2.2 .PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Nhĩm phương pháp định danh lồi Ơ đầu
Các mẫu Ơ đầu được định danh bằng phương pháp hình thái so sánh theo Phạm Hồng Hộ (1999) [7], Đỗ Tất Lợi (2005) [11] và trang web của Tropicos [183]. Đồng thời, các mẫu Ơ đầu cũng được xác định bằng phương pháp phân loại học phân tử dựa trên mã vạch DNA với trình tự nucleotide của vùng ITS và đoạn gen matK,
rpoC1, rpoB2.
P ươn p áp ìn t á so sán
Tại mỗi huyện, thu 5 cây Ơ đầu non và thu củ của 5 cây Ơ đầu khác đem trồng tại vườn Thực nghiệm khoa Sinh học, trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên. Đặc điểm hình thái của cây Ơ đầu được quan sát trực tiếp và mơ tả đặc
điểm rễ, thân lá, hoa, quả, hạt. Nhận diện mẫu cây Ơ đầu theo mơ tả của Phạm Hồng Hộ (1999) [7], Đỗ Tất Lợi (2004) [11] và tra cứu trên trang web của Tropicos [135] tại Bộ mơn Thực vật học, khoa Sinh học, trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên.
P ươn p áp p ân oạ ọ p ân tử
Phương pháp phân loại học phân tử dựa vào một số mã vạch DNA như vùng
ITS, đoạn gen matK, rpoC1, rpoB2. DNA tổng số được chiết xuất từ lá non của cây Ơ
đầu theo Saghai-Maroof và cs (1984) [101].
Trình tự nucleotide của các cặp mồi matK-F/matK-R, ITS-F/ITS-R, rpoC1-
F/rpoC1-R, rpoB2-F/rpoB2-R sử dụng trong PCR được tổng hợp theo Kress và cs
(2005) [164] được thể hiện ở bảng 2.1.
Chu trình nhiệt của PCR đối với hai cặp mồi rpoC1-F/rpoC1-R và rpoB2-
F/rpoB2-R là 94oC trong 1 phút, lặp lại 35 chu kỳ và ở mỗi chu kỳ, biến tính ở 94oC trong 30 giây, gắn mồi ở 53oC trong 40 giây và tổng hợp ở 72oC trong 40 giây; sau 35 chu kỳ là bước kết thúc ở 72oC trong 5 phút, lưu giữ ở 4oC [164]. Chu trình nhiệt của PCR đối với cặp mồi ITS-F/ITS-R là 94oC trong 4 phút, lặp lại 35 chu kỳ và ở mỗi chu kỳ, biến tính ở 94°C trong 30 giây, gắn mồi ở 57°C trong 60 giây và tổng hợp ở 72°C trong 60 giây; sau 35 chu kỳ là bước kết thúc ở 72°C trong 10 phút. Chu trình nhiệt của PCR với cặp mồi matK-F/matK-R là 94°C trong 1 phút, lặp lại 35 chu kỳ và ở mỗi chu kỳ, biến tính ở 94°C trong 30 giây, gắn mồi ở 53°C trong 40 giây và tổng hợp ở 72°C trong 40 giây; sau 35 chu kỳ là bước kết thúc ở 72°C trong 5 phút.
Các sản phẩm PCR được phát hiện bằng điện di gel agarose 1,0% và được tinh sạch bằng cách sử dụng kít GenJET PCR Purification của hãng Fermentas. Các trình tự nucleotide của vùng ITS và đoạn gen matK, rpoC1, rpoB2 đã được giải trình tự và phân tích bằng BLAST trong NCBI [164]. Trình tự DNA sau khi đọc được hiệu chỉnh với sự trợ giúp của phần mềm Bioedit v7.0.5.2. Xây dựng cây phát sinh chủng loại bằng phương pháp Maximum Likelihood trong phần mềm MEGA X [84].