3.2.1 Vật liệu sinh học.
Mẫu tôm sú bị nhiễm virus đốm trắng đã được giữ lạnh ở nhiệt độ -20oC.
Tôm sú khoẻ mạnh không bị nhiễm virus đốm trắng được thu từ các ao nuôi tôm tại Cần Giờ, TP Hồ Chí Minh. Tôm có trọng lượng từ 8-12 g/con.
3.2.2 Dụng cụ và hoá chất.
3.2.2.1 Dụng cụ và hoá chất trong phòng thí nghiệm.
- Máy khuếch đại gen, bồn điện di, máy ly tâm, bàn đọc UV (White/UV transillminator), pipetman các loại, tủ đông, tủ gia nhiệt, các loại cân, tube eppendorf, kéo, kẹp,…
- Máy Realtime PCR, các bộ Kit Realtime,… - Các loại hóa chất thường dùng:
• Cồn 95% dùng cố định mẫu.
• Hóa chất dùng trong quy trình khuếch đại DNA virus như NAOH - SDS, dung dịch PCR, các primer…
• Hóa chất dùng trong phân tích mẫu nước như NaOH, KI, KMnO4, Na2S2O3, H2SO4, hồ tinh bột,…
• DMSO dùng làm dung môi hoà tan các hợp chất thử.
• Các hợp chất chiết xuất từ thảo dược: B, D2, M
3.2.2.2 Dụng cụ và hoá chất trong phòng thí nghiệm ướt.
- Bể kính bố trí thí nghiệm, máy sục khí, máy bơm nước, hệ thống lọc nước, các dụng cụ đo môi trường nước.
- Hoá chất dùng khử trùng nước trước và sau khi bố trí thí nghiệm như chlorine, thuốc tím.
3.3 Phương pháp nghiên cứu.
3.3.1 Phương pháp ly trích và thu dịch chiết virus.
Sử dụng mẫu tôm đã bị nhiễm virus đốm trắng WSSV, lấy phần mang hay chân bơi cho vào dung dịch TN 1X. Sau đó đồng nhất mẫu trong eppendorf bằng chày đã thanh trùng.
Ly tâm lạnh hỗn hợp ở 4oC, tốc độ 13000 vòng/phút/10 phút để loại bỏ phần tử lớn. Dùng pipetman hút nhẹ dịch trong và cho vào eppendorf khác. Tiếp tục huyền phù eppendorf chứa phần tử lớn trong dung dịch TN1X lần 2 và làm tương tự các thao tác trên để thu tiếp dịch trong. Hỗn hợp dịch trong của 2 lần ly trích trên được lọc qua màng lọc virus có kích thước lỗ 0,45 µm, thu nhận chất lọc và bảo quản dịch virus ở -20oC.
3.3.2 Phương pháp cảm nhiễm virus trên tôm
Dịch chiết virus và hỗn hợp dịch virus và thuốc được cảm nhiễm trên tôm sú không nhiễm bệnh đã được nuôi thuần từ 7 – 10 ngày bằng cách tiêm 0,05 ml dịch chiết virus hoặc hỗn hợp dịch virus và thuốc vào đốt cơ bụng thứ 2 hay 3.
3.3.3 Phương pháp thu mẫu.
Sau khi cảm nhiễm, theo dõi tôm dựa vào các dấu hiệu lâm sàng, tiến hành thu mẫu tôm bằng cách lấy phần mang cho vào cồn 95 % để cố định mẫu.
3.3.4 Phương pháp PCR(Polymerase Chain Reaction).
3.3.4.1 Phương pháp PCR định tính (Non – stop single tube semi – nested PCR). nested PCR).
Dùng để kiểm tra sự hiện diện của virus gây hội chứng đốm trắng trong mẫu hỗn hợp sau khi trộn chung dịch virus và hợp chất thuốc. Phương pháp này không sử dụng dung dịch NaOH - SDS để ly trích DNA như thông thường. Ngoài ra các bước khác tiến hành như một phản ứng PCR bình thường.
Sau khi chuẩn bị mẫu và chạy phản ứng PCR, tiến hành điện di trên gel Agarose và đọc kết quả, nhận biết sự hiện diện của WSSV nhờ so sánh kích thước của chúng với thang DNA chuẩn cùng với mẫu đối chứng dương và âm.
3.3.4.2 Phương pháp PCR định lượng(Realtime PCR).
Cũng như PCR định tính, phương pháp PCR định lượng dựa trên sự khuếch đại một đoạn DNA đặc hiệu của bộ gen virus WSSV. Tuy nhiên khác với phương pháp PCR định tính sản phẩm sau khi khuếch đại phải đem điện di và đọc kết quả trên bàn đọc UV, sản phẩm khuếch đại trong phương pháp PCR định lượng được đánh dấu bằng probe (mẫu dò) được thiết kế gắn chất phát huỳnh quang (FAM) ở đầu 5’ và chất hấp thu huỳnh quang (ở đầu 3’). Trong khi chạy PCR, đầu đọc iQ Realtime sẽ phát hiện các sản phẩm khuếch đại đặc hiệu bằng cách nhận biết và thu nhận các tín hiệu huỳnh quang phát ra ở bước 60o trong mỗi chu kỳ nhiệt nhờ hoạt tính 5’ - 3’exonuclease của Taq polymerase tách đầu 5’ có gắn chất phát huỳnh quang của probe ra khỏi khuôn mẫu, lúc này FAM ở dạng tự do sẽ phát quang và được thu nhận và xử lý. Nếu probe không gắn được vào khuôn hoặc hoạt tính 5’ - 3’ exonuclease không có thì chất phát huỳnh quang phát ra bao nhiêu sẽ bị hấp thu bấy nhiêu. Mẫu thử chứa nhiều DNA đích ban đầu sẽ có chu kỳ ngưỡng phát hiện sớm hơn là mẫu thử có ít DNA đích. Sau khi kết thúc chương trình, kết quả được phân tích trên phần mềm iQ version 3.1 và biết được nồng độ virus ban đầu của mẫu thử dựa vào các nồng độ DNA chuẩn và chúng ta sẽ đo được nồng độ DNA trong các mẫu thử bằng đường biễu diễn chuẩn (Standard curve) hiển thị mối quan hệ giữa các chu kỳ ngưỡng với các nồng dộ DNA trong các mẫu chuẩn.
3.3.5 Phương pháp xác định một số yếu tố môi trường.
Đo nhiệt độ nước bằng nhiệt kế bách phân (100oC) và đo mỗi ngày 1 lần vào một giờ cố định.
Độ mặn S (%) được xác định bằng khúc xạ kế vào lúc trước khi thả tôm và khi thêm hoặc thay nước.
pH được đo bằng máy đo pH.
Xác định độ tiêu hao Oxy hoá học (COD) trước khi bố trí thí nghiệm: Oxy hoá mẫu nước bằng Permanganat Kali, sau đó tiến hành chuẩn độ bằng Thiosulphate Natri sử dụng hồ tinh bột làm chất chỉ thị.
Xác định Oxy hoà tan (DO) theo phương pháp chuẩn độ Winkler trước khi bố trí thí nghiệm.
3.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm.
3.4.1 Sàng lọc các hợp chất chiết xuất từ thảo dược đối với virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV).chứng đốm trắng (WSSV). chứng đốm trắng (WSSV).
Thí nghiệm được thực hiện để khảo sát tác dụng trực tiếp của thuốc đối với virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV).
Sơ đồ 3.1: Bố trí thí nghiệm sàng lọc các hợp chất chiết xuất từ thảo dược đối với virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV).
3.4.2 Các nghiên cứu trong phòng thí nghiệm ướt.
18
Các hợp chất thử được hòa tan trong dung môi
DMSO ở các nồng độ khác nhau. Dịch chiết virus WSSV.
Trộn lẫn dịch chiết virus và mỗi loại hợp chất thử đã được pha ở các nồng độ khác nhau.
Ủ hỗn hợp dịch virus và hợp chất thử trong khoảng 2 giờ ở nhiệt độ 28 – 30oC.
Kiểm tra sự hiện diện của virus WSSV bằng PCR định tính nhưng không dùng NaOH-SDS trong quá trình ly trích DNA.
Mục đích của bố trí thí nghiệm để biết được khả năng tác dụng của virus WSSV trong cơ thể sống của tôm sau khi ủ hỗn hợp virus và thuốc thử ở các nồng độ khác nhau.
Sơ đồ 3.2: Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng tác dụng của virus WSSV trong cơ thể sống của tôm sau khi ủ hỗn hợp virus và thuốc thử ở các nồng độ khác nhau.
Các lô thí nghiệm tiêm hỗn hợp dịch chiết virus và thuốc thử ở các nồng độ khác nhau sau khi ủ 2 giờ. Lô đối chứng âm không tiêm virus WSSV Lô đối chứng dương tiêm dịch chiết virus WSSV
Tôm sú khoẻ kích cỡ 8 – 12 g/con
Theo dõi và ghi nhận hàng ngày về tình trạng sức khoẻ của tôm. Tiến hành thu mẫu những con chết (nếu có).
Sau 14 ngày
Thu toàn bộ mẫu kiểm tra lại bằng kỹ thuật Realtime PCR và đánh giá kết quả .
PHẦN 4
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
4.1 Sàng lọc các hợp chất chiết xuất từ thảo dược đối với virus gây hội chứng đốm trắng.
Hiệu quả trực tiếp của các hợp chất B, M, D2 đối với virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) được thử nghiệm bằng cách cho 250 µl dịch chiết WSSV và 250 µl với mỗi hợp chất B, M, D2 ở các nồng độ khác nhau vào các eppendorf (1 ml) và ủ hỗn hợp trong 2 giờ ở nhiệt độ (28 - 30oC), sau đó kiểm tra sự tồn tại của virus trong hỗn hợp bằng kỹ thuật PCR định tính nhưng không dùng NaOH - SDS trong quá trình tách chiết DNA virus.
Việc không sử dụng NaOH - SDS trong quá trình tách chiết DNA virus nhằm hạn chế hoá chất tác dụng lên virus, làm phơi trần DNA virus, như thế sẽ không đánh giá được tác dụng của các hợp chất lên virus WSSV.
Sản phẩm PCR sau đó được đem điện di và chụp hình kết quả.
4.1.1 Kết quả sàng lọc đối với hợp chất D2.
Hình 4.1: Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại DNAWSSV từ hỗn hợp dịch chiết virus được ủ với hợp chất D2 trong thời gian 2 giờ ở 28 - 30oC
Ghi chú:
Giếng 1: Mẫu hỗn hợp dịch virus và hợp chất D2 (2,5 mg/ml DMSO) Giếng 2: Mẫu hỗn hợp dịch virus và hợp chất D2 (5 mg/ml DMSO) Giếng 3: Mẫu hỗn hợp dịch virus và hợp chất D2 (7,5 mg/ml DMSO) Giếng 4: Mẫu hỗn hợp dịch virus và hợp chất D2 (10 mg/ml DMSO)
20
Giếng 5: Mẫu đối chứng dương. Giếng 6: Mẫu dịch virus thử nghiệm. Giếng 7: Mẫu đối chứng âm.
Giếng M: Thang DNA chuẩn.
Kết quả điện di cho thấy:
Trên bản gel sau khi điện di ghi nhận có xuất hiện vạch sáng ở các giếng 1, 2, 3, 4. Điều này có nghĩa hợp chất D2 ở các nồng độ lần lượt là 2,5 mg/ml, 5 mg/ml, 7,5 mg/ml, 10 mg/ml DMSO có tác động lên lớp vỏ virus làm phá vỡ cấu trúc vỏ protein của virus để phơi trần DNA virus ra ngoài. Trong trường hợp này hợp chất D2 đã làm thay vai trò của NaOH – SDS trong việc ly trích DNA.
Nếu so mức độ sáng tối chụp được của hợp chất D2 ở các nồng độ này với dịch virus thử nghiệm thì ta thấy yếu hơn. Điều này cho thấy hiệu quả tác dụng của hợp chất D2 lên virus WSSV là khá tốt nhưng chưa cao.
4.1.2 Kết quả sàng lọc đối với hợp chất B.
Hình 4.2: Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại DNAWSSV từ hỗn hợp dịch chiết virus được ủ với hợp chất B trong thời gian 2 giờ ở 28 - 30oC
Ghi chú:
Giếng 1: Mẫu hỗn hợp dịch virus và hợp chất B (2,5 mg/ml DMSO) Giếng 2: Mẫu hỗn hợp dịch virus và hợp chất B (5 mg/ml DMSO) Giếng 3: Mẫu hỗn hợp dịch virus và hợp chất B (7,5 mg/ml DMSO) Giếng 4: Mẫu hỗn hợp dịch virus và hợp chất B (10 mg/ml DMSO)
21
Giếng 5: Mẫu đối chứng dương. Giếng 6: Mẫu dịch virus thử nghiệm. Giếng 7: Mẫu đối chứng âm.
Giếng M: Thang DNA chuẩn.
Kết quả điện di cho thấy trên bản gel sau khi điện di xuất hiện vạch sáng ở các giếng 1, 2, 3, 4 tương tự như trường hợp của hợp chất D2 ở trên. Nếu so sánh về mức độ sáng tối thì vạch sáng ở các giếng 1, 2, 3, 4 yếu hơn so với vạch sáng ở giếng đối chứng dương và dịch virus thử nghiệm. Tuy nhiên so với hợp chất D2 thì hợp chất B ở các nồng độ tương tự có độ sáng mạnh hơn. Điều này cho thấy hiệu quả tác dụng của hợp chất B lên virus WSSV là cao hơn so với hợp chất D2.
Mặt khác, độ sáng tăng dần từ nồng độ 2,5 mg/ml đến 7,5 mg/ml, độ sáng ở nồng độ 7,5 mg/ml và 10 mg/ ml là gần như nhau. Điều này cho thấy ở hợp chất B nồng độ đã có vai trò nhất định trong sự phá vỡ lớp vỏ protein virus. Nồng độ càng cao trong phạm vi nhất định thì hiệu quả tác dụng càng mạnh.
4.1.3 Kết quả sàng lọc đối với hợp chất M.
Hình 4.3: Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại DNAWSSV từ hỗn hợp dịch chiết virus được ủ với hợp chất M trong thời gian 2 giờ ở 28 – 300C Ghi chú:
Giếng 1: Mẫu hỗn hợp dịch virus và hợp chất M (2,5 mg/ml) Giếng 2: Mẫu hỗn hợp dịch virus và hợp chất M (5 mg/ml) Giếng 3: Mẫu hỗn hợp dịch virus và hợp chất M (7,5 mg/ml)
22
Giếng 4: Mẫu hỗn hợp dịch virus và hợp chất M (10 mg/ml) Giếng 5: Mẫu đối chứng dương.
Giếng 6: Mẫu dịch virus thử nghiệm. Giếng 7: Mẫu đối chứng âm.
Giếng M: Thang DNA chuẩn.
Kết quả điện di (Hình 4.3) cho thấy ở cả 4 nồng độ (2,5 mg/ml; 5,0 mg/ml; 7,5 mg/ ml; 10,0 mg/ml) đối với hợp chất M đều không có xuất hiện vạch sáng nào, có thể là ở những nồng độ này hợp chất M chưa đủ liều lượng để có thể tác dụng lên lớp vỏ protein của virus WSSV hoặc hợp chất M không có hiệu quả tác dụng đối với virus WSSV.
Những kết quả này được đánh giá bằmg mắt thường và chỉ là những thí nghiệm In vitro, do đó để biết được hàm lượng DNA trong các mẫu thử trước và sau khi sử dụng các hợp chất có sai khác ý nghĩa hay không, các hỗn hợp này (D2 và B) được thực hiện với phản ứng Realtime PCR. Đồng thời để xác định được khả năng bất hoạt thật sự của các hợp chất lên virus WSSV, chúng ta cần phải cảm nhiễm hỗn hợp này vào cơ thể tôm.
Dựa vào kết quả sàng lọc 3 hợp chất như trên, chúng tôi chỉ tiến hành thử nghiệm đối với các hợp chất D2 và B.
4.2 Kết quả thử nghiệm sau khi tiêm trên tôm hỗn hợp virus WSSV và thuốc D2, B ở các nồng độ khác nhau.
Sau khi trộn chung dịch virus WSSV với mỗi hợp chất B và D2 ở các nồng độ khác nhau và ủ trong 2 giờ ở nhiệt độ 28 - 30oC, ta tiến hành cảm nhiễm trực tiếp trên tôm nuôi để đánh giá khả năng hoạt động của virus WSSV trong cơ thể tôm.
Tôm sú thí nghiệm có khối lượng trung bình 8 - 12 gam/con. Tôm khi thu về ở trong tình trạng khoẻ và sạch bệnh. Trước khi bố trí thí nghiệm, tôm được nuôi thuần trong thời gian 7 ngày để tôm thích nghi với môi trường và tôm được kiểm tra các mầm bệnh virus (WSSV, Taura Syndrome virus, MBV, YHCV) và nhóm Vibrio (Vibrio
parahaemolyticus, Vibrio harveyi, V. alginolyticus) .
Bảng 4.1 Các yếu tố môi trường trong quá trình thí nghiệm
Nhiệt độ môi trường nước 27 - 28oC
pH trung bình 7,78 – 7,87
Độ mặn (‰) 15
COD (mg/l) 11,32
OD (mg/l) 4,1
Sau khi nuôi thuần trong 7 ngày thì bắt đầu cảm nhiễm cho tôm bằng cách tiêm 0,1 ml hỗn hợp dịch virus và các hợp chất D2, B được pha theo các nồng độ khác nhau trong dung môi DMSO (ủ trong 2 giờ ở 28 - 30oC) vào đốt cơ bụng thứ 2 của tôm. Các hỗn hợp này đã được kiểm tra bằng phương pháp Realtime PCR trước khi cảm nhiễm trên tôm.
Thí nghiệm được bố trí như sau:
Lô 1: Đối chứng âm tiêm dung dịch TN 1X
Lô 2: Đối chứng dương tiêm dịch chiết virus WSSV
Lô 3, Lô 4, Lô 5, Lô 6: Tiêm hỗn hợp dịch chiết virus WSSV và hợp chất D2 ở các nồng độ (2,5 mg/ml; 5 mg/ml; 7,5 mg/ml và 10,0 mg/ml)
Lô 7, Lô 8, Lô 9, Lô 10: Tiêm hỗn hợp dịch chiết virus WSSV và hợp chất B ở các nồng độ (2,5 mg/ml; 5 mg/ml; 7,5 mg/ml và 10,0 mg/ml)
Sau khi tiêm, hầu hết các lô thí nghiệm đều có tôm chết. Số tôm chết này là do bị sốc sau khi tiêm.
Trong 2 ngày đầu, tôm có hiện tượng bỏ ăn hoặc ăn rất ít. Nhưng sang những ngày tiếp theo thì tôm ở các lô thí nghiệm có dấu hiệu bắt mồi tốt. Từ ngày thứ 5 trở đi, tôm ở các lô đối chứng âm, và các lô tiêm hỗn hợp dịch virus và hợp chất đều khoẻ mạnh, khả năng hoạt động linh hoạt. Tuy nhiên, đến ngày thứ 7, ở lô đối chứng dương cho tiêm dịch virus, một số con bắt đầu có dấu hiệu bỏ ăn. Sang ngày thứ 9, ở lô đối chứng dương đã có chết, quan sát thấy những con chết thân bị đỏ, vỏ mềm và có xuất hiện đốm trắng ở đầu ngực. Ở các lô khác tôm vẫn hoạt động tốt và không có hiện tượng bị chết. Tỷ lệ tôm chết trong quá trình thí nghiệm được trình bày ở Bảng 4.2.
Bảng 4.2 Kết quả ghi nhận tỷ lệ tôm chết ở các lô trong quá trình thí nghiệm
Lô thí nghiệm Ngày
theo dõi
Tỷ lệ tôm chết ở các lô trong quá trình thí nghiệm (%)
Lô 1 Lô 2 Lô 3 Lô 4 Lô 5 Lô 6 Lô 7 Lô 8 Lô 9 Lô 10
1 20 22 9 11 30 22 0 0 25 10 2 20 22 18 11 30 22 9 0 25 10 3 20 22 18 11 30 22 9 0 25 20 4 30 22 18 22 30 22 9 0 25 20 5 30 22 18 22 30 22 9 0 25 20