1.5 .2Lai tạo
4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
2.1 Công thức pha dung dịch tạo một gel
Hoá chất (1 GEL) 12 % gel phân tách (ml) 5 % gel cô mẫu (ml)
Nước cất 1,6 0,68 30 % Acrylamide 2 0,17 1,5 M Tris H (pH = 8,8) 1,3 - 1 M Tris HCl ( pH = 6,8) - 0,13 10% SDS 0,1 0,04 10% Amonium persulfate 0,05 0,01 TEMED 0,002 0,001
Bước 3: Tiến hành điện di
- Bơm 10 μl dung dịch ly trích protein vào mỗi giếng của gel.
- Cho 1 giọt chất chỉ thị màu Bromophenol vào mỗi gel.
- Chỉnh đến 20 V đối với gel cô mẫu và 60 V đối với gel phân tách.
- Ngừng điện di khi chất chỉ thị cách đáy gel từ 0,5-1 cm.
Bước 4: Nhuộm và rửa gel
- Gel được nhuộm bằng dung dịch Cooomassie Brilliant Blue R-250 0,2%, lắc nhẹ trong 30-45 phút.
- Loại bỏ thuốc nhuộm. - Rửa gel bằng Autowave.
Bước 5: Đọc kết quả và bảo quản gel
* Phương pháp xác định hàm lượng protein
Tiến hành theo phương pháp Lowry O.H. (1951).
Bước 1: Chuẩn bị dung dịch ly trích
- Dung dịch B (CuSO4 0,1%). - Dung dịch C (A:B = 45 :5). - Dung dịch Folin 1 N
Bước 2: Chuẩn bị mẫu
- Cân 10 mg bột gạo + 1 ml NaOH 0,1 N. - Lắc ít nhất 2 giờ hay để qua đêm.
Bước 3: Pha loãng mẫu và đo
- Ly tâm mẫu 14.000 vòng/phút trong 3 phút.
- Hút 50 μl mẫu + 5 ml dung dịch C. Đối với mẫu blank, thay dung dịch ly trích bằng 50 μl NaOH 0,1 N.
- Trộn đều và để yên trong 10 phút.
- Thêm 50μl Folin 1 N, trộn đều và để yên trong 30 phút.
- Lắc đều mẫu, sau đó cho vào cuvette và đo ở bước sóng 580 nm.
Bước 4: Dựng đường chuẩn và tính kết quả
- Pha dung dịch gốc Bovine serum albumin (BSA). - Đường chuẩn có dạng:
Y = aX + b
- Trong đó Y: Độ hấp thụ OD. X: Lượng protein có trong mẫu đem đo.
- Hàm lượng protein được tính theo cơng thức: Cơng thức: 100
100 %P X
*Phương pháp xác định hàm lượng Amylose
Tiến hành theo phương pháp Cagampang and Rodriguez (1980).
Bước 1: Chuẩn bị dung dịch
- Ethanol 95%. - HCl 30%. - NaOH 1N.
Bước 2: Chuẩn bị mẫu
- Cân 50 mg bột gạo đãđược nghiền mịn, cho vàoống 50 ml.
- Thêm 0,5 ml ethanol 95%, lắc nhẹ cho tan đều.
- Thêm 9,5 ml NaOH 1N. Đun sôi trong 10 phút và lắc đều. - Để qua đêmở nhiệt độ phịng.
Bước 3: Pha lỗng vàđo mẫu
- Rút 100 μl dịch trích cho vào bìnhđịnh mức 25 ml (đối với mẫu thử thay dịch trích bằng 100 μl NaOH 1 N).
- Thêm nước cất khoảng½ bình, lắc đều. - Thêm 250μl HCl 30%, lắc đều.
- Thêm 250μl dung dịch Iod, lắc đều.
- Thêm nước cất đến vạch định mức.
- Chuyển sang ống 50 ml, lắc đều và để yên trong 30 phút.
- Lắc đều trước khi cho vào cuvette. Đo đ ộ hấp thụ ở bước sóng 580 nm.
Bước 4: Dựng đường chuẩn và tính kết quả
- Đường chuẩn có dạng: Y = aX + b
Trong đó Y: Độ hấp thụ OD
X: Lượng amylose có trong mẫu đem đo (mg/ml).
- Tính hàm lượng amylose theo công thức: 100
2 %Amylose X
- Đánh giá hàm lượng amylose theo thang đánh giá của IRRI, 1988 (Bảng 2.2)