Phương pháp làm tiêu bản vi thể tẩm ựúc bằng parafin theo Robert (1969) và Burn (1974). Phương pháp làm tiêu bản vi thể ựược thực hiện theo quy trình tẩm ựúc bằng parafin, nhuộm Hematoxilin Ờ Eosin (HE). Từ những mẫu bệnh phẩm có các biến ựổi ựại thể cần tiến hành làm tiêu bản ựể xác ựịnh bệnh tắch vi thể chủ yếu của bệnh.
- Khử formol
+ Mục ựắch ựể rửa sạch formol.
+ Sau khi cố ựịnh bệnh phẩm trong dung dịch formol 10% từ 2 Ờ 3 ngày, lấy tổ chức ra khỏi bình formol 10%, cắt thành miếng tổ chức theo chiều dài có kắch thước 4 - 5mm, cho vào các cassette, ghi tên bệnh phẩm. Sau ựó, các cassette ựược rửa nước chảy nhẹ tối thiểu 24 giờ.
+ đưa mẫu vào hệ thống máy chuyển ựúc mẫu tự ựộng. Hệ thống máy chuyển ựúc mẫu tự ựộng gồm 12 bình
Bình Hóa chất Thời gian (giờ) 1 Cồn 600C 1:00 2 Cồn 600C 1:00 3 Cồn 700C 1:30 4 Cồn 800C 1:30 5 Cồn 960C 1:30 6 Cồn 1000C 1:30 7 Cồn 1000C 1:30 8 Cồn 1000C 1:30 9 Xylen 1:30 10 Xylen 1:30 11 Parafin 2:00 12 Parafin 2:00 đúc tiêu bản
đúc mẫu bệnh phẩm trong parafin.
Cắt dán mảnh và cố ựịnh tiêu bản
Cắt mảnh: cắt miếng tổ chức trên máy cắt microtom với ựộ dày 2 - 3ộm. Dán mảnh: miếng tổ chức sau khi cắt ra sẽ ựược tãi phẳng trên phiến kắnh nhờ cho vào bình nước ấm 500C.
Sau ựó, miếng tổ chức khô ựược cho vào tủ ấm 370C trong 12 - 24 giờ.
Nhuộm tiêu bản
Nhuộm tiêu bản theo phương pháp nhuộm kép bằng thuốc nhuộm Hematoxilin-Eosin. Các bước nhuộm như sau:
Các bước tiến hành:
+ Khử parafin : Cho tiêu bản qua hệ thống xylen gồm 3 lọ: Xylen I : 10 phút
Xylen II : 10 phút Xylen III : 10 phút
+ Khử xylen: Cho tiêu bản qua hệ thống cồn gồm 4 lọ: Cồn 1000 : 2 lần (mỗi lần 1 phút) Cồn 950 : 1 lần
Cồn 700 : 1 lần Cồn 500 : 1 lần
+ Khử cồn: Cho dưới vòi nước chảy 15 phút. + Nhuộm Hematoxilin (nhuộm nhân):
Sau khi ựã rửa tiêu bản qua nước chảy trong vòng 15 phút ta ựem lau khô nước xung quanh tiêu bản, ựặt tiêu bản lên trên giá ựể rồi nhỏ Hematoxilin ngập tiêu bản, ựể trong vòng 5 phút. Sau ựó ựổ thuốc nhuộm ựi, cho rửa nước chảy trong vòng 10 phút cho hết Hematoxilin thừa. đem lau sạch nước xung quanh tiêu bản và vẩy khô. Kiểm tra màu sắc, nếu thấy tiêu bản có màu xanh tắm là ựược. Nếu nhạt màu thì nhúng tiêu bản qua NaHCO3 1% (30 giây). Nếu ựậm quá thì nhúng tiêu bản vào lọ cồn axit (cồn 600 + HCl, tỷ lệ HCl là 1%) trong 30 giây.
+ Nhuộm Eosin (nhuộm bào tương):
Nhỏ Eosin ngập tiêu bản 5-10 phút tùy theo thực tế màu Eosin. Sau ựó rửa nước chảy 10 phút cho hết Eosin thừa. Sau khi rửa nước ta lau sạch phần nước xung quanh bệnh phẩm rồi vào quy trình tẩy nước.
+ Tẩy nước: Ta cho tiêu bản qua hệ thống Cồn 900I : 15 giây.
Cồn 1000I : 15 giây. Cồn 1000II : 15 giây.
+ Tẩy cồn làm trong tiêu bản: Cho tiêu bản qua Xylen I. Rồi sang Xylen II, ta lau sạch cồn ở xung quanh lam kắnh rồi chuyển sang Xylen III rồi sang Xylen IV, sau ựó cho vào Xylen ựã làm nóng trong tủ ấm 370C trong vòng 2 phút.
Gắn Baume canada
Nhỏ một giọt Baume canada, Xylen ấm lên trên lamen rồi gắn nhanh lên tiêu bản khi vẫn còn Xylen ấm lên trên tiêu bản. Ấn nhẹ ựể dồn hết bọt khắ ra ngoài.
đánh giá kết quả
đem soi kắnh hiển vi quang học với vật kắnh 10X. Nếu thấy nhân bắt màu xanh tắm, bào tương bắt màu ựỏ tươi, tiêu bản trong sáng, không có nước, không có bọt khắ là ựược.