Chọn quy trình ly trích RNA thích hợp từ mẫu lách
Chọn quy trình RT-PCR có hiệu quả nhất trong việc phát hiện gen NS5B So sánh kết quả RT-PCR với kết quả OD của ELISA
Khảo sát mối liên hệ giữa kết quả RT-PCR với đặc điểm bệnh tích.
3.3. VẬT LIỆU VÀ HOÁ CHẤT 3.3.1.Vật liệu nghiên cứu
Mẫu dùng trong ly trích RNA (lách đã được xét nghiệm ELISA dương tính với kháng nguyên E2 được gởi từ Chi cục Thú y Tiền Giang, các mẫu dương tính khi tỉ số OD từ 0,3 trở lên) và phản ứng RT-PCR phát hiện gen NS5B.
3.3.2.Hóa chất
Hoá chất dùng trong ly trích RNA tổng số
Dung dịch D là dung dịch ly giải tế bào: 2 M guanidium thiocyanate 25 mM sodium citrate 0,5% sarkosyl (w/v) 100 mM -mercaptoethanol, pH7 2 M sodium acetate, pH4 Phenol Chloroform Isopropanol Ethanol 75%
Hoá chất dùng trong điện di gel biến tính
Dung dịch đệm: 10X MOPS electrophoresis buffer (500 ml), thành phần: 0,2 M MOPS (pH7)
20 mM sodium acetate 10 mM EDTA
Dung dịch nạp mẫu: 10X formaldehyde gel-loading buffer (10 ml), thành phần:
50% glycerol 10mM EDTA
0,25% (w/v) bromophenol blue 0,25% (w/v) xylene cyanol
Hoá chất và dụng cụ trong điện di gel TBE
Dung dịch đệm TBE 50X
Tris 242 g/l
Boric acid 57.1 ml/l
Agarose (Biorad)
Dung dịch nạp mẫu (loading dye) 10X (20% Ficoll 400; 0,1 M disodium EDTA, pH 8; 1% sodium dodecyl sulfate; 0,25% bromphenol blue; 0,25% cylene cyanol)
Dung dịch ethidium bromide (dung dịch stock 1000X 0,5 mg/ml: 50 mg ethidium bromide, 100 ml H2O. Dung dịch sử dụng 0,5 µg/ml pha loãng 1:1000 cho gel hoặc dung dịch nhuộm – bảo quản tránh ánh sáng).
Thang DNA chuẩn Bộ dụng cụ điện di nằm Bộ nguồn điện một chiều Lược gel Khuôn đổ gel Micropipette các loại. Hoá chất dùng trong phản ứng RT-PCR Rnase-free water Buffer PCR MgCl2 dNTPs Mồi xuôi Mồi ngược Taq polymerase Rnasin MMLV reverse trancriptase Triton X–100 3.4. BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM
Thí nghiệm 1: Kết tủa RNA ly trích ở các nồng độ LiCl khác nhau
LiCl là một tác nhân khử nước mạnh, với đặc tính hoà tan RNA thấp hơn DNA do đó muối LiCl nồng độ cao được sử dụng để kết tủa RNA (Sambrook và
Russell, 2001). Để khảo sát hiệu quả kết tủa của muối LiCl với RNA, trong quá trình ly trích mẫu chúng tôi thực hiện thu tủa RNA với các nồng độ muối LiCl khác nhau. Từ đó chọn nồng độ muối LiCl thích hợp nhất trong thu tủa RNA, đưa ra quy trình tách chiết RNA thích hợp.
Thí nghiệm này được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên. Gồm 4 nghiệm thức (LiCl 1,0 M; LiCl 1,5 M; LiCl 2,0 M; LiCl 2,5 M), mỗi nghiệm thức được lặp lại trên 5 mẫu.
Chỉ tiêu khảo sát là tỉ số OD, hàm lượng RNA thu được và sản phẩm RT- PCR thu được từ các mẫu. So sánh sự khác biệt giữa các nghiệm thức, chọn ra nghiệm thức thích hợp nhất.
Thí nghiệm 2: Thử nghiệm hàm lƣợng Taq khác nhau trong phản ứng RT-PCR
Hàm lượng Taq được khuyến cáo trong khoảng 1 – 2,5 UI trên 100 µl dung dịch phản ứng. Nồng độ Taq quá cao sẽ tạo ra những sản phẩm không chuyên biệt (Bùi Chí Bửu, 1999). Vì vậy, bước đầu chúng tôi thực hiện thí nghiệm thay đổi lượng nhỏ nồng độ Taq trong phản ứng.
Thí nghiệm được thực hiện trên 5 mẫu khác nhau, mỗi mẫu được chạy phản ứng RT-PCR với 2 nồng độ Taq khác nhau là 2,0 UI và 2,5 UI.
Chỉ tiêu khảo sát thí nghiệm này là tỉ lệ mẫu thực hiện phản ứng thành công và băng sản phẩm RT-PCR được điện di trên gel 2%. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Khảo sát 3: So sánh kết quả OD của ELISA với kết quả RT-PCR
Nhằm khảo sát có hay không sự phụ thuộc kết quả RT-PCR với tỉ số OD của ELISA
Với 23 mẫu bệnh phẩm có kết quả OD của ELISA phát hiện kháng nguyên E2 được gởi từ Chi cục Thú y Tiền Giang so sánh với kết quả RT-PCR chúng tôi thực hiện tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hoá Sinh trường Đại học Nông Lâm.
Khảo sát 4: Khảo sát mối liên hệ giữa đặc điểm bệnh tích của những heo chẩn đoán dƣơng tính với bệnh DTH bằng phƣơng pháp RT-PCR
Bệnh DTH với các triệu chứng lâm sàng, bệnh tích không đều nhau và có nhiều biến đổi không điển hình. Vì vậy, chúng tôi xem xét những mẫu dương tính trong phương pháp chẩn đoán RT-PCR có những đặc điểm bệnh tích như thế nào.
Khảo sát được thực hiện dựa trên kết quả RT-PCR khuếch đại gen NS5B ở 23 mẫu lách với những đặc điểm bệnh tích nghi ngờ bệnh DTH (lịch sử mẫu được gởi từ Chi cục Thú Y Tiền Giang).
3.5. PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 3.5.1.Thu thập mẫu bệnh phẩm
Lấy mẫu khi heo có một số bệnh tích nghi ngờ của DTH như sau: Da xuất huyết
Gan xuất huyết, hoại tử
Lách xuất huyết, nhồi huyết hoặc hoại tử ở rìa lách Thận xuất huyết, xung huyết
Phổi xuất huyết, tụ huyết, hoại tử hoặc phổi hoá gan (màu sắc giống gan, thả vào nước bị chìm)
Tim xuất huyết Dạ dày xuất huyết
Ruột xuất huyết hình cúc áo
Mẫu bệnh phẩm là lách đã được xét nghiệm ELISA phát hiện kháng nguyên E2 dương tính.
Lấy khoảng 100 g mẫu cho vào túi nilông vô trùng được bảo quản trong bình đá và vận chuyển về phòng thí nghiệm, bảo quản ở nhiệt độ -700C tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hoá Sinh trường Đại Học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh cho đến khi xét nghiệm.
3.5.2.Ly trích RNA tổng số
Mẫu có thể đƣợc xử lý theo 2 cách:
Mẫu bệnh phẩm lách được nghiền trong dịch PBS để thu huyền dịch tế bào (tỉ lệ mẫu so với dịch PBS là 20%)
Các bước tiến hành:
Bước 1: Cắt một phần lách cho vào cối, dùng kéo cắt nhỏ, cho một lượng dịch PBS tương ứng vào, dùng chày nghiền nhuyễn cho đến khi không còn cặn.
Bước 2: Thu dịch nghiền vào eppendorf lớn, giải đông 3 lần. Bước 3: Ly tâm 5000 vòng/10 phút ở 40C
Bước 4: Thu dịch tế bào, bỏ cặn. Dịch tế bào thu được bảo quản ở -700C cho đến khi tiến hành ly trích mẫu.
Mẫu bệnh phẩm nghiền trong nitơ lỏng -1960C để thu mẫu ở dạng bột nhuyễn. Các bước tiến hành:
Bước 1: Cối chày được làm lạnh với nitơ lỏng -1960C, cắt một lượng mẫu cho vào cối chày, đổ vào một lượng nhỏ nitơ, dùng chày nghiền nhuyễn.
Bước 2: Khi mẫu đã ở dạng bột nhuyễn, thu mẫu với lượng khoảng 30 mg cho vào mỗi eppendorf. Mẫu được bảo quản ở -700C cho đến khi sử dụng.
Tiến hành ly trích RNA tổng số
Nguyên tắc ly trích RNA từ mẫu dịch tế bào dựa theo quy trình của Chomezynski và Sacchi (1987):
Dịch tế bào được đồng nhất chung với dung dịch D và -mercaptoethanol nhằm phá vỡ màng tế bào phóng thích ra các thành phần nội bào (DNA, RNA, protein…). Đồng thời guanidium thiocyanate có trong dung dịch D làm biến tính protein mạnh và ức chế hoạt động của Rnase.
Phenol, chloroform cho vào tiếp sau đó nhằm kết tủa protein và pH4,0 của phenol có tác dụng kéo DNA vào pha phenol. Ly tâm tốc độ cao nhằm thu được dịch trong bên trên chứa RNA, nhiệt độ lạnh hạn chế sự phân huỷ RNA.
Dịch trong thu được ủ với ethanol bổ sung LiCl nhằm kết tủa đặc hiệu RNA. LiCl là một tác nhân khử nước mạnh, với đặc tính hoà tan RNA thấp hơn DNA do đó được dùng để kết tủa RNA với nồng độ cao LiCl (Sambrook và Russell, 2001). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tủa RNA được rửa với ethanol 75% từ 2-3 lần nhằm loại bỏ LiCl, giảm nồng độ ethanol ban đầu. Tủa RNA sau khi được làm khô thì hoà tan trong nước đã được khử với DEPC và bảo quản ở -700C nhằm tránh sự phân huỷ của Rnase.
Các bước tiến hành ly trích:
Hút khoảng 350 µl dịch tế bào vào ống eppendorf.
Cho vào 500 µl dung dịch D và 3,6 µl -mercaptoethanol. Đồng nhất mẫu, vortex trong 10 giây.
Sau đó cho thêm 50 µl sodium acetate 2 M, pH 4,0; 500 µl phenol bão hoà pH4,0; 100 µl chloroform.
Dùng micropipet trộn đều để đồng nhất mẫu, vortex 10 giây. Làm lạnh trên đá khoảng 15 phút.
Li tâm 13000 vòng/phút trong 20 phút ở 40C.
Hút khoảng 400 µl dịch nổi, thêm 400 µl ethanol + LiCl và giữ ở -200C trong 1 giờ.
Li tâm 13000 vòng/phút trong 20 phút, bỏ dịch nổi, thu tủa.
Rửa tủa bằng ethanol 75%, votex nhẹ, li tâm 9000 vòng/phút trong 2 phút, thu tủa (rửa 2 lần).
Hút bỏ dịch nổi, tủa làm khô tự nhiên trong không khí khoảng 45 phút. Hoà tan với 30 µl nước đã khử DEPC.
Định lƣợng RNA bằng quang phổ kế
Đo độ tinh sạch và hàm lượng RNA sau khi ly trích bằng quang phổ kế (model HP 8453) ở bước sóng 230 nm, 260 nm và 280 nm
Cách tiến hành: Curvet được rửa sạch 2 lần với nước đã khử DEPC. Hút 995 µl nước đã khử DEPC cho vào curvet, sau đó thêm 5µl mẫu → trộn đều → độ pha loãng 200 lần. Cuối cùng là đặt curvet vào máy để đo OD.
Độ tinh sạch của RNA được tính bằng tỉ số OD260nm /OD280nm và tỉ số OD260nm /OD230nm . Tỉ số OD260nm/OD280nm đạt 1,8-2,0 thì xem như RNA ly trích tương đối sạch. Tỉ số này sẽ thấp hơn khi nhiễm protein hay phenol. Tỉ số OD260nm/OD230nm đạt 1,5-2,0 coi như RNA ít tạp nhiễm, tỉ số này thấp hơn khi bị nhiễm guanidium thicyocyanate trong những bước kết tủa.
Hàm lượng RNA được tính theo công thức:
Hàm lƣợng RNA (ng/µl) = WL1 (OD260nm)* 40 ng/µl* Độ pha loãng
Một đơn vị OD260nm tương ứng với một nồng độ 40 ng/µl cho một dung dịch RNA hay DNA sợi đơn (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, 1998)
RNA ly trích có thể dùng để thực hiện tiếp phản ứng RT-PCR.
Kiểm tra RNA bằng điện di biến tính:
Xem kết quả có xuất hiện 2 band chuẩn 18S, 28S.
Nếu kết quả có xuất hiện 2 band 18S và 28S thì quá trình ly trích RNA thành công. Tiến hành điện di:
Chuẩn bị gel 1,5%:
Cân 0,3 g agarose, thêm vào 14,4 ml nước đã khử DEPC. Nấu trong 2 phút ở 650W
Để nguội đến 550
C, cho thêm vào: 2 ml MOPS 10X 3,6 ml formaldehyde
Lắc đều, đổ gel và chờ gel nguội khoảng 45 phút. Chuẩn bị RNA: Mỗi phản ứng cần: 10X MOPS 2 µl Formaldehyde 4 µl Formamide 10 µl RNA 10 µl Ủ ở 650C trong 15 phút. Ủ đá 15 phút.
Cho thêm 2 µl loadingdye trộn đều và bơm vào giếng trên gel. Điện di 30V trong 180 phút hoặc 50V trong 90 phút.
Sau đó lấy gel ra đem nhuộm ethium bromide trong 30 phút, chụp Cuối cùng là chụp gel và đọc kết quả.
3.5.3.Phản ứng RT-PCR (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Quy trình RT-PCR được thực hiện theo dẫn liệu của Paton và ctv (2000).
Cặp mồi của gen NS5B:
Forward: 5’-GAC ACT AG(TC) GCA GGC AA (TC) AG-3’ (11138-11157) Reverse: 5’-AGT GGG TTC CAG GA(GA) TAC AT-3’ (11586-11567)
→ Kích thước đoạn gen là 449 bp.
Cặp mồi này sử dụng phát hiện phạm vi rộng những chủng virus DTH phân lập (Paton, 2000). Những thử nghiệm dựa trên sự khuếch đại gen NS5B được sử dụng rộng rãi trong việc phân loại di truyền, do đó phương pháp RT-PCR dựa trên đoạn gen NS5B thích hợp là phương pháp chẩn đoán tiêu chuẩn hoá để đi sâu xác định chính xác chủng virus DTH.
Quy trình RT-PCR: chuẩn bị 50 µl hổn hợp phản ứng RT-PCR với các thành phần
phản ứng như sau:
Bảng 3. 1: Thành phần phản ứng RT-PCR
Tên hoá chất Nồng độ cuối
Rnase- free water
Buffer PCR 1X MgCl2 6 mM dNTPs 0,4 mM Mồi xuôi 0,1 µM Mồi ngược 0,1 µM Triton X-100 0,2% Taq polymerase 2,5 UI Rnasin 10UI MMLreverse trancriptase 100 UI RNA mẫu Tổng thể tích 50µl
Buffer 10X gồm: 500 mM KCl, 100 mM Tris-Cl (pH 8,3 ở nhiệt độ phòng), 15 mM MgCl2
Quy trình nhiệt đối với gen NS5B:
Giai đoạn RT: 500C/30 phút, 950C/3phút.
Giai đoạn PCR: 35 chu kì (940C/1phút, 520C/1phút,720C/1phút) Bước kéo dài chuỗi: 720C/10phút
Điện di trên gel
Cách tiến hành:
Pha loãng dung dịch TBE 50X để có dung dịch TBE 0,5X.
Pha gel agarose với nồng độ 2%: Cân 0,25 g agarose cho vào 12,5 ml dung dịch TBE 0,5X. Đun sôi bằng lò viba cho agarose tan thật đều.
Để nguội đến 50-550C, đổ vào khuôn, cài lược vào. Chờ 30 phút để agarose đông.
Gở lược ra rồi đặt bảng gel vào buồn điện di cho đúng chiều. Cho dung dịch TBE ngập gel.
Load mẫu vào các giếng với tỷ lệ 2 μl loading dye và 6 μl mẫu.
Chạy điện di ở điều kiện 100 V, 400 mA trong 20 phút hoặc 60 V, 250 mA, thời gian khoảng 60 phút nếu chạy chung với thang chuẩn.
Nhuộm ethidium bromide khoảng 20 phút.
Gel sau khi nhuộm sẽ được chụp bằng tia tử ngoại UV. Nếu mẫu có sản phẩm thì băng sản phẩm sẽ phát sáng dưới dạng vạch trên gel điện di. Độ đậm nhạt của băng điện di phản ánh độ nồng độ cao hay thấp của sản phẩm RT- PCR thu được.
Đọc kết quả điện di
Gen NS5B với sản phẩm thu được là băng điện di có kích thước khoảng 449 bp.
3.6. XỬ LÝ SỐ LIỆU
Số liệu dạng liên tục được phân tích bằng trắc nghiệm F. So sánh tỉ lệ bằng Chi bình phương.
Chương 4 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. KẾT TỦA RNA Ở CÁC NỒNG ĐỘ LICL KHÁC NHAU
Chúng tôi thực hiện ly trích RNA từ mẫu lách dựa theo quy trình của Chomeszynski và Sacchi (1987) và thu tủa RNA bằng ethanol 100% kết hợp với LiCl ở các nồng độ 1,0 M; 1,5 M; 2,0 M; 2,5 M. Kết quả thu được ở bảng 4.1.
Bảng 4. 1: Tỉ số OD và hàm lƣợng RNA ở các nồng độ LiCl Chỉ tiêu Nồng độ LiCl p 1,0 M 1,5 M 2,0 M 2,5 M Tỉ số OD 1,89 ± 0,2 1,99 ± 0,2 2,08 ± 0,2 2,46 ± 0,2 0,23 Hàm lượng RNA (µg/µl) 1,45 ± 0,2 1,61 ± 0,2 1,29 ± 0,2 1,07 ± 0,2 0,2 Số mẫu 5 5 5 5 1,89 1,45 1,99 1,61 2,08 1,29 2,46 1,07 0 0,5 1 1,5 2 2,5 1M 1,5M 2M 2,5M Tỉ số OD Hàm lượng RNA (µg/µl)
Biểu đồ 4.1: Tỉ số OD và hàm lƣợng RNA ở các nồng độ LiCl
Kết quả bảng 4.1 cho thấy độ tinh sạch và hàm lượng RNA thu được ở các nồng độ LiCl khác nhau không có sự khác biệt có ý nghĩa về phương diện thống kê
(P > 0,05). Tuy nhiên, sự khác biệt ở thí nghiệm này là sản phẩm RT-PCR thu được, thể hiện ở hình 4.1.
Hình 4.1: Sản phẩm RT-PCR của mẫu đƣợc kết tủa ở các nồng độ LiCl
Chú thích:
L: Thang chuẩn (100 bp)
1: Kết tủa RNA bằng ethanol 100%
2: Kết tủa RNA bằng ethanol 100% + LiCl 1,0 M 3: Kết tủa RNA bằng ethanol 100% + LiCl 1,5 M 4: Kết tủa RNA bằng ethanol 100% + LiCl 2,0 M 5: Kết tủa RNA bằng ethanol 100% + LiCl 2,5 M
Từ kết quả thu được chúng tôi nhận xét rằng sản phẩm khuếch đại ở các nồng độ LiCl khác nhau thì khác nhau, băng sản phẩm điện di thu được rõ dần và lượng tạp chất giảm dần theo nồng độ LiCl tăng dần. Điều này có thể được giải thích do chất lượng RNA ly trích. Từ hình 4.1 nhận thấy sản phẩm ở giếng thứ 5 (LiCl 2,5 M) rõ nhất và tạp ít nhất và từ biều đồ 4.1 nhận thấy độ tinh sạch mẫu cao nhất ở nồng độ LiCl 2,5 M. Điều này có thể giải thích RNA thu được ở nồng độ LiCl cao ít lẫn tạp hơn. Vì vậy chúng tôi chọn nồng độ LiCl 2,5 M để kết tủa RNA trong quá trình ly trích mẫu.
449 bp
4.2. THAY ĐỔI NỒNG ĐỘ TAQ TRONG PHẢN ỨNG
Ở thí nghiệm này chúng tôi thực hiện phản ứng RT-PCR với 2 nồng độ Taq
khác nhau là 2,0 UI và 2,5 UI, mỗi nồng độ được thực hiện 5 phản ứng. Kết quả thu được ở bảng 4.2.
Bảng 4.2: Kết quả RT-PCR ở 2 nồng độ Taq
Nồng độ Taq Kết quả RT-PCR
Số mẫu thực hiện Số mẫu thành công Tỉ lệ thành công