2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1 Thiết kế nghiên cứu
Thiết kế nghiên cứu mô tả hàng loạt ca, tiến cứu.
2.2.2 Nội dung và các biến số nghiên cứu
2.2.2.1 Nghiên cứu về đặc điểm lâm sàng và sinh học của người bệnh kháng hay không dung nạp imatinib
Đặc điểm lâm sàng
Dấu hiệu thiếu máu: da xanh, niêm nhạt, khó thở khi gắng sức,
Dấu hiệu xuất huyết: như bầm da, chảy máu niêm mạc, chảy máu mũi, chảy máu nướu răng…
Dấu hiệu nhiễm trùng: sốt, môi khô, lưỡi dơ, áp xe…
Lách to: được xác định trên lâm sàng, khi sờ được khối lách nằm dưới hạ sườn trái.
Gan to: được xác định trên lâm sàng, khi sờ được bờ dưới của thùy gan nằm dưới hạ sườn hay chiều cao gan trên 14 cm.
Đặc điểm sinh học
Mức Hemoglobin (Hb) (đơn vị: g/dL): được ghi nhận trên xét
nghiệm phân tích tế bào máutrước khi bắt đầu nghiên cứu
Số lượng bạch cầu (đơn vị: x 109/L): được ghi nhận trên xét nghiệm phân tích tế bào máutrước khi bắt đầu nghiên cứu
Số lượng tiểu cầu (đơn vị: x 109/L): được ghi nhận trên xét nghiệm phân tích tế bào máutrước khi bắt đầu nghiên cứu
Tỷ lệ tế bào non trong tủy xương (đơn vị: %): được ghi nhận trên xét nghiệm hình thái tủy xương trước khi bắt đầu nghiên cứu.
Tỷ lệ tế bào mang nhiễm sắc thể Philadelphia (đơn vị: %): được xác định bằng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) trước khi bắt đầu nghiên cứu.
Đột biến kháng imatinib: là những đột biến điểm trên vùng kinase của BCR-ABL, được xác định bằng kỹ thuật giải trình tự gen trực tiếp vào thời điểm chẩn đốn kháng hay khơng dung nạp imatinib.
2.2.2.2 Đánh giá đáp ứng về huyết học, di truyền tế bào, sinh học phân tử và thời gian sống còn sau khi điều trị với nilotinib
Đáp ứng về huyết học: được xác định bằng các chỉ số tế bào máu ngoại biên và khám lâm sàng ở mỗi tháng sau điều trị nilotinib.
Đáp ứng về di truyền tế bào: được xác định bằng tỷ lệ NST Ph+ ở mỗi 3 tháng sau điều trị nilotinib.
Đáp ứng về sinh học phân tử: được xác định bằng tỷ lệ BCR-ABL ở mỗi 3 tháng sau khi người bệnh đã đạt được đáp ứng di truyền tế
bào hoàn toàn (CCyR).
Tình trạng tiến triển bệnh: dựavào các chỉ số tế bào máu ngoại biên và tủy xương.
Tình trạng tử vong và nguyên nhân tử vong(nếu có). Thời gian sống thêm (sau điều trị), bao gồm:
Thời gian sống thêm tồn bộ
Thời gian sống thêm khơng tiến triển bệnh
2.2.2.3 Xác định tỷ lệ các độc tính sau khi điều trị nilotinib.
Tỷ lệ độc tính liên quan đến huyết học: như tỷ lệ người bệnh xuất hiện thiếu máu, giảm bạch cầu hạt và giảm tiểu cầu tồn bộ, cũng như tỷ lệ người bệnh có những độc tính này ở độ 3-4.
Tỷ lệ độc tính khơng liên quan huyết học: tùy độc tính xuất hiện ở mỗi người bệnh đều được ghi nhận và phân độ tương ứng
Tỷ lệ người bệnh phải ngưng điều trị do độc tính mức độ nặng.
2.2.3 Các kỹ thuật xét nghiệm sử dụng trong nghiên cứu
2.2.3.1 Kỹ thuật xét nghiệm huyết đồ
Xét nghiệm huyết đồ được thực hiện theo quy trình chuẩn của khoa Huyết Sinh Học – Bệnh viện Truyền Máu Huyết Học TP.HCM dựa vào kỹ
thuật đã được mô tả chi tiết bởi Greer và cộng sự [104]. Mẫu máu tĩnh mạch sẽ được thu nhận trong các ống có chứa chất chống đơng EDTA và được giữ
trong nhiệt độ phòng. Mẫu máu sẽđược xử lý và phân tích trong vịng 8 giờ. Các chỉ số tế bào máu được xác định bằng máy đếm tế bào tự động. Hệ
bào máu có mức độ phân tán ánh sáng khác nhau. Sự khác biệt này sẽ được phát hiện bằng một bộ cảm quang và chuyển thành các tín hiệu điện, sau đó được tính tốn và báo cáo kết quả tương ứng.
Bên cạnh đó, mẫu máu này cũng được sử dụng để làm xét nghiệm phết máu ngoại biên. Kỹ thuật viên đặt cẩn thận một giọt máu ởđầu của lam sạch,
sau đó nhanh chóng kéo dàn đều giọt máu trên lam. Tiêu bản được nhuộm
Giemsa và đọc dưới kính hiển vi nhằm xác định các thơng tin sau: cơng thức bạch cầu; hình thái hồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu; độ tập trung tiểu cầu; tỷ lệ
tế bào non; những bất thường khác trên lam.
2.2.3.2 Kỹ thuật xét nghiệm tủy đồ:
Xét nghiệm tủy đồ được thực hiện theo quy trình chuẩn của khoa Huyết Sinh Học – Bệnh viện Truyền Máu Huyết Học TP.HCM dựa vào kỹ thuật đã được mô tả chi tiết bởi Greer và cộng sự [104]. Dịch tủy sau khi được hút thông qua kỹ thuật chọc hút tủy xương với kim chuyên dụng sẽ được dàn lên các lam.
Tiến hành nhuộm Giemsa hoặc nhuộm Wright các lam tủy, nếu ở giai
đoạn tiến triển hoặc chuyển cấp được nhuộm thêm peroxydase (MPO), sudan
đen, P.A.S. Sau khi chuẩn bị lam kỹlưỡng, bác sĩ có chun mơn sẽ tiến hành
đọc và phân tích các tiêu bản, nhằm cung cấp các thông tin như: mật độ tủy;
đặc điểm hình thái và sốlượng của từng dòng tế bào; sự phân bố của các dòng tế bào; tỷ lệ tế bào dòng tủy và dòng hồng cầu; sự trưởng thành của nhân và nguyên sinh chất; sự xâm nhập của các tế bào bất thường; tỷ lệ tế bào non trong tủy xương…
2.2.3.3 Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH)
Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) được áp dụng để chẩn đoán và theo dõi đáp ứng di truyền tế bào trong bệnh BCMDT. Kỹ thuật này được
thực hiện theo quy trình chuẩn của khoa Di truyền học phân tử của Bệnh viện Truyền Máu Huyết Học TP.HCM.
Nguyên tắc của kỹ thuật là sử dụng những đoạn dị có gắn huỳnh quang nhằm đánh dấu gen ABL và BCR. Cụ thể, màu đỏ sẽ tương ứng với gen ABL và màu xanh lá cây sẽ tương ứng với gen BCR. Khi có hiện tượng hịa nhập 2 gen này trong tổ hợp gen ung thư BCR-ABL thì sẽ bắt gặp thêm tín hiệu màu vàng. Dựa vào việc xác định những tín hiệu màu vàng trên 200 tế bào liên tiếp, sẽ giúp xác định tỷ lệ tế bào còn NST Ph+.
Thiết bị thực hiện: Kính hiển vi huỳnh quang BX51(Olympus).
Hóa chất: Kit đoạn dò đặchiệu BCR/ABL Plus Translocation, Dual Fusion Probe (Cytocell).
2.2.3.4 Kỹ thuật định lượng gen bằng PCR (RQ-PCR)
Kỹ thuật định lượng gen bằng PCR được áp dụng để theo dõi đáp ứng sinh học phân tử trong bệnh BCMDT. Kỹ thuật này được thực hiện theo quy trình chuẩn của khoa Di truyền học phân tử của Bệnh viện Truyền Máu Huyết Học TP.HCM.
Nguyên tắc chung: Mẫu máu hay mẫu tủy xương từ người bệnh được xử
lý ly giải hồng cầu, để có mẫu thuần bạch cầu cho q trình phân tích. Các RNA thơng tin (mRNA) sẽ được ly trích và chuyển thành cDNA bằng những
đoạn mồi chuyên biệt trong một phản ứng phiên mã ngược. Chính những
cDNA này được sử dụng trong phản ứng PCR định lượng cho cả tổ hợp gen BCR-ABL và gen tham chiếu làm chứng (“gen giữ nhà”). Gen tham chiếu là loại gen xuất hiện trong tế bào bình thường, được dùng làm nền tảng để tính tốn các gen bệnh. Tại Bệnh viện Truyền Máu Huyết Học TP.HCM, chúng tôi chọn ABL là gen tham chiếu cho phản ứng PCR định lượng. Kết quảđược thể hiện bằng tỷ lệ của số bản sao BCR-ABL / gen ABL và được chuyển đổi theo quy chiếu thống nhất trên thế giới IS.
Thiết bị:Hệ thống Realtime PCR SaCycler-96(Sacace Biotechnologies).
Hóachất: Kit BCR/ABL p210 One-Step (Entrogen)
2.2.3.5 Kỹ thuật giải trình tự gen trực tiếp
Kỹ thuật giải trình tự gen trực tiếp (phương pháp Sanger) được áp dụng
để tầm soát đột biến vùng kinase của BCR-ABL ở những người bệnh kháng hay không dung nạp imatinib. Kỹ thuật này được thực hiện theo quy trình chuẩn của khoa Di truyền học phân tử của Bệnh viện Truyền Máu Huyết Học TP.HCM.
Nguyên tắc chung: Mẫu tủy xương hoặc máu ngoại biên sẽ được chiết
tách RNA thơng tin. Sau đó tiến hành tổng hợp cDNA từ những mRNA này bằng enzym phiên mã ngược (Reverse transcriptase). Vùng gen của ABL kinase trong tổ hợp gen BCR-ABL sẽ được khuếch đại. Tuy nhiên để hạn chế
sự khuếch đại vùng gen ABL bình thường, đoạn mồi được dùng sẽ gồm 1 mồi xuôi trên BCR và 1 mồi ngược trên ABL. Sau khi tinh sạch và kiểm tra sản phẩm, những cDNA của vùng ABL kinase này được đưa vào phản ứng giải trình tự. Kết quả sẽđược so sánh với mẫu trình tự chuẩn từ NCBI Blast center