể bình: Cách sắp xếp: Thể bình một tầng với ựặc trưng là kắch thước rất ngắn. Lớp 1: Hình dạng: Kắch thước: Hình trụ ngắn. (8,75 - 10) x (3,75 - 5) ộm Lớp 2: Hình dạng: Kắch thước: Hình dạng: Bào tử: Kắch thước:

Hình cầu ựến gần cầu, bề mặt có gai mịn. Màu nâu (3,75 - 4,5) ộm

Hình 20. Khi già, bông xé rách tạo dạng cột.

Hình 18. Aspergillus ficuum có màu nâu trên môi trường Czapek sau 7 ngày tuổi.

Hình 19. Aspergillus ficuum có bông hình cầu tỏa tia rất

ựều và ựặc biệt cuống khá dài.

Hình 21. Cấu tạo hiển vi một bông có bọng hình cầu và quan sát thấy rõ thể bình một lớp.

Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường đại Học Cần Thơ

Ngành Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 29

CHƯƠNG V. KẾT LUẬN VÀ đỀ NGHỊ

5.1. KẾT LUẬN

Qua kết quả nghiên cứu và theo dõi quá trình phát triển của nấm mốc ựược phân lập trên hạt ựậu phộng, chúng tôi xin rút ra những kết luận sau:

1. Các loài nấm mốc có mặt trên hạt ựậu phộng ở các sạp hàng khác nhau tương

ựối giống nhau. điều này cho thấy hệ nấm mốc tồn tại trên hạt ựậu phộng tương

ựối ổn ựịnh trong khu vực chợ Xuân Khánh, Tp Cần Thơ. Bước ựầu ựịnh danh

ựược những loài sau:

1.Aspergillus flavus. Loài này tiết ra ựộc tố aflatoxin gây ung thư cho người và gây ra những bệnh cấp tắnh khi ăn phải với số lượng lớn.

2.Aspergillus oryzae. Loài này ựược sử dụng ựể chế biến thực phẩm lên men truyền thống mà ựặc trưng là tương. đặc biệt, nó còn ựược sử dụng trong chế biến sản phẩm koji của Nhật Bản.

3. Aspergillus niger. Loài này cũng tạo ra ựộc tố mycotoxin, ngoài ra nó còn có mặt trong bánh men thuốc bắc dùng trong sản xuất rượu nếp than

4. Aspergillus ficuum.

Bốn loài này xuất hiện trên hạt ựậu phộng với tần số rất cao, trong quá trình phân lập bao giờ cũng bắt gặp sự hiện diện của chúng.

2. Hệ nấm mốc trên hạt ựậu phộng trong quá trình phân lập không thay ựổi nhiều dù có qua quá trình làm sạch bề mặt hay không làm sạch, chứng tỏ hệ nấm mốc xâm nhập vào bên trong hạt trong quá trình canh tác và vận chuyển ựến nơi tiêu thụ là như nhau.

3. Hệ vi sinh vật trên hạt ựậu phộng chủ yếu là nấm mốc và nấm men.

5.2. đỀ NGHỊ

1. Thực hiện thắ nghiệm với việc sát khuẩn hoàn toàn bề mặt mẫu hạt bằng natri hypochloride 3% hoặc với H2O2 4%, rửa lại nhiều lần bằng nước cất vô trùng ựể loại hóa chất khử trùng. Sau ựó nuôi cấy song song với mẫu hạt không ựược sát khuẩn ựể

phát hiện những loài nấm mốc nhiễm vào bên trong hạt trong quá trình canh tác và bám trên bề mặt hạt trong quá trình vận chuyển.