Tinh chế kháng thể kháng OTA bằng cách tủa huyết thanh với amoniumsulfate 45% S. Sau đó loại bỏ kháng thể kháng BSA bằng cột sắc ký ái lực miễn dịch với cộng hợp gel Sepharose 4B – BSA.
Khi đó, các kháng thể kháng OTA cùng với các kháng thể còn lại đi qua cột.
2.4.3.3 Cộng hợp IgGOTA lên polymer Sepharose 4B và tạo cột IAC
Tiến hành cộng hợp IgGOTA lên Sepharose 4B và tạo cột IAC (mục 3.3.2). Cột được qua thử nghiệm cho kết quả 100% về khả năng thu hồi, tính lặp lại cao, cho thấy sử dụng cột ái lực miễn dịch sản xuất tại Việt Nam với tính hiệu quả cao tương đương với các cột ngoại nhập và giá thành thấp hơn.
Chƣơng 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài
Thời gian thực hiện: 6/2/2006 – 30/6/2006
Địa điểm thực hiện đề tài: Phòng Miễn Dịch – Viện Pasteur TPHCM
3.2 Vật liệu
3.2.1 Đối tƣợng nghiên cứu
Ochratoxin A chuẩn có nồng độ 10 ppm
Kháng thể kháng ochratoxin do viện Pasteur tinh chế Gel: CN–Br activate Sepharose 4B
Cột: là cột nhựa, có kích thước 0,4 x 10 cm
3.2.2 Thiết bị
Huỳnh quang kế (A1501, Vicam, USA)
Máy khuấy từ đứng (Stuare Sientific Stirrer SS10, UK) Cân phân tích (E14130, OHAUS, Switzerland)
Máy votex (D–79219, IKA, Germany) Máy lắc (D–79219, IKA, Germany) Tủ hút, tủ lạnh
3.2.3 Dụng cụ
Ống đong, phễu thuỷ tinh, bechers Cột sắc ký
Pippetman 100 µl – 1000 µl, đầu tip
3.2.4 Hóa chất
Methanol (Merk) NaCl, Tween 20 Nước cất
Hóa chất tẩy rửa
Dung dịch 2: PBS, NaN3 0,05% 40 (dd 2) Dung dịch 3: HCl 1 mM, pH = 3 (dd 3)
Dung dịch 4: NaHCO3 0,1 M; NaCl 0,5 M; Thimerosal 0,01%; pH = 8,7 (dd 4) Dung dịch 5: Tris – HCl 0,1 M; NaCl 0,5 M; pH = 8 (dd 5)
Dung dịch 6: NaCl 0,5 M; CH3COOH 0,1 M; pH = 4 (dd 6)
Dung dịch 7: Tris – HCl 0,1 M; NaN3 0,05%; NaCl 0,5M; pH = 4 (dd 7)
3.3 Phƣơng pháp
3.3.1 Các phƣơng pháp phục vụ nghiên cứu
3.3.1.1 Phƣơng pháp quang phổ kế để xác định nồng độ OTA Nguyên tắc
Quang phổ kế cấu tạo gồm nguồn sáng sau khi qua bộ tạo ánh sáng đơn sắc chỉ cho qua ánh sáng với bước sóng nhất định, và khi qua dung dịch OTA trong cuvet sẽ tác động vào OTA và ánh sáng bị OTA hấp thụ một phần.
Ở mỗi dung dịch pha loãng khác nhau, lượng ánh sáng hấp thu thay đổi ở một độ dài sóng nhất định (chỉ có điện tử ở các hợp chất có nối đôi hay/và nối ba mới hấp thụ ánh sáng ở vùng tử ngoại). Bộ nhận tín hiệu, bộ khuếch đại tín hiệu sẽ đo mật độ quang của dung dịch.
Cực đại hấp thụ (λmax) là bước sóng mà ở đó chất cho độ hấp thụ lớn nhất. Và ở mỗi cực đại hấp thụ, mỗichất lại có hệ số hấp thụ mol nhất định (Σ) .
Nồng độ của chất phân tích được tính theo công thức: OD *a *V
µg OTA =
OD: giá trị hấp thụ ở cực đại hấp thụ (λmax) a: độ pha loãng dung dịch
V: thể tích dung dịch màu
: hệ số hấp phụ phân tử của chất tại cực đại hấp thụ
Sơ đồ hoạt động của máy quang phổ tử ngoại được trình bày trong Hình 3.1.
Đèn nguồn Bộ tạo ánh sáng đơn sắc Cốc đựng mẫu đo Bộ nhận tín hiệu Bộ khuếch đại tín hiệu Đồng hồ đo
3.3.1.2 Phƣơng pháp dùng huỳnh quang kế đo lƣờng hàm lƣợng ochratoxin Nguyên tắc
Ánh sáng từ nguồn sáng phát ra được điều chỉnh bởi hệ thống kiểm soát độ dài sóng nhằm tạo nên bước sóng kích thích phù hợp. Các phân tử hấp thụ photon ánh sáng chuyển từ trạng thái cơ bản lên trạng thái kích thích.
Tuy nhiên do trạng thái kích thích không bền nên các phân tử ở trạng thái kích thích có thể trở về trạng thái cơ bản bằng cách giải phóng năng lượng dưới dạng photon, tức là tự phát ra ánh sáng, với năng lượng kém đi.
Ở bước sóng phát xạ 460 nm, các bức xạ được tế bào quang điện tại đầu dò chuyển thành tín hiệu điện tử. Lượng ochratoxin có trong mẫu đươc so sánh với dung dịch ochratoxin chuẩn và máy tự tính ra kết quả.
Sơ đồ hoạt động của huỳnh quang kế được trình bày trong Hình 3.2.
3.3.1.3 Chuẩn bị dung dịch OTA chuẩn và xác định nồng độ
Mục đích: pha loãng dung dịch OTA chuẩn Tiến hành
Pha OTA nồng độ 0,25 ppm từ OTA chuẩn có nồng độ 10 ppm trong methanol. Nguồn sáng Bộ tạo ánh sáng kích thích đơn sắc Cốc đựng mẫu đo Bộ nhận tín hiệu Bộ khuếch đại tín hiệu Xác định lƣợng tín hiệu Khe sángvào Khe sáng ra Bộ hấp phụ ánh sáng bức xạ đơn sắc
Lấy OTA chuẩn nồng độ 10 ppm để nguội ở nhiệt độ phòng khoảng 20 phút. Lấy một thể tích OTA cần sử dụng vào lọ mới, để khô hoàn toàn trong tủ hút. Sau đó thêm methanol theo tỷ lệ mong muốn.
Tiến hành xác định nồng độ OTA bằng huỳnh quang kế.
3.3.2 Quy trình tạo cột IAC: 3.3.2.1 Chuẩn bị kháng thể 3.3.2.1 Chuẩn bị kháng thể
Kháng thể kháng OTA dưới dạng tủa trong amoniumsulfate được tiến hành thẩm tích trong dung dịch
Thẩm tích tủa trong dung dịch NaN3 (dd 1): 1 lít x 2 lần Thẩm tích tủa trong dung dịch PBS (dd 2): 1 lít x 2 lần Ly tâm 2000 vòng/phút, thu dịch nổi
Xác định nồng độ IgG bằng quang phổ kế ở λ = 280 nm
3.3.2.2 Chuẩn bị gel
Gel CNBr – activated Sepharose 4B 1 g gel khô trương phồng thành 3,5 ml gel
Rửa gel với dung dịch HCl 1 mM (dd 3), thể tích 200 ml dung dịch/1g gel Cách rửa gel: Cho HCl vào, lắc để gel nở hoàn toàn. Sau đó tiến hành ly tâm
Ly tâm lần 1: 2500 vòng/phút, trong 5 phút Ly tâm lần 2 – 8: 2500 vòng/phút, trong 2 phút Ly tâm lần 9: 2500 vòng/phút, trong 5 phút
3.3.2.3 Cộng hợp IgG vào Sepharose 4B
Quá trình cộng hợp thực hiện qua các bước:
Cho dung dịch IgGOTA vào gel đã rửa (nồng độ 5 mg IgGOTA/1 ml gel), để 2 giờ ở nhiệt độ phòng (lắc)
Qua đêm ở 40C (lắc)
Ly tâm 2500 vòng/phút, trong 5 phút
Lấy dịch nổi đo hấp phụ quang ở λ = 280 nm (OD = 0 chứng tỏ kháng thể cộng hợp hoàn toàn)
Rửa lại 3 lần với đệm carbonat (dd 4) (ly tâm 2500 vòng/phút, 2 phút/ lần) Bất hoạt nhóm –C N+
Rửa với đệm acetic (dd 6) (lắc ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ) Lần cuối rửa với đệm Tris – HCl (dd 7)
3.3.2.4 Nén cột
Các bước nén cột:
Thể tích gel trên cột là: 0,1 ml gel/cột
Ngâm frit và cột bằng ethanol trong 3 phút để đuổi hết khí bên trong Rửa lại bằng nước cất. Nén frit vào đáy của cột
Rửa 3 lần với đệm Tris (dd 7) Cho gel đã cộng hợp IgG vào cột
Lưu ý: + Khuấy từ đứng hỗn hợp dịch gel trong điều kiện lạnh
+ Pha loãng hỗn hợp 10 lần ( hút 1 ml cho vào cột) Rửa 3 lần với đệm
Cho dd đệm (dd 7) vào cột, bảo quản ở 40 C
3.3.3 Xây dựng mối tƣơng quan tuyến tính giữa lƣợng OTA trong dịch đẩy chuẩn và dịch đẩy thay thế (methanol)
Trong quá trình thực hiện cho thấy nếusử dụng dịch đẩy chuẩn của hãng Vicam giá thành rất cao. Nên chúng tôi đã tiến hành đẩy bằng dịch đẩy thay thế (methalnol tuyệt đối). Do đó để có hiệu quả cần xây dựng mối tương quan giữa lượng OTA trong methanol (dịch đẩy thay thế) và trong dịch đẩy chuẩn. Từ đó, tiến hành đẩy bằng methanol trong các thí nghiệm sau và suy ra được lượng OTA chính xác.
Bố trí thí nghiệm khảo sát mối tương quan:
Chuẩn bị dung dịch OTA có nồng độ 0,25 ppm từ dd OTA chuẩn 10 ppm (mục 3.3.1.3), tiến hành đo hàm lượng OTA bằng huỳnh quang kế.
Bố trí thí nghiệm theo Bảng 3.1
Bảng 3.1:Bố trí thí nghiệm khảo sát mối tƣơng quan tuyến tính giữa lƣợng OTA trong dịch đẩy chuẩn và dịch đẩy thay thế (methanol)
Lượng OTA (ng) Thể tích dung dịch OTA nồng độ 0,25 ppm (µl) Thể tích methanol hoặc dung dịch đẩy (µl)
2,5 5 10 20 40 10 20 40 80 160 1490 1480 1460 1420 1340 3.3.4 Dựng đƣờng chuẩn OTA
Dựa vào đặc tính phát huỳnh quang của ochratoxin để dựng đường chuẩn nhằm khảo sát mối tương quan tuyến tính giữa lượng OTA và cường độ phát huỳnh quang (đo bằng huỳnh quang kế).
Từ dung dịch OTA chuẩn nồng độ 10 ppm pha thành dung dịch OTA 0,25 ppm trong methanol (mục 3.3.1.3). Thí nghiệm theo Bảng 3.2, mỗi hàm lượng thực hiện 2 lần. Tiến hành đo hàm lượng OTA bằng huỳnh quang kế.
Bảng 3.2: Bố trí thí nghiệm dựng đƣờng chuẩn OTA
Lượng OTA (ng) Số lần lặp lại (n) Thể tích dịch đẩy (µl) 2,5 5 10 20 40 2 2 2 2 2 1490 1480 1460 1420 1340 * n: Số lần lặp lại.
3.3.5 Quy trình tinh chế, cô đặc bằng cột IAC và định lƣợng bằng huỳnh quang kế
Quy trình:
Sử dụng quy trình của hãng Vicam (Mỹ) Để cột cân bằng ở nhiệt độ phòng
10 g mẫu + 1g NaCl
20 ml methanol: H2O (8: 2)
Khuấy từ 500 vòng/phút, 30 phút Lọc qua giấy lọc thường
Pha loãng: 10 ml dịch lọc + 40 ml PBS 10 ml dịch pha loãng
Cho chảy trực tiếp qua cột
Rửa cộ bằng (1): 10 ml dung dịch rửa *
(2): 10 ml nước cất hai lần qua lọc
Giải hấp bằng 1,5 ml methanol Đo huỳnh quang dd giải hấp
* Dung dịch rửa: 20 ml PBS + 20 µl Tween 20 (0,01 %.)
3.3.6 Hiệu suất thu hồi của cột IAC đối với mẫu trắng
Xác định hiệu suất thu hồi nhằm đánh giá khả năng bắt giữ OTA của cột IAC. Cho vào cột lượng OTA chuẩn đã biết trước nồng độ (3.3.1.3). Lượng bố trí theo Bảng. Thực hiện theo quy trình (3.3.5). Dịch sau giải hấp tiến hành định lượng bằng huỳnh quang kế. Tiến hành song song với hai cột không bổ sung OTA để làm đối chứng.
Tiến hành bố trí thí nghiệm dựng xác định hiệu suất thu hồi đối với mẫu trắng theo Bảng 3.3.
Bảng 3.3: Bố trí thí nghiệm khảo sát hiệu suất thu hồi của cột IAC đối với OTA chuẩn
Lượng OTA chuẩn qua IAC (ng) n 2,5 5 10 20 30 40 2 2 2 2 2 2 Cách tính hiệu suất thu hồi của cột IAC:
3.3.7 Hiệu xuất thu hồi của cột IAC đối với mẫu tự tạo 3.3.7.1 Phƣơng pháp chọn mẫu nền
Mẫu nền được chọn sao cho không bị nhiễm OTA, trong thí nghiệm mẫu nền là mẫu bia Sài Gòn (bia 333). Tiến hành kiểm tra nền của mẫu bia bằng huỳnh quang kế.
3.3.7.2 Phƣơng pháp tạo mẫu giả
Lượng mẫu dùng để phân tích là 5 ml, chiết mẫu theo quy trình (phụ lục 2). Gây nhiễm mẫu bằng một lượng OTA đã biết trước hàm lượng (5, 10, 20 và 40 ng).
3.3.7.3 Hiệu suất thu hồi của cột IAC đối với mẫu bia Sài Gòn
Mục đích thí nghiệm nhằm đánh giá độ thu hồi của OTA đối với mẫu bia được gây nhiễm nhân tạo.
Mẫu bia được chiết theo quy trình, gây nhiễm mẫu, cho qua IAC, dịch sau giải hấp được định lượng bằng huỳnh quang kế. Bố trí thí nghiệm theo Bảng 3.4.
Lƣợng OTA sau khi qua cột
H% = x 100 Lƣợng OTA trƣớc khi qua cột
Bảng 3.4: Bố trí thí nghiệm khảo sát hiệu suất thu hồi OTA của cột IAC đối với mẫu tự tạo
3.3.8 Tình hình nhiễm OTA của một số mẫu thực phẩm trên thị trƣờng
Bố trí thí nghiệm theo Bảng 3.5
Bảng 3.5: Bố trí thí nghiệm khảo sát tình hình nhiễm OTA của một số mẫu trên thị trƣờng
STT Mẫu Lượng OTA (ng) theo
kết quả huỳnh quang 1 Cà phê Hiệp Nga
2 Vinacafe 3 Millo 4 Bột ngũ cốc 5 Nescafe 6 Bắp (mua ngoài chợ) 7 Bắp (Viện Pasteur) 8 Đậu nành (Viện Pasteur) 9 Tấm (Viện Pasteur) 10 Bia Sài Gòn (333)
3.4 Phƣơng pháp xử lí số liệu
Số liệu được thu thập và xử lý bằng phần mềm Excel 2003. Lượng OTA chuẩn
qua IAC (ng)
Khối lượng mẫu (ml) Số lần lặp lại (n) 2,5 5 10 20 30 40 5 5 5 5 5 5 2 2 2 2 2 2
Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Tạo cột sắc ký ái lực miễn dịch
Cột nhựa có kích thước 0,4 x 10 cm.
Nồng độ kháng thể kháng OTA gắn lên cột bằng 5 mg/ml gel Sepharose 4B, có khả năng bắt giữ OTA.
Hình 4.1: Cột IAC
4.2 Xây dựng mối tƣơng quan tuyến tính giữa lƣợng OTA (đo bằng huỳnh quang kế) trong dịch đẩy chuẩn và dịch đẩy thay thế (methanol).
Tiến hành xây dựng mối tương quan tuyến tính giữa lượng OTA trong methanol (dịch đẩy thay thế) và dịch đẩy chuẩn. Từ đó, tiến hành đẩy bằng methanol trong các thí nghiệm sau và suy ra được lượng OTA chính xác.
Pha dung dịch OTA nồng độ 0,25 ppm từ dung dịch OTA chuẩn 10 ppm. Định lượng bằng huỳnh quang kế lượng đã biết trước (2,5; 5; 10; 20 và 40 ng) trong dịch đẩy chuẩn và dịch đẩy thay thế (methanol).
Kết quả xây dựng mối tương quan được trình bày ở Bảng 4.1 và Biểu đồ 4.1
Bảng 4.1: Mối tƣơng quan giữa lƣợng OTA trong dịch đẩy chuẩn và dịch đẩy thay thế
Lượng OTA
(ng) n
Lượng OTA dựa trên kết quả huỳnh quang Trong dịch đẩy methanol Trong dịch đẩy chuẩn Lượng OTA (ng) SD Cv Lượng OTA (ng) SD Cv 2,5 2 3 0 0 1 0 0 5 2 7 1 14,3 4 0 0 10 2 16,5 0,7 4,2 9 0 0 20 2 36 1,4 3,9 21 0 0 40 2 71 1,4 1,97 44 0 0
Lượng OTA trong dịch đẩy chuẩn (ng) y = 0.6285x - 0.9817 R2 = 0.9992 0 10 20 30 40 50 0 10 20 30 40 50 60 70 80
Lượng OTA trong dịch đẩy methanol (ng)
Biểu đồ 4.1: Mối tƣơng quan giữa lƣợng OTA trong dịch đẩy chuẩn và dịch đẩy thay thế dựa trên kết quả hùynh quang
Nhận xét:
Độ lệch chuẩn (SD) nói lên mức độ chênh lệch giữa các số liệu; số liệu càng rời rạc thì SD càng lớn, ngược lại số liệu càng tập trung thì SD càng nhỏ [8]. Bảng 4.1, SD biến thiên từ 0 – 1,4 và có thể thấy với lượng OTA càng lớn thì SD càng tăng tương ứng với mức độ sai số xảy ra càng cao. Các sai số có thể là thao tác hút bằng micropipet không chuẩn xác, sự thất thoát OTA trong quá trình thực hiện…
Hệ số biến động (CV) là một chỉ số khá tốt để đánh giá độ chính xác và tính khách quan của các số liệu thu thập được. Phạm vi chấp nhận được của hệ số biến động là nhỏ hơn 20% [8]. Bảng 4.1, CV nhỏ hơn 20% (0 – 14,3%) nên đạt mức chấp nhận trong phân tích.
Biểu đồ 4.1 đã thể hiện mối tương quan tuyến tính giữa lượng OTA đo bằng huỳnh quang kế trong dịch đẩy chuẩn và dịch đẩy thay thế qua phương trình: y = 0,6285x – 0,9817 với R2 = 0,9992
Dựa trên mối tương quan tuyến tính, tiến hành đẩy OTA bằng dịch đẩy thay thế (methalnol) trong các thí nghiệm sau, từ đó suy ra lượng OTA chính xác
4.3 Dựng đƣờng chuẩn OTA
Pha dung dịch OTA nồng độ 0,25 ppm từ dung dịch OTA chuẩn 10 ppm. Định lượng bằng huỳnh quang kế lượng đã biết trước (2,5; 5; 10; 20 và 40 ng), mỗi nồng độ thực hiện 2 lần, dựng đường chuẩn bằng phần mềm Microsoft Office Exel 2003.
Kết quả dựng đường chuẩn được trình bày ở Bảng 4.2 và Biểu đồ 4.2
Bảng 4.2: Kết quả dựng đƣờng chuẩn OTA
Lượng OTA
(ng) (n)
Kết quả huỳnh quang
Lượng OTA (ng) SD Cv 2,5 2 1 0 0 5 2 3,4 0,6 17,6 10 2 9,4 0,44 4,7 20 2 21,6 0,79 3,6 40 2 43,6 0,79 1,8
Lượng OAT theo huỳnh quang (ng)
y = 1.1452x - 1.95 R2 = 0.9995 0 10 20 30 40 50 0 10 20 30 40 50 Lượng OTA (ng)
Biểu đồ 4.2: Đường chuẩn OTA Nhận xét:
Bảng 4.2, SD biến thiên từ 0 – 0,79 và có thể thấy với lượng OTA càng lớn thì SD càng tăng tương ứng với mức độ sai số xảy ra càng cao.
Bảng 4.2, CV nhỏ hơn 20% (0 – 14,3%) nên đạt mức chấp nhận trong phân tích.
Biểu đồ 4.2 thể hiện mối tương quan tuyến tính giữa lượng OTA đo bằng huỳnh quang kế với lượng OTA trong mẫu chuẩn qua phương trình:
y = 1,1452x – 1,95 với R2 = 0,9995
4.4 Hiệu suất thu hồi của cột IAC đối với mẫu trắng
Cho OTA đã biết trước ở các hàm lượng qua cột IAC theo quy trình (3.3.4), mỗi lượng thực hiện 2 lần. Tiến hành định lượng bằng huỳnh quang kế lượng OTA trước khi qua cột và sau khi thu hồi. Kết quả được trình bày trong Bảng 4.3 và Biểu đồ 4.3
Bảng 4.3: Hiệu suất thu hồi của cột IAC đối với mẫu trắng Lượng OTA
trước qua cột (ng)
N Lượng OTA thu hồi trung bình
(ng)
Hiệu suất thu hồi trung bình (%) SD CV 4,02 2 4,17 103,73 0,1 2,44 10,02 2 10,02 100 0 0