PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C/U

Một phần của tài liệu KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG AFLATOXIN M1 TRONG SỮA BÒ TƯƠI VÀ HÀM LƯỢNG AFLATOXIN B1 TRONG THỨC ĂN HỖN HỢP BỔ SUNG CHO BÒ TẠI MỘT SỐ HỘ CHĂN NUÔI BÒ SỮA TRÊN ĐỊA BÀN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH (Trang 33)

Chương 3 NI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊ NC U

3.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C/U

3.4.1. Cách l2y mIu

MIu s#a bò tươi

M u s a ñư c l y = m t s h chăn ni bị s a trên qu n, huy n c%a thành ph , m i h chăn nuôi l y m t m u s a. Sau khi v sinh b u vú bị, v!t b" vài tia s a đ u = t t c các vú và v!t s a vào trong thùng ñ ng s a, tr n chung các thùng s a trong 1 h l i. Mang găng tay múc kho ng 100 ml s a ñ vào ng nghi m, ñánh s m u, b o qu n l nh và chuy n đ n phịng thí nghi m.

MIu th$c ăn cho bò s#a

M u th c ăn cho bị s a đư c l y ñ ng th(i v i lúc l y m u s a.

Phương pháp l y m u ñư c th c hi n theo TCVN 4325-86 v l y m u TAHH và nguyên li u th c ăn chăn nuôi. L y m u TAHH = nhi u v trí trên bao, trong kho sau đó tr n l i cho ñ u và l y 0,5 kg đưa v phịng thí nghi m b o qu n. Sau khi phân tích s a n u phát hi n có hàm lư ng AFM1 trong s a thì ta ti n hành phân tích hàm lư ng AFB1 trong m u th c ăn.

B!ng 3.1: B trí l y m u s a và m u TAHH b sung cho bò s a = các qu n, huy n

Qu n, huy n S m u s a bò tươi S m u TAHH b sung

Hóc Mơn 72 72 C% Chi 31 31 Bình Chánh 21 21 Bình Tân 28 28 Qu n 12 24 24 T ng c ng 176 176

24

3.4.2. KiBm tra hàm lư"ng AFM1 bTng kS thu<t ELISA 3.4.2.1. ChuOn b, mIu

S a tươi nguyên li u

Làm l nh m u = 2 - 8oC và ly tâm 3000 vòng / 10phút. Tách b" l p béo.

Pha loãng m u 5 l n b ng dung d ch pha loãng m u. SE d ng dung d ch này tr c ti p cho ph n ng ELISA.

3.4.2.2. ChuOn b, các dung d,ch làm vi7c

Dung d ch chu n AFM1: l!c k trư c khi dùng.

Conjugate: Pha loãng 100 l n b ng dung d ch pha loãng conjugate. Pha loãng dung d ch r a 20 l n.

3.4.2.3. Quy trình phân tích AFM1 bTng kS thu<t ELISA

Trư c khi ti n hành phân tích ghi l i b trí trên đĩa

Thêm 100 µl dung d ch chu n AFM1 có n ng đ 0 vào gi ng Bo.

Thêm 100 µl dung d ch chu n AFM1 có n ng đ 5, 10, 25, 50, 100, 250 ng / l vào các gi ng chu n.

Thêm 100 µl dung d ch m u vào gi ng m u tương ng.

? 45 phút = 20 - 25oC. Không nên kéo dài th(i gian % và không dùng máy l!c khi %. REa các gi ng b ng dung d ch rEa, ñ ch t l"ng ra kh"i gi ng. Lo i b" nh ng gi@t cịn đ@ng l i trong gi ng b ng cách ñ p úp m nh ñĩa lên l p gi y th m. Th c hi n l&p l i 4 l n. Khơng đư c ñ gi ng khơ.

Thêm 100 µl conjugate vào m i gi ng, tr n ñ u b ng cách l!c vòng trong vài giây. ? 15 phút = 20 - 25oC.

L&p l i bư c rEa như = trên.

Dùng pipet ña kênh cho 100 µl dung d ch lên màu vào m i gi ng l!c m nh b ng máy l!c vòng trong vài giây. ? 15 phút = 20 - 25oC.

Dùng pipet đa kênh cho 50 µl dung d ch d ng ph n ng vào m i gi ng l!c đ u b ng cách l!c vịng trong vài giây.

Hình 3.1: Đưa đĩa vào máy đ@c k t qu sau khi ñư c nh" dung d ch d ng ph n ng

3.4.2.4. Cách tính kCt qu!

Hàm lư"ng AFM1 trong s#a

Ta tính n ng ñ AFM1 trong m u d a vào ñư(ng cong chu n, r i nhân giá tr này v i h s pha loãng n u có.

L p đư(ng cong chu n, tr c tung là giá tr B / Bo (%) cịn tr c hồnh là n ng ñ AFM1.

Bo là ñ h p thu th c t c%a dung d ch AFM1 chu n có n ng ñ 0 trong gi ng Bo.

B là ñ h p thu th c t c%a m i m u thE ho&c m u chu n.

Hình 2.3: Đư(ng cong chu n dùng tính hàm lư ng AFM1 trong s a bò tươi N ng ñ AFM1

N ng ñ AFM1 (ppt)

26

3.4.3. KiBm tra hàm lư"ng AFB1 bTng phương pháp sKc ký lLng cao áp (HPLC)

Th c hi n theo phương pháp c%a Hisashi Kamimura và c ng s .

3.4.3.1. Phương pháp ly trích AFB1

− Cân 20 g m u ñã nghi n k thành b t vào trong bình tam giác 200 ml có nút

nhám th%y tinh, thêm 10 ml nư c c t ñ làm m m u.

− B sung 100 ml chloroform, ñ y n!p, l!c 10 phút = t c ñ nhanh. L@c qua gi y l@c vào m t c c th%y tinh chia v ch 50 ml. B sung 10 g Na2SO4 khan vào 50 ml d ch l@c, ñ yên vài phút.

Hình 3.2: M u đ ng trong bình tam giác có nút nhám th%y tinh

3.4.3.2. Phương pháp tách và tinh chC AFB1

− Cho vào c t 5 ml chloroform và 5 g Na2SO4 khan, thêm 0,7 g florisol, sau đó

cho 0,5 g Na2SO4 lên trên. Chuy n 50 ml d ch l@c m u vào c t, n u dòng ch y ch m thì khu y l p Na2SO4 phía trên. Tráng ng đong b ng m t ít chloroform và chuy n vào c t s!c ký. Khi m c d ch l@c h xu ng ñ n l p Na2SO4, tráng thành c t b ng chloroform và cho ch y qua thành c t như trên.

− Tách AFB1 kh"i c t b ng 30ml h n h p acetone-nư c (99:1). Thu nh n d ch dung ly vào bình 30 ml hình qu lê, làm khơ b ng cơ quay chân khơng trong b p đun cách th%y = nhi t ñ 50 – 60oC.

− Hịa tan c&n khơ b ng 1 ml chloroform, b o qu n và dùng trong phân tích

b ng TLC và HPLC

3.4.3.3. Đ,nh tính AFB1 bTng phương pháp sKc ký l;p mLng (TLC)

− Chu n b b n m"ng Silicagel có chi u cao 12cm, ñ dài tuỳ s lư ng m u. Dùng bút chì kR m t ñư(ng n m ngang cách ñáy 1,5cm. Dùng sylanh hút dung d ch m u và AFB1 chu n ch m thành t ng ñ m lên ñư(ng kR ngang v i lư ng 5 µl. V trí m i đ m cách nhau 1,5 cm, cách mép ph i và mép trái 1,5 cm.

− Tri n khai b n m"ng b ng dung môi chloroform: aceton (9:1) cho đ n khi dung mơi th m kho ng 90% b cao c%a b n m"ng, l y b n m"ng ra đ khơ t nhiên ho&c dùng hơi nóng đ làm khơ.

− Quan sát b n m"ng dư i ñèn UV (bư c sóng 365 nm) so sánh qu ng ñư(ng ch y Rf (relactive front), màu s!c, cư(ng ñ huỳnh quang gi a ñ m chu n và ñ m m u.

− Đ khtng ñnh các v t m u là AFB1 ta phun dung d ch H2SO4 25% lên b n m"ng, ñ khơ r i quan sát dư i đèn UV. N u các ñ m m u chuy n t màu xanh dương sang màu vàng thì đó là AFB1.

3.4.3.4. Đ,nh lư"ng bTng phương pháp sKc ký lLng cao áp (HPLC)

− Cho 0,5 ml AFB1 chu n và m u đã đư c phân tích TLC l n lư t vào các l@ nh", làm khô trong dịng khí N2.

− Dùng micropipette thêm 500 µl hexane và 125 µl TFA vào các l@ m u và

chu n, l!c ñ u, ñun = 40oC trong 5 phút và làm khơ trong dịng khí N2.

− Hịa tan c&n khơ trong 0,5 ml dung môi acetonitril – nư c (1:4).

− Tu n t bơm 10 µl dung d ch ch t chu n đã đư c xE lý TFA và 10 µl dung d ch m u ñã ñư c xE lý v i TFA vào thi t b .

− Tính lư ng AFB1 d a vào di n tích c%a peak và n ng ñ các ch t chu n.

3.5. CÁC CHU TIÊU THEO DÕI

− T# l nhi$m AFM1 trong s a bò tươi.

− T# l nhi$m AFM1 trong s a bò tươi theo lo i TAHH b sung. − T# l nhi$m AFM1 trong s a bò tươi theo s n lư ng s a.

28

− T# l m u s a ñ t yêu c u (so v i quy ñ nh c%a B Y T , 1998).

− T# l nhi$m AFB1 c%a m u TAHH b sung. − M c nhi$m AFB1 c%a m u TAHH b sung.

− T# l chuy n hoá t AFB1 trong TAHH b sung cho bò s a sang AFM1 trong

s a bị tươi.

Cách tính kCt qu!

T# l nhi$m AFM1 trong s a bò tươi (%) = (S m u s a nhi$m AFM1 / T ng s m u s a kh o sát).100

T# l m u s a ñ t yêu c u (%) = (S m u s a có m c nhi$m AFM1 dư i 0,5 ppb / T ng s m u s a kh o sát).100

T# l nhi$m AFB1 trong TAHH b sung cho bò (%) = (S m u TAHH nhi$m AFB1/ T ng s m u TAHH kh o sát).100

3.6. XM LÝ S LI U

Dùng ph n m m Minitab 12.21 for Windows

− So sánh các t# l nhi$m AF b ng tr!c nghi m χ2.

− Tính m c đ nhi$m AF trung bình (s li u đư c chuy n đ i sang logarit).

Chương 4

K T QU VÀ TH O LU N

4.1. TU L NHI M AFM1 TRONG S A BÒ TƯƠI M T S QU N, HUY N VÀ NH HƯ NG CFA M T S Y U T Đ N TU L NHI M AFM1 4.1.1. TV l7 nhi8m AFM1 trong s#a bò tươi : m)t s* qu<n, huy7n

K t qu v t# l nhi$m AFM1 trên t ng s 176 m u s a kh o sát đư c trình bày = b ng 4.1 và bi u ñ 4.1

B!ng 4.1: T# l nhi$m AFM1 trong s a bò tươi = m t s qu n, huy n

M u s a không nhi$m AFM1 M u s a nhi$m AFM1 Qu n, huy n S m u s a kh o sát S m u T# l (%) S m u T# l (%) Hóc Mơn 72 19 26,39 53 73,61 C% Chi 31 8 25,81 23 74,19 Bình Chánh 21 12 57,14 9 42,86 Bình Tân 28 14 50,00 14 50,00 Qu n 12 24 11 45,83 13 54,17 T'ng 176 64 36,36 112 63,64 73,61 74,19 42,86 50 54,17 63,64 0 10 20 30 40 50 60 70 80T l (%) HM CC BC BT Q12 T ng Qu n, huy n

30 Ghi chú HM: huy n Hóc Mơn CC: huy n C% Chi BC: huy n Bình Chánh BT: qu n Bình Tân Q12: qu n 12

Qua b ng 4.1 và bi u ñ 4.1 cho th y trong 176 m u s a kh o sát có 64 m u s a không nhi$m AFM1 chi m 36,36% và 112 m u s a nhi$m AFM1 chi m 63,64% . T# l này cao hơn k t qu kh o sát c%a Tr n Văn Thành năm 2001 (0%) nhưng th p hơn k t qu c%a Nguy$n Th H ng Phúc năm 2007 (80%) và k t qu c%a Tarik (Th Nhĩ Kỳ) năm 2003 (88,23%). Như v y t# l nhi$m AFM1 trong s a bò tươi = nư c ta năm nay có gi m b t nhưng v n còn khá cao (63,64%). Như ta ñã bi t AFM1 là s n ph m hydroxyl hóa c%a AFB1, khi bị ăn th c ăn có nhi$m AFB1 thì có kho ng 1 – 3% AFB1 đư c chuy n hóa thành AFM1 qua s a (trích d n c%a Lê Anh Ph ng, Bùi Cách Tuy n và ctv, 2001). Nư c ta là m t nư c nhi t đ i có m đ cao, s b o qu n th c ăn không t t là nguyên nhân d$ d n đ n tình tr ng nhi$m n m m c trong th c ph m.

Trong 5 qu n, huy n kh o sát thì t# l nhi$m AFM1 trong s a bò tươi = huy n C% Chi cao nh t chi m 74,19%, k đ n là huy n Hóc Mơn chi m 73,61%, = qu n 12 chi m 54,17%, = qu n Bình Tân chi m 50,00%, và th p nh t là = huy n Bình Chánh chi m 42,86%. Trong khi đó k t qu c%a Nguy$n Th H ng Phúc năm 2007, = huy n C% Chi chi m 74%, huy n Hóc Mơn chi m 100%, qu n 12 chi m 92%, qu n Bình Tân chi m 37,5% và huy n Bình Chánh chi m 85,2%. Nhìn chung đa s t# l nhi$m AFM1 trong s a bò tươi = các qu n, huy n năm nay th p hơn năm ngối nh t là = huy n Hóc Mơn, Bình Chánh và qu n 12 th p hơn ñáng k . Đi u này ch ng t" nh ng ngư(i chăn ni ngày càng quan tâm hơn đ n ch t lư ng s a và s c kh"e c ng ñ ng. Khi so sánh v m&t th ng kê thì t# l nhi$m AFM1 trong s a bò tươi gi a các qu n, huy n có s khác bi t rõ r t (P = 0,02), có th do ngu n th c ăn = m i vùng khác nhau. Tuy nhiên, trong s các qu n, huy n thì ch# có huy n Hóc Mơn v i Bình Chánh, Hóc Mơn v i Bình Tân và C% Chi v i Bình Chánh là có s khác bi t v m&t th ng kê (P < 0,05) còn gi a các qu n huy n khác khơng có s khác bi t v m&t th ng kê (P > 0,05). S khác bi t này có th do = Bình Chánh và Bình Tân có cách b o qu n, ch@n l a th c ăn, nguyên li u th c ăn t t hơn = Hóc Mơn và C% Chi.

Hình 4.1: Đĩa nh a phân tích AFM1 b ng phương pháp ELISA Ghi chú

Các gi ng A1, B1, C1, D1, E1, F1, G1, và H1 là gi ng chu n AFM1 v i các n ng ñ tăng d n t 0, 5, 10, 25, 50, 100, 250 ng / l hay ppt (part per trillion).

Các gi ng C5, C10, E3, E11, F2 là gi ng m u có hàm lư ng AFM1 vư t quá gi i h n cho phép trong s a (> 500 ppt).

4.1.2. TV l7 nhi8m AFM1 trong s#a bò tươi theo lo(i TAHH b' sung

T# l nhi$m AFM1 trong s a bò tươi theo lo i TAHH b sung đư c trình bày = b ng 4.2 và bi u ñ 4.2.

B!ng 4.2: T# l nhi$m AFM1 trong s a bò tươi theo lo i TAHH b sung

M u s a không nhi$m AFM1 M u s a nhi$m AFM1 Lo i TAHH b sung S m u kh o sát S m u T# l (%) S m u T# l (%) Con Cò 89 35 39,33 54 60,67 CP - 384 29 7 24,14 22 75,86 Vi t M 8 4 50,00 4 50,00 Th ng Nh t 7 3 42,86 4 57,14 Tân Sanh 13 4 30,77 9 69,23 Hà Lan 9 4 44,44 5 55,56 Biên Hòa 8 1 12,50 7 87,50 An Phú 13 6 46,15 7 53,85

32 60.67 75.86 50 57.14 69.23 55.56 87.5 53.85 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 T l (%) CC CP VM TN TS HL BH AP TAHH

BiBu ñ- 4.2: T# l nhi$m AFM1 trong s a bò tươi theo lo i TAHH b sung Ghi chú CC: Con Cò CP: CP-384 VM: Vi t M TN: Th ng Nh t TS: Tân Sanh HL: Hà Lan BH: Biên Hòa AP: An Phú

Theo k t qu ñi u tra ñư c trình bày = b ng 4.2 và bi u ñ 4.2 cho th y t# l nhi$m AFM1 trong s a bò tươi = lo i TAHH Biên Hòa là cao nh t chi m 87,50% và th p nh t là TAHH Vi t M chi m 50,00%. S khác bi t gi a t# l nhi$m AFM1 trong s a bò tươi theo các lo i TAHH khơng có ý nghĩa khi ñư c xE lý th ng kê (P>0,05). Nguyên nhân có th do thành ph n nguyên li u c%a các công ty s n xu t TAHH b sung cho bò gi ng nhau.

V y theo k t qu kh o sát thì t# l nhi$m AFM1 trong s a bò tươi không ph thu c vào s khác bi t gi a các lo i TAHH b sung ñư c ăn vào.

4.1.3. TV l7 nhi8m AFM1 trong s#a bò tươi theo s!n lư"ng s#a

T# l nhi$m AFM1 trong s a bò tươi theo s n lư ng s a đư c trình bày = b ng 4.3 và bi u ñ 4.3.

B!ng 4.3: T# l nhi$m AFM1 trong s a bò tươi theo s n lư ng s a M u s a không nhi$m M u s a không nhi$m AFM1 M u s a nhi$m AFM1 S n lư ng s a (kg/con/ngày) S m u s a kh o sát S m u T# l (%) S m u T# l (%) < 10 14 6 42,86 8 57,14 10 - < 15 86 31 36,05 55 63,95 15 - < 20 63 23 36,51 40 63,49 ≥ 20 13 4 30,77 9 69,23 T'ng 176 64 36,36 112 63,64 42,86 57,14 36,05 63,95 36,51 63,49 30,77 69,23 0 10 20 30 40 50 60 70 T l (%) <10 10-<15 15-<20 ≥20 s n lư ng s a Khơng nhi m AFM1 Nhi m AFM1

BiBu đ- 4.3: T# l nhi$m AFM1 trong s a bò tươi theo s n lư ng s a

Qua k t qu đư c trình bày = b ng 4.3 và bi u ñ 4.3 cho th y t# l nhi$m AFM1 trong s a bò tươi = các s n lư ng s a chênh l ch nhau không ñáng k , = s n lư ng s a trên 20 kg / con / ngày chi m t# l cao nh t (69,23%), k ñ n là = s n lư ng s a t 10

Một phần của tài liệu KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG AFLATOXIN M1 TRONG SỮA BÒ TƯƠI VÀ HÀM LƯỢNG AFLATOXIN B1 TRONG THỨC ĂN HỖN HỢP BỔ SUNG CHO BÒ TẠI MỘT SỐ HỘ CHĂN NUÔI BÒ SỮA TRÊN ĐỊA BÀN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH (Trang 33)

Tải bản đầy đủ (PDF)

(61 trang)