CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
2.2. Phương phỏp nghiờn cứu
2.2.1. Phương phỏp nghiờn cứu
Phương phỏp nghiờn cứu mụ tả cắt ngang.
2.2.2. Cỏch tiến hành
2.2.2.1. Lập phiếu nghiờn cứu
thư phổi đến khỏm và nhập viện tại Bệnh viện Phổi Trungương và Bệnh viện K từ năm 2010 đến năm 2013.
2.2.2.2. Nghiờn cứu mụ bệnh học
Cỏc khối nến sau thu thập, đủ tiờu chuẩn được cắt tiờu bản và nhuộm bằng phương phỏp nhuộm Hematoxylin và Eosin (H&E), sau đú đọc và phõn tớch kết quả trờn kớnh hiển vi quang học.
Phõn loại mụ học: tất cả cỏc tiờu bản ung thư phổi được phõn loại theo bảng phõn loại của WHO 2004 và bảng phõn loại ung thư biểu mụ tuyến theo IASLC/ATS/ERS 2011.
Cỏc tiờu chuẩn chẩn đoỏn và phõn loại của cỏc typ mụ học theo WHO 2004
Ung thư biểu mụ vảy
+ Chẩn đoỏn ỏc tớnh dựa trờn sự khụng điển hỡnh về tế bào và tớnh chất xõm nhập.
+ Chẩn đoỏn typ tế bào vảy dựa trờn việc xỏc định trờn cỏc lỏt cắt Hematoxylin-Eosin sự sừng húa và/hoặc cỏc cầu nối gian bào.
+ Sự hỡnh thành keratin cú thể thấy trong cỏc tế bào riờng lẻ hoặc phổ biến hơn dưới cỏc thể “cầu sừng”.
+ Cỏc tế bào hoại tử bị cụ lập được phõn biẹt với cỏc tế bào sừng húa. + Sự hỡnh thành vũng xoắn và sự lỏt tầng rừ rệt của cỏc tế bào u được sử dụng như một bằng chứng của biệt húa vảy khi khụng cú những đặc điểm đó liệt kờ.
Ung thư biểu mụ tuyến
+ Hai dấu hiệu hỡnh thỏi học của biệt húa tuyến, thường được tỡm thấy cựng với nhau là sự hỡnh thành cỏc ống hoặc nhỳ và sự chế tiết chất nhầy.
+ Phụ thuộc vào sự ưu thế tương đối của những hỡnh ảnh này, những ung thư biểu mụ tuyến được chia thành ung thư biểu mụ tuyến nang, nhỳ và đặc cú sản xuất chất nhầy, nhưng cú sự trựng lặp lớn giữa cỏc nhúm này.
Ung thư biểu mụ tuyến vảy
Thuật ngữ ung thư biểu mụ tuyến vảy được sử dụng cho cỏc u phổi, trong đú bằng chứng chắc chắn của biệt húa vảy và tuyến được tỡm thấy trong cựng một u với khối lượng gần như bằng nhau.
Ung thư biểu mụ tế bào lớn (khụng biệt húa)
+ Tiờu chuẩn chẩn đoỏn ung thư biểu mụ tế bào lớn (khụng biệt húa) là những u biểu mụ ỏc tớnh đa hỡnh thỏi khụng cú bằng chứng chắc chắn của biệt húa vảy hoặc biệt húa tuyến.
+ Cỏc tế bào u lớn, ớt nhất khi so sỏnh với cỏc tế bào của ung thư biểu mụ tế bào nhỏ.
Ung thư biểu mụ dạng sacom và carcinosacom
Cỏc ung thư cú cỏc hỡnh ảnh giống sacom bao gồm chủ yếu là những tế bào thoi nhưng cũn xỏc định được như biểu mụ trờn cơ sở hỡnh thỏi học hoặc húa mụ miễn dịch, chỳng được gọi là ung thư biểu mụ tế bào thoi hoặc dạng sacom.
Ung thư biểu mụ tế bào sỏng
+ Ung thư biểu mụ tế bào sỏng được định nghĩa như một typ của ung thư biểu mụ phổi, chủ yếu hoặc chỉ gồm những tế bào với bào tương sỏng.
+ Những tế bào sỏng này thường chứa nhiều glycogen và cũng cú thể chứa chất nhầy.
Ung thư biểu mụ tiểu phế quản phế nang
+ Ung thư biểu mụ tiểu phế quản phế nang được chia thành cỏc typ nhầy và khụng nhầy.
Typ nhầy được hỡnh thành bởi những tế bào hỡnh trụ chứa nhầy biệt húa cao lút cỏc khoang hụ hấp, khụng xõm nhập vào mụ đệm. Sự liờn tục giữa cỏc tế bào u lút cỏc phế nang và biểu mụ của cỏc tiểu phế quản hụ hấp hoặc cỏc ống phế nang cú thể được chứng minh.
Typ khụng nhầy cú hỡnh thỏi phỏt triển là “dạng vảy” khụng cú xõm nhập mụ đệm. Cỏc tế bào u cú hỡnh khối vuụng hơn là hỡnh trụ và thường cú bào tương ưa eosin sỏng. Mức độ khụng điển hỡnh của nhõn và sự nổi trội của hạt nhõn thường lớn hơn so với trong biến thể nhầy.
Ung thư biểu mụ tế bào nhỏ
Hỡnh thỏi phỏt triển thường là đặc, nhưng cú thể thành hàng và dải, hoa hồng và giả hoa hồng, hoặc ống và ống nhỏ.
Ung thư biểu mụ thần kinh nội tiết
U carcinoid điển hỡnh của WHO là “một u với hỡnh thỏi học của carcinoid và dưới 2 nhõn chia/ 10 vi trường phúng đại cao (2mm2
) khụng cú hoại tử và 0,5cm hoặc lớn hơn ”.
U carcinoid khụng điển hỡnh là một u với hỡnh thỏi học thần kinh nội tiết cú giữa 2 và 10 nhõn chia/ 10 vi trường phúng đại cao (2mm2
) và / hoặc với những ổ hoại tử chấm hoặc cả hai.
Ung thư biểu mụ thần kinh nụi tiết tế bào lớn là “một ung thư biểu mụ tế bào lớn cú những hỡnh ảnh mụ học như cỏc hỡnh thỏi dạng cơ quan, bố, giống hoa hồng và dậu gợi ý biệt húa thần kinh nội tiết.
Loại Tiờu chuẩn chẩn đoỏn
Vảy cỏ
Cỏc tế bào u phỏt triển dọc theo cỏc cấu trỳc phế nang cú sẵn Mở rộng vỏch phế nang cựng với xơ húa phổ biến
Khụng cú cỏc hỡnh thỏi nhỳ hoặc vi nhỳ và cỏc tế bào u trong lũng phế nang
Tuyến nang
Cỏc tuyến hỡnh trũn hoặc hỡnh trỏi xoan với lũng ở trung tõm được võy quanh bởi cỏc tế bao u
Sắp xếp kiểu mắt sàng
Nhỳ
Sự phỏt triển của cỏc tế bào hỡnh trụ dọc theo cỏc lừi xơ huyết quản ở trung tõm
Cỏc cấu trỳc nhỳ lấp đầy cỏc khoang phế nang, kể cả u cú hỡnh thỏi phỏt triển dạng vảy cỏ.
Đặc Cỏc tế bao u đa diện tạo thành cỏc dải khụng cú cỏc hỡnh thỏi khỏc của ung thư biểu mụ tuyến cú thể nhận biết được
Áp dụng bảng phõn loại mụ bệnh học ung thư phổi năm 2004 của WHO, ung thư biểu mụ phổi được chia thành cỏc loại và được mó húa cỏc mó số sau đõy:
UTBM tế bào vảy 8070/3
Nhỳ 8052/3 Tế bào sỏng 8084/3 Tế bào nhỏ 8073/3 Dạng đỏy 8083/3 UTBM tế bào nhỏ 8041/3 UTBM tế bào nhỏ tổ hợp 8045/3 UTBM tuyến 8140/3 UTBM tuyến, týp hỗn hợp 8255/3
UTBM tuyến nang 8550/3 UTBM tuyến nhỳ 8260/3 UTBM tuyến tiểu PQ-PN 8250/3
Khụng chế nhầy 8252/3
Chế nhầy 8253/3 Chế nhầy và khụng chế nhầy hỗn hợp hoặc khụng xỏc định 8254/3 UTBM tuyến đặc cú chế nhầy 8230/3 UTBM tuyến phụi 8333/3 UTBM nhầy (“ dạng keo”) 8480/3 UTBM tuyến nang nhầy 8470/3 UTBM tuyến tế bào nhẫn 8490/3 UTBM tuyến tế bào sỏng 8310/3
UTBM tế bào lớn 8012/3
UTBM thần kinh nội tiết tế bào lớn 8013/3 UTBM thần kinh nội tiết tế bào lớn tổ hợp 8013/3
UTBM dạng đỏy 8123/3
UTBM dạng lympho - biểu mụ 8082/3
UTBM tế bào sỏng 8310/3
UTBM tế bào lớn cú phenotype dạng cơ võn 8014/3
UTBM tuyến vảy 8560/3
UTBM dạng sarcoma 8033/3
UTBM đa hỡnh 8022/3
UTBM tế bào khổng lồ 8031/3
Carcino- sarcoma 8980/3
U nguyờn bào phổi 8972/3
Nghiờn cứu húa mụ miễn dịch Khỏng thể sử dụng
Ung thư biểu mụ khụng tế bào nhỏ
Cỏc khối nến được cắt tiờu bản và nhuộm HMMD với cỏc dấu ấn CK7, CK5/6, P63, TTF-1, Napsin A, Claudin-1, Claudin -5, Ki67 và p53.
Những trường hợp đặc biệt được nhuộm thờm với cỏc dấu ấn đưới đõy: Synaptophysin, Chromogranin: Ung thư biểu mụ thần kinh nội tiết. HepPar-1: Ung thư biểu mụ dạng gan.
Beta-HCG: Ung thư biểu mụ màng đệm.
Ung thư biểu mụ tế bào nhỏ
CK7, TTF-1, NSE, Chromogranin, CEA, Ki-67, p53 Quy trỡnh nhuộm đều theo phương phỏp ABC.
Quy trỡnh kỹ thuật nhuộm húa mụ miễn dịch
Cỏc bước tiến hành
- Bước 1: Cắt tiờu bản
Kỹ thuật viờn sử dụng khối nến cú chứa bệnh phẩm cắt thành tiờu bản cú độ dày 4 àm (tương tự như làm tiờu bản trong mụ bệnh học thụng thường)
- Bước 2: Tẩy parafin:
Ủ tiờu bản trong tủ ấm qua đờm ở nhiệt độ 56
Nhỳng tiờu bản qua lần lượt cỏc bể: Xylen 1, Xylen 2, Xylen 3; mỗi bể 03 phỳt.
Nhỳng tiếp tiờu bản qua cỏc bể: Cồn 700, 900, Cồn tuyệt đối; mỗi bể 03 phỳt.
Nhỳng tiờu bản qua bể nước cất 2 lần; mỗi lần 5 phỳt. - Bước 3: Bộc lộ khỏng nguyờn:
Cho tiờu bản vào bể đun bộc lộ KN cú chứa dung dịch pH6, pH9 đặt vào trong nồi ỏp suất bộc lộ khỏng nguyờn đun, trong 15 phỳt.
Lấy ra để nguội tại nhiệt độ phũng
- Bước 4: Rửa tiờu bản bằng nước cất trong 5 phỳt - Bước 5: Khử men nội sinh
Ủ tiờu bản bằng H2O2 3%, 10 phỳt
- Bước 6: Rửa tiờu bản bằng dung dịch TBS trong 3 bể, mỗi bể 3 phỳt - Bước 7: Phủ khỏng thể I: 60 phỳt
- Bước 8: Rửa tiờu bản bằng dung dịch TBS trong 3 bể, mỗi bể 3 phỳt - Bước 9: Phủ khỏng thể II, 30 phỳt
- Bước 11: Nhỏ dd màu DAB, 10 phỳt - Bước 12: Rửa bằng nước cất, 5 phỳt
- Bước 13: Nhuộm nhõn bằng Hematoxylin 30s-1 phỳt - Bước 14: Rửa bằng nước chảy, 5 phỳt
- Bước 15: Nhỳng qua cỏc bể cồn 70, 90, 100, mỗi bể 3 phỳt - Bước 16: Nhỳng qua 3 bể xylen, mỗi bể 3 phỳt
- Bước 17: Gắn lamen lờn lam kớnh.
Đọc tiờu bản
Kiểm soỏt chất lượng
- Kiểm tra chất lượng húa chất, thuốc nhuộm thường xuyờn, đảm bảo đậm độ hợp lý với thời gian nhuộm.
- Sử dụng chứng õm, chứng dương và tiờu bản mụ bệnh học thụng thường để so sỏnh, đối chiếu.
- Hạn chế õm tớnh giả, dương tớnh giả và nhầm lẫn tiờu bản: Đọc kết quả:
-CK7: Phản ứng dương tớnh cú màu nõu đỏ ở bào tương tế bào -CK5/6: Phản ứng dương tớnh cú màu nõu đỏ ở màng tế bào -P53: Phản ứng dương tớnh cú màu nõu đỏ ở nhõn tế bào -P63: Phản ứng dương tớnh cú màu nõu đỏ ở nhõn tế bào -TTF-1: Phản ứng dương tớnh cú màu nõu đỏ ở nhõn tế bào -Ki67: Phản ứng dương tớnh cú màu nõu đỏ ở nhõn tế bào
-Napsin: Phản ứng dương tớnh cú màu nõu đỏ ở bào tương tế bào Claudin-1: Phản ứng dương tớnh cú màu nõu đỏ ở bào tương tế bào
-NSE: Phản ứng dương tớnh cú màu nõu đỏ ở bào tương tế bào
-Chromogranin: Phản ứng dương tớnh cú màu nõu đỏ ở bào tương tế bào -Synaptophysin: Phản ứng dương tớnh cú màu nõu đỏ ở bào tương tế bào -CEA: Phản ứng dương tớnh cú màu nõu đỏ ở bào tương tế bào
-HepPar-1: Phản ứng dương tớnh cú màu nõu đỏ ở bào tương tế bào -Beta-HCG: Phản ứng dương tớnh cú màu nõu đỏ ở bào tương tế bào Điểm ngưỡng dương tớnh chung cho moi dỏu ấn là 10% số tế ào dương tớnh.
2.2.2.3. Biến số nghiờn cứu
Biến số nền:
- Giới tớnh (định tớnh) - Độ tuổi (định lượng)
- Giới: phõn thành 2 nhúm nam, nữ
Phõn loại ung thư phổi WHO 2004: Ung thư biểu mụ khụng tế bào nhỏ: Ba nhúm lớn
- UTBM tế bào vảy - UTBM tuyến
- Cỏc typ khỏc
Ung thư biểu mụ khụng tế bào nhỏ
Dấu ấn húa mụ miễn dịch:
- CK7: tỷ lệ dương tớnh - CK5/6: tỷ lệ dương tớnh - P53: tỷ lệ dương tớnh
- P63: tỷ lệ dương tớnh - TTF-1 tỷ lệ dương tớnh - Ki67: tỷ lệ dương tớnh - Napsin: tỷ lệ dương tớnh - Claudin-1: tỷ lệ dương tớnh - Claudin-5: tỷ lệ dương tớnh - NSE: tỷ lệ dương tớnh - Chromogranin: tỷ lệ dương tớnh - CEA: tỷ lệ dương tớnh
2.2.2.4. Thu thập số liệu vào phiếu điều tra
2.2.3. Xử lý số liệu
Chỳng tụi xử lý số liệu sau khi thu thập bằng phương phỏp thống kờ y học sử dụng phần mềm SPSS 16.0 và Microsoft Excel 2003.
-Sử dụng phộp kiểm Chi-square để phõn tớch sự khỏc biệt giữa cỏc biến định tớnh, nếu trong cỏc nhúm định lượng cú bất kỳ giỏ trị nào < 5 thỡ chỳng tụi sẽ chọn phộp kiểm Fisher để kiểm định với tiờu chớ p < 0,05 là cú ý nghĩa về mặt thống kờ.
-Sử dụng phộp kiểm Student – t để phõn tớch sự khỏc biệt giữa hai biến định lượng cú phõn phổi chuẩn, chọn p < 0,05 là cú ý nghĩa về mặt thống kờ.
-Sử dụng phộp kiểm Mann-Whitney (U-test) phõn tớch sự khỏc biệt giữa hai biến định lượng khụng cú phõn phổi chuẩn, chọn p < 0,05 là cú ý nghĩa về mặt thống kờ.
2.3. Đạo đức nghiờn cứu
Nghiờn cứu khụng vi phạm y đức vỡ đõy là nghiờn cứu khoa học ứng dụng đem lại lợi ớch cho người tham gia nghiờn cứu vỡ những lý do sau:
-Cỏc thụng tin về bệnh nhõn được bảo mật hoàn toàn và chỉ sử dụng cho mục đớch nghiờn cứu khoa học.
-Nghiờn cứu này chỉ đem lại lợi ớch cho bệnh nhõn, khụng nhằm quảng cỏo và hoàn toàn khụng nhận tài trợ của bất kỳ cụng ty dược nào.
-Việc xử lý bệnh phẩm sau mổ khụng gõy bất kỳ tổn thương nào cho bệnh nhõn.
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIấN CỨU 3.1. Tuổi và giới