CHƢƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. NGHIÊN CỨU TRÊN THỰC NGHIỆM
2.1.5. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.1.5.1. Nghiên cứu độc tính cấp
Độc tính cấp đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp Litchfield – Wilcoxon và hƣớng dẫn của WHO [128].
Trƣớc khi tiến hành thí nghiệm, cho chuột nhịn ăn qua đêm. Từng lô chuột nhắt trắng, mỗi lô 10 con, đƣợc uống thuốc thử theo liều tăng dần từ 15ml (tƣơng đƣơng 125 g dƣợc liệu/kg thể trọng/24 giờ) đến 75ml (tƣơng đƣơng 625g dƣợc liệu/kg thể trọng/24 giờ) với lƣợng thuốc uống hằng định mỗi lần 0,25ml/10g cân nặng, uống 3 lần mỗi lần cách nhau 2 giờ. Tìm liều cao nhất không gây chết chuột (0%), liều thấp nhất gây chết chuột hoàn toàn (100%) và các liều trung gian. Theo dõi tình trạng chung của chuột và số lƣợng chuột chết mỗi lô trong 72 giờ. Từ đó xây dựng đồ thị tuyến tính để xác định LD50 của thuốc thử. Sau đó tiếp tục theo dõi tình trạng chung của chuột đến hết ngày thứ 7 sau khi uống thuốc nghiên cứu.
2.1.5.2. Nghiên cứu độc tính bán trường diễn
Nghiên cứu độc tính bán trƣờng diễn thƣờng phải áp dụng đối với các thuốc có thời gian dùng dài. Thời gian thửđộc tính phụ thuộc vào thời gian sử dụng thuốc trên lâm sàng. Trong nghiên cứu của chúng tôi, do thời gian dùng thuốc trên lâm sàng dài 90 ngày nên chúng tơi thử độc tính bán trƣờng diễn trên thỏ trong thời gian 3 tháng với 2 liều thuốc thử. Liều 1 tƣơng đƣơng liều
dùng trên lâm sàng và liều 2 gấp 5 lần liều điều trị trên lâm sàng. Phƣơng pháp nhƣ sau:
Thỏđƣợc chia làm 3 lô, mỗi lô 10 con, mỗi con nhốt riêng một chuồng. - Lô chứng: uống nƣớc cất 2,5 ml/kg/ngày.
- Lô nghiên cứu 1: uống NĐL liều 4,8g dƣợc liệu/kg/ngày (liều có tác dụng tƣơng đƣơng trên ngƣời, tính theo hệ số 3).
- Lô nghiên cứu 2: Uống NĐL liều 24 g dƣợc liệu /kg/ngày (gấp 5 lần lô nghiên cứu 1).
Thỏ đƣợc uống dung môi hoặc thuốc thử trong 12 tuần, mỗi ngày một lần vào buổi sáng. Sau 12 tuần uống thuốc, thỏ đƣợc ngừng uống thuốc và theo dõi, đánh giá khảnăng gây ra độc tính của thuốc:
-Tình trạng chung, thể trọng của thỏ.
- Đánh giá chức phận tạo máu thông qua số lƣợng hồng cầu, thể tích trung bình hồng cầu, hàm lƣợng hemoglobin, hematocrit, số lƣợng bạch cầu, công thức bạch cầu và sốlƣợng tiểu cầu.
- Đánh giá mức độ hủy hoại tế bào gan qua hoạt độ enzym ALT, AST. - Đánh giá chức năng gan thông qua định lƣợng một số chất chuyển hố trong máu: bilirubin tồn phần, albumin và cholesterol toàn phần.
-Đánh giá chức năng thận thông qua định lƣợng nồng độ creatinin huyết thanh.
Các thông sốtheo dõi đƣợc kiểm tra vào trƣớc lúc uống thuốc, sau 4 tuần uống thuốc, sau 8 tuần và sau 12 tuần uống thuốc.
* Mô bệnh học:
- Sau 12 tuần uống thuốc, thỏđƣợc mổđểquan sát đại thể toàn bộcác cơ quan. - Kiểm tra ngẫu nhiên cấu trúc vi thể gan, thận của 30% số thỏở mỗi lô. Các xét nghiệm vi thể đƣợc thực hiện tại Trung tâm nghiên cứu và phát hiện sớm ung thƣ - Liên hiệp các hội khoa học và kỹ thuật Việt Nam.
2.1.5.3. Nghiên cứu tác dụng hạ glucose máu trên chuột nhắt trắng ĐTĐ typ 2 thực nghiệm
Gây mơ hình chuột ĐTĐ typ 2 thực nghiệm (theo phƣơng pháp của Fabiola và Srinivasan) [129].
Chuột đƣợc nuôi bằng chế độ ăn giàu lipid trong 8 tuần liên tục để tạo chuột béo phì có rối loạn lipid máu, gây hiện tƣợng tăng đề kháng insulin ở mơ, sau đó đƣợc tiêm STZ với liều 100mg/kg thể trọng (một liều duy nhất) để gây tình trạng phá huỷ tế bào β tuỵ dẫn tới giảm tiết insulin, tạo nên tình trạng tăng đề kháng insulin và thiếu hụt insulin máu tƣơng tự nhƣ cơ chế bệnh sinh ĐTĐ typ 2.
Bảng 2.2. Chế độ ăn D và D tính trên 100g thức ăn [129]
Chếđộ ăn bình thƣờng (%) (NFD)
Chếđộ ăn giàu chất béo (%)* (HFD) Protein 28,05 18,23 Chất béo no 12,14 42,89 Carbonhydrat 59,81 38,88 Tổng (gam) 100 100 Năng lƣợng (kcal) 467,5 614,5
*Siro fructose 55% (Daesang Corporation) được trộn thêm trong thức ăn của chuột nhắt c ch độ ăn D.
Cách tiến hành:
- Chuột đƣợc chia thành 5 lô, mỗi lơ 10 con, sau đó đƣợc lấy máu đi, định lƣợng glucose máu lần 1 khi bắt đầu tham gia nghiên cứu (nhịn đói qua đêm).
- Chuột lơ 1 đƣợc ni bằng chế độ ăn bình thƣờng NFD (normal fat diet). Chuột các lô từ 2 đến 5 đƣợc nuôi bằng chế độ ăn giàu chất béo HFD
(high fat diet) trong 8 tuần liên tục. Sau 8 tuần, tất cả chuột đƣợc lấy máu đi, định lƣợng glucose máu lần 2 (nhịn đói qua đêm).
- Tiêm STZ liều 100mg/kg cho các lô chuột từ 2 đến 5, lô 1 tiêm dung dịch đệm citrat pH 4.5 là dung môi pha STZ. 72 giờ sau tiêm STZ và dung dịch đệm, định lƣợng glucose máu lần 3, chọn các chuột ở lô tiêm STZ bịđái tháo đƣờng (có mức glucose lúc đói > 10 mmol/l) đƣợc tham gia nghiên cứu. Sau đó chuột đƣợc uống nƣớc cất, thuốc chứng hoặc thuốc thử với các liều khác nhau trong 2 tuần:
Lô 1: Chế độ NFD + uống nƣớc cất
Lô 2: Chế độ HFD + tiêm STZ liều 100mg/kg + uống nƣớc cất
Lô 3: Chếđộ HFD + tiêm STZ liều 100mg/kg + uống gliclazid liều 80 mg/kg Lô 4: Chế độ HFD + tiêm STZ liều 100mg/kg + uống NĐL liều 19,2g /kg/ngày ( tương đương liều lâm sàng).
Lô 5: Chế độ HFD + tiêm STZ liều 100mg/kg + uống NĐL liều 57,6 g dƣợc liệu /kg/ngày (gấp 3 liều lâm sàng).
Sau 2 tuần chuột đƣợc nhịn ăn qua đêm, lấy máu tồn phần từ đi chuột, tiến hành định lƣợng glucose máu tại các thời điểm To (chƣa uống thuốc), T1 (sau 1 tuần uống thuốc), Tc (sau 2 tuần uống thuốc), và chỉ số lipid máu tại thời điểm Tc (sau 2 tuần uống thuốc), đồng thời mổ chuột lấy gan, tụy để đánh giá cân nặng, đại thể, vi thể 30% số chuột mỗi lô.
Tuần
0 1 2
Uống dung môi và thuốc thửtƣơng ứng XN To XN Tc XN T1
2.2. NGHIÊN CỨU TRÊN LÂM SÀNG 2.2.1. Chất liệu nghiên cứu