Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.3.1.Nghiên cứu lựa chọn cặp mồ
để khảo sát tắnh ựặc hiệu của các cặp mồi dùng chẩn ựoán SBV trên ựàn ong mật, chúng tôi sử dụng 5 cặp mồi ựã ựược Grabensteiner et al., công bố năm 2001 gồm SB1f-2r, SB 6f-7r, SB 9f-10r, SB 11f-12r, SB 14f-15r.
Bảng 3.3: Danh sách các cặp mồi sử dụng (Grabensteiner et al., 2001)
Tên mồi Trình tự Vị trắ
Nucleotid
Kắch thước
SB1f ACC AAC CGA TTC CTC AGT AG 221Ờ240
SB2r CCT TGG AAC TCT GCT GTG TA 689Ờ708 487
SB6f GTG GCA GTG TCA GAT AAT CC 2351Ờ2370
SB7r GTC AGA GAA TGC GTA GTT CC 3166Ờ3185 834
SB9f ACC GTT GTC TGG AGG TAG TT 3856Ờ3875
SB10r GCC GCA TTA GCT TCT GTA GT 4104Ờ4123 267
SB11f ATA TAC GGT GCG AGA ACT GC 5707Ờ5726
SB12r CTC GGT AAT AAC GCC ACT GT 6585Ờ6604 897
SB14 AAT GGT GCG GTG GAC TAT GG 8038Ờ8057
SB15 TGA TAC AGA GCG GCT CGA CA 8616Ờ8635 597
Thắ nghiệm nhằm tìm ra cặp mồi có ựộ ựặc hiệu cao ựể phát hiện virus Sacbrood từ các mẫu bệnh phẩm Ong mật thu thập ựược trên ựịa bàn Hà Nộị ựể thực hiện việc này, chúng tôi ựã sử dụng 5 cặp mồi (Grabensteiner et al.,2001). để giảm chi phắ các cặp mồi lần lượt ựược sử dụng ựể tiến hành phản ứng RT-PCR theo quy trình One-step ựược mô tả trong phần phương pháp. Mỗi cặp mồi ựồng thời ựược sử dụng ựể làm mồi cho phản ứng phiên mã ngược tạo cDNẠ
Ban ựầu cả 5 cặp mồi ựược sử dụng ựể thử với mẫu RNA có biểu hiện dương tắnh ổn ựịnh (mẫu ựược chiết tách từ ấu trùng có triệu chứng bệnh rõ ràng và mẫu dương tắnh do trung tâm nghiên cứu và phát triển Ong nhiệt ựới cung cấp.
Hình 3.4: Kết quả kiểm tra tắnh ựặc hiệu của 5 cặp mồi với mẫu RNA tách từ ấu trùng biểu hiện dương tắnh.
M: DNA lađer 1kb; 1: Cặp mồi SB1f-2r; 2:Cặp mồi SB6f-7r; 3: Cặp mồi 9f-10r; 4: Cặp mồi 1f1-12r; 5: Cặp mồi 14f-15r
Kết quả hình 3.4 cho thấy có 4 trên tổng số 5 cặp mồi cho kết quả có băng vạch và một kết quả rất mờ (với mồi SB11f-12r) thể hiện trên bản ựiện di sản phẩm PCR. Trong ựó có 2 cặp mồi SB1f-2r và SB 14f-15r cho kết quả tốt thể hiện ở vạch rõ nét trên ảnh ựiện di và kắch thước sản phẩm phù hợp với lý thuyết (487bp với cặp mồi SB 1f-2r và 597 bp với cặp mồi SB 14f-15r). Các cặp mồi SB 6f-7r, SB 9f-10r cho vạch kết quả mờ hơn, ựiều này chứng tỏ mức ựộ bắt cặp của các cặp mồi này trong ựiều kiện phản ứng chưa caọ Riêng cặp mồi SB11f-12r thấy xuất hiện rật mờ sản phẩm trên băng ựiện dị Thắ nghiệm tương tự ựược tiến hành với các mẫu virus chiết từ ấu trùng và ong trưởng thành thu thập ựược trên ựịa bàn Hà Nộị
Ngoài ra, với cả 4 cặp mồi xuất hiện các vạch sản phẩm chắnh còn có các sản phẩm phụ. Kết quả này có sai khác so với công bố của Grabensteiner et al.,(2001 )
khi tiến hành xác ựịnh trên các ựàn ong Châu Âu, Ấn ựộ, Nam Phi, Nepan. điều này cho thấy có thể có sự sai khác ắt nhiều trong cấu trúc genome virus Sacbrood trên các ựàn ong thu thập tại Hà Nội, Việt Nam so với các ựàn ong do tác giả ựã công bố hoặc ựiều kiện phản ứng chưa tối ưu dẫn ựến việc bắt cặp không ựặc hiệu tạo sản phẩm phụ. ựể khẳng ựịnh chắc chắn ựiều này cần tiến hành các thắ nghiệm tiếp theo
về tối ưu hóa ựiều kiện phản ứng và giải trình tự genome ựể tiến hành so sánh.
Với 4 mẫu cho kết quả âm tắnh hoặc rất mờ ựối với cặp mồi SB 11-12 ựược tiếp tục tiến hành với cặp mồi SB1f-2r và SB14f-15r. Kết quả cho thấy có 5 trên tổng số 5 mẫu (gồm cả mẫu dương tắnh) có xuất hiện băng vạch với cặp mồi SB 14f-15r và 4 trên tổng số 5 mẫu (gồm cả mẫu dương tắnh) xuất hiện băng vạch với cặp mồi SB1f-2r.
Như vậy cặp mồi SB1f-2r cho kết quả tốt hơn và có tắnh ựặc hiệu cao hơn khi xác ựịnh virus Sacbrood.