3.1.1 Thời gian và địa điểm
Thời gian thực hiện đề tài từ ngày 02/02/2009 đến 03/05/2009
Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm Bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm, khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, trường Đại Học Cần Thơ.
3.1.2 Nguyên liệu
Nếp trắng được mua ở chợ Xuân Khánh - Thành Phố Cần Thơ, chọn loại không lẫn các loại nếp khác, có mùi thơm đặc trưng.
Enzyme α-amylase ở dạng thương mại được mua ở cửa hàng hóa chất - Thành phố Cần Thơ.
3.1.3 Hóa chất
Dung dịch acid acetic 0,2M
Dung dịch natri acetate 0,2M
NaOH 0,1N, HCl
Pb(CH3COO)2 30%, Na2SO4 bão hòa
Fehling A, fehling B, metyl xanh
KI, iod khan
Acid citric dùng để chỉnh pH
Tinh bột tinh khiết
3.1.4 Dụng cụ
Máy nghiền
Cân kỹ thuật
Buret, pipet, micropipette, bình tam giác
Nồi ủ nhiệt
pH kế
Bếp điện
Các dụng cụ cần thiết khác của phòng thí nghiệm: nhiệt kế, ống đong…
Xác định Vmax, Km theo phương pháp Lineweaver – Burk.
Các số liệu được xử lý bằng chương trình thống kê StatGraphics – Plus 4.0 và sử dụng phần mềm Excel để vẽ đồ thị.
3.3 BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM
3.3.1 Thí nghiệm 1: Xác định nhiệt độ, pH tối ưu của enzyme α-amylase trongquá trình thủy phân nguyên liệu nếp trắng. quá trình thủy phân nguyên liệu nếp trắng.
Mục đích
Xác định được điều kiện tối ưu về pH và nhiệt độ cho quá trình thủy phân của α- amylase trên nguyên liệu nếp trắng.
Chuẩn bị mẫu
- Nguyên liệu nếp trắng đã được nghiền nhỏ. - Enzyme α-amylase
Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí với 2 nhân tố là nhiệt độ và pH với 2 lần lặp lại. Nhân tố A: pH được khảo sát ở 5 mức độ, từ 5,5 đến 7,5.
A1: 5,5 A3: 6,5 A5: 7,5
A2: 6,0 A4: 7,0
Nhân tố B: nhân tố nhiệt độ (0C), khảo sát ở 3 mức độ, từ 800C đến 900C. B1: 80
B2: 85 B3: 90
Tổng số nghiệm thức:5 x 3 = 15 nghiệm thức. Tổng số mẫu thí nghiệm: 15 x 2 = 30 mẫu. Thí nghiệm được bố trí theo sơ đồ sau:
B1 A1B1 A2B1 A3B1 A4B1 A5B1
B2 A1B2 A2B2 A3B2 A4B2 A5B2
B3 A1B3 A2B3 A3B3 A4B3 A5B3
Tiến hành thí nghiệm
Sơ đồ tiến hành thí nghiệm
Chỉ tiêu theo dõi: xác định lượng đường khử tạo thành.
3.3.2 Thí nghiệm 2: Xác định hằng số Km của enzyme α-amylase trong quátrình thủy phân nguyên liệu nếp trắng. trình thủy phân nguyên liệu nếp trắng.
Mục đích
Xác định ảnh hưởng của nồng độ cơ chất (nếp trắng) lên hoạt tính của enzyme α- amylase thông qua hằng số Km.
Chuẩn bị mẫu
- Nếp trắng nghiền nhỏ - Enzyme α-amylase
Bố trí thí nghiệm
Mẫu nếp trắng xay nhỏ Bổ sung nước (1 nếp : 4 nước)
Chỉnh pH theo các mức pH khác nhau
Nâng nhiệt đến nhiệt độ cần khảo sát rồi bổ sung 0,3% enzyme α-amylase vào dung dịch
Giữ mẫu 15 phút Chuẩn đường khử
Nhân tố C: Nồng độ tinh bột nếp (%)
C1: 5 C3: 15 C5: 25 C7: 35
C2: 10 C4: 20 C6: 30
Tổng số mẫu thí nghiệm: 7 mẫu. Tiến hành thí nghiệm
Thí nghiệm được tiến hành theo sơ đồ sau:
Chỉ tiêu theo dõi: Xác định lượng đường khử tạo thành
CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 ẢNH HƯỞNG CỦA pH VÀ NHIỆT ĐỘ LÊN HOẠT TÍNH ENZYME α-AMYLASE THỦY PHÂN NGUYÊN LIỆU NẾP TRẮNG AMYLASE THỦY PHÂN NGUYÊN LIỆU NẾP TRẮNG
Tài liệu tham khảo cho thấy, khả năng hoạt động xúc tác phản ứng của enzyme phụ thuộc rất nhiều vào pH và nhiệt độ. Mỗi enzyme chỉ thể hiện hoạt tính cao nhất của
Mẫu nếp trắng xay nhỏ Bổ sung nước theo tỷ lệ đã bố trí
Chỉnh pH 6,5
Nâng nhiệt đến 850C rồi bổ sung 0,5% enzyme α-amylase vào dung dịch
Giữ mẫu 30 phút Chuẩn đường khử
nó ở một giá trị pH nhất định và ở một nhiệt độ nhất định.. Chính vì vậy, thí nghiệm này được thực hiện với mục đích là tìm ra pH và nhiệt độ tối thích cho enzyme α- amylase hoạt động thủy phân tinh bột nếp trắng.
Trong thí nghiệm này, enzyme α-amylase được sử dụng với nồng độ là 0,3% và thời gian thủy phân là 15 phút. Dung dịch sau khi thủy phân đem phân tích hàm lượng đường khử. Thí nghiệm đươc tiến hành với hai nhân tố và hai lần lặp lại. Kết quả thí nghiệm được thể hiện trong bảng 4.1 và hình 4.1.
Bảng 4.1: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính enzyme α- amylase đối với nguyên liệu nếp trắng
pH Nhiệt độ (0C) 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 Trung bình 80 4,186 4,719 4,815 4,412 4,028 4,431b 85 4,334 5,015 5,058 4,486 4,125 4,604a 90 4,063 4,530 4,678 4,283 3,950 4,283c Trung bình 4,194c 4,754a 4,850a 4,363b 4,034d
Số liệu trong bảng là giá trị trung bình của 2 lần lặp lại.
Các giá trị trung bình có cùng chữ cái đi kèm a, b, c… trong cùng một cột thì không khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5 %.
Các giá trị trung bình có cùng chữ cái đi kèm a, b, c… trong cùng một hàng thì không khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5 %.
Hình 4.1: Đồ thị biễu diễn ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính enzyme α- amylase đối với nguyên liệu nếp trắng.
Việc thay đổi pH và nhiệt độ phản ứng có ảnh hưởng đến khả năng thủy phân của enzyme α-amylase.
Trong những thí nghiệm nghiên cứu về ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme, các nhà khoa học cho thấy hiện tượng: nếu tăng hoặc giảm giá trị pH tới một điểm xác định nào đó, vận tốc phản ứng enzyme sẽ tăng dần và đạt đến điểm cực đại. Giá trị pH mà ở đó vận tốc enzyme đạt cực đại gọi là pH tối ưu cho hoạt động enzyme. Vượt quá giới hạn pH này hoạt động enzyme sẽ giảm (Nguyễn Đức Lượng, 2002). Khi thay đổi pH của dịch nếp từ 5,5 đến 7,5 để khảo sát hoạt tính của enzyme α- amylase trên nguyên liệu nếp trắng thì ở bất kỳ nhiệt độ khảo sát nào, hoạt tính của enzyme α-amylase cũng thay đổi theo.
Kết quả thống kê ở bảng 4.1 và đồ thị hình 4.1 cho thấy pH tối thích cho enzyme α- amylase hoạt động trên nguyên liệu nếp trắng nằm trong khoảng 6,0 ÷ 6,5. Xét về mặt thống kê ở các mức pH khác nhau từ 5,5 đến 7,5 thì hàm lượng đường khử sinh ra đều khác biệt có ý nghĩa ở mức ý nghĩa 5% chỉ có pH 6,0 và 6,5 thì hàm lượng đường khử sinh ra không khác biệt ý nghĩa ở mức ý nghĩa 5%, nhưng ở pH 6,5 hàm lượng đường khử sinh ra cao hơn ở pH 6,0 nên chọn pH tối ưu cho enzyme α- amylase hoạt động thủy phân tinh bột nếp trắng là 6,5.
Ở pH cao hơn hoặc thấp hơn pH tối ưu, hàm lượng đường sinh ra đều giảm. Do đó, có thể nói rằng pH có ảnh hưởng rất mạnh mẽ đến hoạt tính enzyme. Khi thay đổi pH môi trường sẽ làm thay đổi khả năng ion hóa của enzyme và cơ chất do đó sẽ
3.5 4 4.5 5 5.5 5.5 6 6.5 7 7.5 pH H àm lư ợn g đ ườ ng (% ) 80 85 90 800C 850C 900C
làm ảnh hưởng đến khả năng tạo phức hợp ES làm giảm vận tốc phản ứng enzyme. Vì thế phải chọn pH tối ưu cho enzyme hoạt động để đạt được hiệu quả cao nhất. Bên cạnh ảnh hưởng của pH thì nhiệt độ cũng có ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme α-amylase. Theo Nguyễn Đức Lượng (2002), trong các phản ứng sinh học, khi nhiệt độ tăng thì khả năng xúc tác của enzyme sẽ tăng. Nhưng tốc độ phản ứng enzyme không phải lúc nào cũng tỷ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng. Khả năng tăng của tốc độ phản ứng có một giới hạn nhất định. Quá giới hạn nhiệt độ đó, phản ứng enzyme sẽ giảm và giảm rất nhanh.
Kết quả thống kê ở bảng 4.1 và đồ thị hình 4.1 cho thấy hàm lượng đường khử sinh ra sẽ tăng khi tăng nhiệt độ đến 850C và sẽ giảm nếu tiếp tục tăng nhiệt độ đến 900C (có sự khác biệt ý nghĩa ở 3 mức nhiệt độ 80; 85 và 900C).
Kết quả này hoàn toàn phù hợp với lý thuyết. Vì bản chất của protein thường không bền nhiệt. Khi tăng nhiệt độ trong giai đoạn đầu của phản ứng enzyme sẽ làm tăng khả năng tạo cấu trúc không gian của enzyme cho phù hợp với cơ chất. Khi vượt quá giới hạn về nhiệt độ, cấu trúc không gian của trung tâm hoạt động trong enzyme không còn phù hợp với cấu trúc không gian của cơ chất nữa, khi đó hoạt tính của enzyme sẽ giảm dần và dẫn đến triệt tiêu (Nguyễn Đức Lượng, 2002). Do đó, ở nhiệt độ 850C thì hàm lượng đường khử sinh ra là nhiều nhất nên chọn nhiệt độ tối thích cho enzyme α-amylase hoạt động thủy phân nguyên liệu nếp trắng là 850C. Điều này cũng phù hợp với đặc tính của enzyme α-amylase có nguồn gốc từ vi khuẩnBacillus licheniformis là chịu được nhiệt độ cao.
Kết quả thí nghiệm của các đề tài khảo sát pH và nhiệt độ tối thích cho enzyme hoạt động thủy phân trên các nguyên liệu tinh bột tinh khiết, nếp trắng, nếp than và gạo nhìn chung thì không khác nhau. Kết quả khảo sát pH và nhiệt độ tối ưu cho enzyme α-amylase thủy phân tinh bột nếp than (Vy - luận văn tốt nghiệp thạc sĩ, 2009), tinh bột gạo (Lê Trung Hiếu - luận văn tốt nghiệp thạc sĩ, 2009), và tinh bột tinh khiết (đề tài đã khảo sát trong thí nghiệm thăm dò) đều là 6,5 và 850C. Không có sự khác biệt trong việc thủy phân của enzyme α-amylase đối với các nguyên liệu khác nhau là do trong những nguyên liệu này không có thành phần nào làm thay đổi điện tích bề mặt của enzyme hoặc làm biến tính protein trong enzyme. Do đó, các nguyên liệu này không làm ảnh hưởng đến pH và nhiệt độ hoạt động mạnh nhất của enzyme α-amylase.Vì thế, pH tối ưu và nhiệt độ tối ưu cho enzyme α-amylase hoạt động trên các nguyên liệu tinh bột tinh khiết, gạo, nếp trắng, nếp than đều giống nhau.
4.2 KẾT QUẢ KHẢO SÁT ĐỘNG HỌC CỦA ENZYMEα-AMYLASETHỦY PHÂN NGUYÊN LIỆU NẾP TRẮNG THỦY PHÂN NGUYÊN LIỆU NẾP TRẮNG
Thí nghiệm được tiến hành theo sơ đồ đã bố trí ở phần bố trí thí nghiệm với mục tiêu là xác định độ nhạy và tốc độ cực đại của enzyme α-amylase, từ đó so sánh độ nhạy và tốc độ cực đại của enzyme α-amylase trên nguyên liệu nếp trắng với các loại nguyên liệu khác như nếp than (Nguyễn Thị Giang Thanh - Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ, 2008), gạo (Lê Tung Hiếu – Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ, 2009) và tinh bột tinh khiết (đề tài đã khảo sát). Trong thí ngiệm này, nồng độ enzyme được sử dụng là 0,5% và thời gian thủy phân là 30 phút thu được kết quả như sau:
Bảng 4.2: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ nếp trắng lên hoạt tính enzyme α- amylase. Nếp trắng (%) 5 10 15 20 25 30 35 Đường khử (%) 1,320 2,430 3,360 4,167 4,536 4,636 4,795 ) 30 / (% ] [ ] [ * max phút S K S V V m 1,674 2,730 3,457 3,988 4,392 4,711 4,969
Hình 4.2: Đồ thị Michaelis – Menten biễu diễn ảnh hưởng tỷ lệ nếp trắng sử dụng đến hoạt tính của enzyme α-amylase.
Kết quả ở bảng 4.2 và đồ thị hình 4.2 cho thấy khi tăng nồng độ tinh bột thì hàm lượng đường khử sinh ra cũng tăng theo nghĩa là vận tốc phản ứng tăng. Vận tốc phản ứng tăng nhanh khi tăng nồng độ tinh bột từ 5% đến 20%. Khi tiếp tục tăng nồng độ tinh bột lên 25%, 30% và 35% thì vận tốc phản ứng cũng tiếp tục tăng song tốc độ tăng chậm hơn so với trước. Điều này có thể giải thích là do trong giai đoạn đầu khi nồng độ cơ chất thấp thì tốc độ phản ứng enzyme sẽ phụ thuộc tuyến tính
0 1 2 3 4 5 6 0 10 20 30 40 50 60 Nồng độ tinh bột nếp (%) Hà m lư ợn g đư ờn g kh ử (% )
với nồng độ cơ chất và đạt đến điểm cực đại nghĩa là toàn bộ enzyme kết hợp được với cơ chất. Khi tiếp tục tăng nồng độ cơ chất lớn hơn nữa thì tốc độ phản ứng enzyme sẽ không tăng đáng kể do nồng độ tinh bột quá cao sẽ ảnh hưởng đến độ nhớt của dung dịch gây khó khăn cho hoạt động xúc tác của enzyme, cũng có thể do giai đoạn này các chất cạnh tranh kết hợp với enzyme nên hàm lượng đường sinh ra giảm.
So sánh Vmax, Km của thí nghiệm này với Vmax, Km của enzyme α-amylase đối với nguyên liệu nếp than (Nguyễn Thị Giang Thanh – Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ, 2008) và gạo (Lê Trung Hiếu – Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ, 2009).
Các thông số động học Vmax, Km được xác định theo bằng cách vẽ đồ thị theo phương pháp Lineawever – Burk.
Hình 4.3: Đồ thị biễu diễn sự phụ thuộc 1/V = 1/f([S]) của quá trình thủy phân tinh bột nếp trắng và gạo xúc tác bởi enzyme α-amylase.
(Nguồn số liệu gạo: Lê Trung Hiếu – Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ, 2009 (phụ lục B.3))
Dựa vào phương trình hồi qui của đồ thị hình 4.3 theo từng nguyên liệu ta tính được các thông số:
Nếp trắng: Vmax= 7,3926% trong thời gian 30 phút Km = 17,0755%
Gạo: Vmax = 8,5815% trong thời gian 20 phút Km = 13,1391% y = 30.622x + 2.3306 R2 = 0.9979 y = 69.284x + 4.0586 R2 = 0.9453 -5 0 5 10 15 20 -0.15 -0.1 -0.05 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 1/[S] 1/ V Nếp trắng Gạo 0586 , 4 1 284 , 69 1 S V R2 = 0,9453 9979 , 0 3306 , 2 1 622 , 30 1 2 R S V
So sánh hai hằng số Michaelis của enzyme α-amylase với nếp trắng và gạo ta thấy Km của enzyme α-amylase với nếp trắng (Km = 17,0755%) lớn hơn với gạo (Km=13,1391%). Điều này chứng tỏ ái lực của enzyme α-amylase với nếp trắng nhỏ hơn gạo. Có sự khác nhau này là do trong thành phần của tinh bột nếp trắng tỷ lệ amylopectin cao hơn gạo, mà enzyme α-amylase không phân cắt được liên kết α- 1,6-glycoside của mạch amylopectin nên kìm hãm vận tốc phản ứng của enzyme. Do đó, ái lực của enzyme α-amylase với nếp trắng nhỏ hơn đối với gạo.
Hình 4.4: Đồ thị biễu diễn sự phụ thuộc 1/V = 1/f([S]) của quá trình thủy phân tinh bột nếp trắng và nếp than xúc tác bởi enzyme α-amylase.
(Nguồn số liệu nếp than: Nguyễn Thị Giang Thanh – Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ, 2008 (phụ lục B.2))
Dựa vào phương trình hồi qui của đồ thị hình 4.4 theo từng nguyên liệu ta tính được các thông số:
Nếp trắng: Vmax= 7,3926% trong thời gian 30 phút Km = 17,0755%
Nếp than: Vmax = 9,4262% trong thời gian 30 phút Km = 20,7076%
So sánh hai hằng số Michaelis của enzyme α-amylase với nếp trắng và nếp than ta thấy Km của enzyme α-amylase với nếp trắng (Km = 17,0755%) nhỏ hơn với nếp than (Km= 20,7076%). Điều này chứng tỏ độ nhạy của enzyme α-amylase với nếp trắng lớn hơn so với nếp than. Có sự khác nhau này là do trong thành phần của nếp
y = 65.904x + 3.1826 R2 = 0.9896 y = 69.284x + 4.0586 R2 = 0.9453 -5 0 5 10 15 20 -0.1 -0.05 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 1/[S] 1/ V Nếp trắng Nếp than 0586 , 4 1 284 , 69 1 S V R2 = 0,9453 9896 , 0 1826 , 3 1 904 , 65 1 2 R S V
than có hợp chất màu anthocyanine. Hợp chất anthocyanine là mono – hay diglucozit do gốc đường glucoza, galactoza hoặc ramnoza kết hợp với gốc aglucon có màu gọi là anthocyanine (Lê Ngọc Tú, 2004). Hợp chất này gây khó khăn cho enzyme α-amylase phân cắt tinh bột thành đường. Do đó, ái lực của enzyme α- amylase với tinh bột nếp trắng lớn hơn với nếp than.
Đồ thị biễu diễn sự phụ thuộc 1/V = 1/f([S]) của quá trình thủy phân tinh bột tinh khiết xúc tác bởi enzyme α-amylase được thể hiện ở hình 4.4.