Chương 3 NI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊ NC U
3.4.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C/U
3.4.1. Cách l2y mIu
MIu s#a bò tươi
M u s a ñư c l y = m t s h chăn ni bị s a trên qu n, huy n c%a thành ph , m i h chăn nuôi l y m t m u s a. Sau khi v sinh b u vú bị, v!t b" vài tia s a đ u = t t c các vú và v!t s a vào trong thùng ñ ng s a, tr n chung các thùng s a trong 1 h l i. Mang găng tay múc kho ng 100 ml s a ñ vào ng nghi m, ñánh s m u, b o qu n l nh và chuy n đ n phịng thí nghi m.
MIu th$c ăn cho bò s#a
M u th c ăn cho bị s a đư c l y ñ ng th(i v i lúc l y m u s a.
Phương pháp l y m u ñư c th c hi n theo TCVN 4325-86 v l y m u TAHH và nguyên li u th c ăn chăn nuôi. L y m u TAHH = nhi u v trí trên bao, trong kho sau đó tr n l i cho ñ u và l y 0,5 kg đưa v phịng thí nghi m b o qu n. Sau khi phân tích s a n u phát hi n có hàm lư ng AFM1 trong s a thì ta ti n hành phân tích hàm lư ng AFB1 trong m u th c ăn.
B!ng 3.1: B trí l y m u s a và m u TAHH b sung cho bò s a = các qu n, huy n
Qu n, huy n S m u s a bò tươi S m u TAHH b sung
Hóc Mơn 72 72 C% Chi 31 31 Bình Chánh 21 21 Bình Tân 28 28 Qu n 12 24 24 T ng c ng 176 176
24
3.4.2. KiBm tra hàm lư"ng AFM1 bTng kS thu<t ELISA 3.4.2.1. ChuOn b, mIu
S a tươi nguyên li u
Làm l nh m u = 2 - 8oC và ly tâm 3000 vòng / 10phút. Tách b" l p béo.
Pha loãng m u 5 l n b ng dung d ch pha loãng m u. SE d ng dung d ch này tr c ti p cho ph n ng ELISA.
3.4.2.2. ChuOn b, các dung d,ch làm vi7c
Dung d ch chu n AFM1: l!c k trư c khi dùng.
Conjugate: Pha loãng 100 l n b ng dung d ch pha loãng conjugate. Pha loãng dung d ch r a 20 l n.
3.4.2.3. Quy trình phân tích AFM1 bTng kS thu<t ELISA
Trư c khi ti n hành phân tích ghi l i b trí trên đĩa
Thêm 100 µl dung d ch chu n AFM1 có n ng đ 0 vào gi ng Bo.
Thêm 100 µl dung d ch chu n AFM1 có n ng đ 5, 10, 25, 50, 100, 250 ng / l vào các gi ng chu n.
Thêm 100 µl dung d ch m u vào gi ng m u tương ng.
? 45 phút = 20 - 25oC. Không nên kéo dài th(i gian % và không dùng máy l!c khi %. REa các gi ng b ng dung d ch rEa, ñ ch t l"ng ra kh"i gi ng. Lo i b" nh ng gi@t cịn đ@ng l i trong gi ng b ng cách ñ p úp m nh ñĩa lên l p gi y th m. Th c hi n l&p l i 4 l n. Khơng đư c ñ gi ng khơ.
Thêm 100 µl conjugate vào m i gi ng, tr n ñ u b ng cách l!c vòng trong vài giây. ? 15 phút = 20 - 25oC.
L&p l i bư c rEa như = trên.
Dùng pipet ña kênh cho 100 µl dung d ch lên màu vào m i gi ng l!c m nh b ng máy l!c vòng trong vài giây. ? 15 phút = 20 - 25oC.
Dùng pipet đa kênh cho 50 µl dung d ch d ng ph n ng vào m i gi ng l!c đ u b ng cách l!c vịng trong vài giây.
Hình 3.1: Đưa đĩa vào máy đ@c k t qu sau khi ñư c nh" dung d ch d ng ph n ng
3.4.2.4. Cách tính kCt qu!
Hàm lư"ng AFM1 trong s#a
Ta tính n ng ñ AFM1 trong m u d a vào ñư(ng cong chu n, r i nhân giá tr này v i h s pha loãng n u có.
L p đư(ng cong chu n, tr c tung là giá tr B / Bo (%) cịn tr c hồnh là n ng ñ AFM1.
Bo là ñ h p thu th c t c%a dung d ch AFM1 chu n có n ng ñ 0 trong gi ng Bo.
B là ñ h p thu th c t c%a m i m u thE ho&c m u chu n.
Hình 2.3: Đư(ng cong chu n dùng tính hàm lư ng AFM1 trong s a bò tươi N ng ñ AFM1
N ng ñ AFM1 (ppt)
26
3.4.3. KiBm tra hàm lư"ng AFB1 bTng phương pháp sKc ký lLng cao áp (HPLC)
Th c hi n theo phương pháp c%a Hisashi Kamimura và c ng s .
3.4.3.1. Phương pháp ly trích AFB1
− Cân 20 g m u ñã nghi n k thành b t vào trong bình tam giác 200 ml có nút
nhám th%y tinh, thêm 10 ml nư c c t ñ làm m m u.
− B sung 100 ml chloroform, ñ y n!p, l!c 10 phút = t c ñ nhanh. L@c qua gi y l@c vào m t c c th%y tinh chia v ch 50 ml. B sung 10 g Na2SO4 khan vào 50 ml d ch l@c, ñ yên vài phút.
Hình 3.2: M u đ ng trong bình tam giác có nút nhám th%y tinh
3.4.3.2. Phương pháp tách và tinh chC AFB1
− Cho vào c t 5 ml chloroform và 5 g Na2SO4 khan, thêm 0,7 g florisol, sau đó
cho 0,5 g Na2SO4 lên trên. Chuy n 50 ml d ch l@c m u vào c t, n u dòng ch y ch m thì khu y l p Na2SO4 phía trên. Tráng ng đong b ng m t ít chloroform và chuy n vào c t s!c ký. Khi m c d ch l@c h xu ng ñ n l p Na2SO4, tráng thành c t b ng chloroform và cho ch y qua thành c t như trên.
− Tách AFB1 kh"i c t b ng 30ml h n h p acetone-nư c (99:1). Thu nh n d ch dung ly vào bình 30 ml hình qu lê, làm khơ b ng cơ quay chân khơng trong b p đun cách th%y = nhi t ñ 50 – 60oC.
− Hịa tan c&n khơ b ng 1 ml chloroform, b o qu n và dùng trong phân tích
b ng TLC và HPLC
3.4.3.3. Đ,nh tính AFB1 bTng phương pháp sKc ký l;p mLng (TLC)
− Chu n b b n m"ng Silicagel có chi u cao 12cm, ñ dài tuỳ s lư ng m u. Dùng bút chì kR m t ñư(ng n m ngang cách ñáy 1,5cm. Dùng sylanh hút dung d ch m u và AFB1 chu n ch m thành t ng ñ m lên ñư(ng kR ngang v i lư ng 5 µl. V trí m i đ m cách nhau 1,5 cm, cách mép ph i và mép trái 1,5 cm.
− Tri n khai b n m"ng b ng dung môi chloroform: aceton (9:1) cho đ n khi dung mơi th m kho ng 90% b cao c%a b n m"ng, l y b n m"ng ra đ khơ t nhiên ho&c dùng hơi nóng đ làm khơ.
− Quan sát b n m"ng dư i ñèn UV (bư c sóng 365 nm) so sánh qu ng ñư(ng ch y Rf (relactive front), màu s!c, cư(ng ñ huỳnh quang gi a ñ m chu n và ñ m m u.
− Đ khtng ñnh các v t m u là AFB1 ta phun dung d ch H2SO4 25% lên b n m"ng, ñ khơ r i quan sát dư i đèn UV. N u các ñ m m u chuy n t màu xanh dương sang màu vàng thì đó là AFB1.
3.4.3.4. Đ,nh lư"ng bTng phương pháp sKc ký lLng cao áp (HPLC)
− Cho 0,5 ml AFB1 chu n và m u đã đư c phân tích TLC l n lư t vào các l@ nh", làm khô trong dịng khí N2.
− Dùng micropipette thêm 500 µl hexane và 125 µl TFA vào các l@ m u và
chu n, l!c ñ u, ñun = 40oC trong 5 phút và làm khơ trong dịng khí N2.
− Hịa tan c&n khơ trong 0,5 ml dung môi acetonitril – nư c (1:4).
− Tu n t bơm 10 µl dung d ch ch t chu n đã đư c xE lý TFA và 10 µl dung d ch m u ñã ñư c xE lý v i TFA vào thi t b .
− Tính lư ng AFB1 d a vào di n tích c%a peak và n ng ñ các ch t chu n.
3.5. CÁC CHU TIÊU THEO DÕI
− T# l nhi$m AFM1 trong s a bò tươi.
− T# l nhi$m AFM1 trong s a bò tươi theo lo i TAHH b sung. − T# l nhi$m AFM1 trong s a bò tươi theo s n lư ng s a.
28
− T# l m u s a ñ t yêu c u (so v i quy ñ nh c%a B Y T , 1998).
− T# l nhi$m AFB1 c%a m u TAHH b sung. − M c nhi$m AFB1 c%a m u TAHH b sung.
− T# l chuy n hoá t AFB1 trong TAHH b sung cho bò s a sang AFM1 trong
s a bị tươi.
Cách tính kCt qu!
T# l nhi$m AFM1 trong s a bò tươi (%) = (S m u s a nhi$m AFM1 / T ng s m u s a kh o sát).100
T# l m u s a ñ t yêu c u (%) = (S m u s a có m c nhi$m AFM1 dư i 0,5 ppb / T ng s m u s a kh o sát).100
T# l nhi$m AFB1 trong TAHH b sung cho bò (%) = (S m u TAHH nhi$m AFB1/ T ng s m u TAHH kh o sát).100
3.6. XM LÝ S LI U
Dùng ph n m m Minitab 12.21 for Windows
− So sánh các t# l nhi$m AF b ng tr!c nghi m χ2.
− Tính m c đ nhi$m AF trung bình (s li u đư c chuy n đ i sang logarit).
Chương 4
K T QU VÀ TH O LU N
4.1. TU L NHI M AFM1 TRONG S A BÒ TƯƠI M T S QU N, HUY N VÀ NH HƯ NG CFA M T S Y U T Đ N TU L NHI M AFM1 4.1.1. TV l7 nhi8m AFM1 trong s#a bò tươi : m)t s* qu<n, huy7n
K t qu v t# l nhi$m AFM1 trên t ng s 176 m u s a kh o sát đư c trình bày = b ng 4.1 và bi u ñ 4.1
B!ng 4.1: T# l nhi$m AFM1 trong s a bò tươi = m t s qu n, huy n
M u s a không nhi$m AFM1 M u s a nhi$m AFM1 Qu n, huy n S m u s a kh o sát S m u T# l (%) S m u T# l (%) Hóc Mơn 72 19 26,39 53 73,61 C% Chi 31 8 25,81 23 74,19 Bình Chánh 21 12 57,14 9 42,86 Bình Tân 28 14 50,00 14 50,00 Qu n 12 24 11 45,83 13 54,17 T'ng 176 64 36,36 112 63,64 73,61 74,19 42,86 50 54,17 63,64 0 10 20 30 40 50 60 70 80T l (%) HM CC BC BT Q12 T ng Qu n, huy n
30 Ghi chú HM: huy n Hóc Mơn CC: huy n C% Chi BC: huy n Bình Chánh BT: qu n Bình Tân Q12: qu n 12
Qua b ng 4.1 và bi u ñ 4.1 cho th y trong 176 m u s a kh o sát có 64 m u s a không nhi$m AFM1 chi m 36,36% và 112 m u s a nhi$m AFM1 chi m 63,64% . T# l này cao hơn k t qu kh o sát c%a Tr n Văn Thành năm 2001 (0%) nhưng th p hơn k t qu c%a Nguy$n Th H ng Phúc năm 2007 (80%) và k t qu c%a Tarik (Th Nhĩ Kỳ) năm 2003 (88,23%). Như v y t# l nhi$m AFM1 trong s a bò tươi = nư c ta năm nay có gi m b t nhưng v n còn khá cao (63,64%). Như ta ñã bi t AFM1 là s n ph m hydroxyl hóa c%a AFB1, khi bị ăn th c ăn có nhi$m AFB1 thì có kho ng 1 – 3% AFB1 đư c chuy n hóa thành AFM1 qua s a (trích d n c%a Lê Anh Ph ng, Bùi Cách Tuy n và ctv, 2001). Nư c ta là m t nư c nhi t đ i có m đ cao, s b o qu n th c ăn không t t là nguyên nhân d$ d n đ n tình tr ng nhi$m n m m c trong th c ph m.
Trong 5 qu n, huy n kh o sát thì t# l nhi$m AFM1 trong s a bò tươi = huy n C% Chi cao nh t chi m 74,19%, k đ n là huy n Hóc Mơn chi m 73,61%, = qu n 12 chi m 54,17%, = qu n Bình Tân chi m 50,00%, và th p nh t là = huy n Bình Chánh chi m 42,86%. Trong khi đó k t qu c%a Nguy$n Th H ng Phúc năm 2007, = huy n C% Chi chi m 74%, huy n Hóc Mơn chi m 100%, qu n 12 chi m 92%, qu n Bình Tân chi m 37,5% và huy n Bình Chánh chi m 85,2%. Nhìn chung đa s t# l nhi$m AFM1 trong s a bò tươi = các qu n, huy n năm nay th p hơn năm ngối nh t là = huy n Hóc Mơn, Bình Chánh và qu n 12 th p hơn ñáng k . Đi u này ch ng t" nh ng ngư(i chăn ni ngày càng quan tâm hơn đ n ch t lư ng s a và s c kh"e c ng ñ ng. Khi so sánh v m&t th ng kê thì t# l nhi$m AFM1 trong s a bò tươi gi a các qu n, huy n có s khác bi t rõ r t (P = 0,02), có th do ngu n th c ăn = m i vùng khác nhau. Tuy nhiên, trong s các qu n, huy n thì ch# có huy n Hóc Mơn v i Bình Chánh, Hóc Mơn v i Bình Tân và C% Chi v i Bình Chánh là có s khác bi t v m&t th ng kê (P < 0,05) còn gi a các qu n huy n khác khơng có s khác bi t v m&t th ng kê (P > 0,05). S khác bi t này có th do = Bình Chánh và Bình Tân có cách b o qu n, ch@n l a th c ăn, nguyên li u th c ăn t t hơn = Hóc Mơn và C% Chi.
Hình 4.1: Đĩa nh a phân tích AFM1 b ng phương pháp ELISA Ghi chú
Các gi ng A1, B1, C1, D1, E1, F1, G1, và H1 là gi ng chu n AFM1 v i các n ng ñ tăng d n t 0, 5, 10, 25, 50, 100, 250 ng / l hay ppt (part per trillion).
Các gi ng C5, C10, E3, E11, F2 là gi ng m u có hàm lư ng AFM1 vư t quá gi i h n cho phép trong s a (> 500 ppt).
4.1.2. TV l7 nhi8m AFM1 trong s#a bò tươi theo lo(i TAHH b' sung
T# l nhi$m AFM1 trong s a bò tươi theo lo i TAHH b sung đư c trình bày = b ng 4.2 và bi u ñ 4.2.
B!ng 4.2: T# l nhi$m AFM1 trong s a bò tươi theo lo i TAHH b sung
M u s a không nhi$m AFM1 M u s a nhi$m AFM1 Lo i TAHH b sung S m u kh o sát S m u T# l (%) S m u T# l (%) Con Cò 89 35 39,33 54 60,67 CP - 384 29 7 24,14 22 75,86 Vi t M 8 4 50,00 4 50,00 Th ng Nh t 7 3 42,86 4 57,14 Tân Sanh 13 4 30,77 9 69,23 Hà Lan 9 4 44,44 5 55,56 Biên Hòa 8 1 12,50 7 87,50 An Phú 13 6 46,15 7 53,85
32 60.67 75.86 50 57.14 69.23 55.56 87.5 53.85 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 T l (%) CC CP VM TN TS HL BH AP TAHH
BiBu ñ- 4.2: T# l nhi$m AFM1 trong s a bò tươi theo lo i TAHH b sung Ghi chú CC: Con Cò CP: CP-384 VM: Vi t M TN: Th ng Nh t TS: Tân Sanh HL: Hà Lan BH: Biên Hòa AP: An Phú
Theo k t qu ñi u tra ñư c trình bày = b ng 4.2 và bi u ñ 4.2 cho th y t# l nhi$m AFM1 trong s a bò tươi = lo i TAHH Biên Hòa là cao nh t chi m 87,50% và th p nh t là TAHH Vi t M chi m 50,00%. S khác bi t gi a t# l nhi$m AFM1 trong s a bò tươi theo các lo i TAHH khơng có ý nghĩa khi ñư c xE lý th ng kê (P>0,05). Nguyên nhân có th do thành ph n nguyên li u c%a các công ty s n xu t TAHH b sung cho bò gi ng nhau.
V y theo k t qu kh o sát thì t# l nhi$m AFM1 trong s a bò tươi không ph thu c vào s khác bi t gi a các lo i TAHH b sung ñư c ăn vào.
4.1.3. TV l7 nhi8m AFM1 trong s#a bò tươi theo s!n lư"ng s#a
T# l nhi$m AFM1 trong s a bò tươi theo s n lư ng s a đư c trình bày = b ng 4.3 và bi u ñ 4.3.
B!ng 4.3: T# l nhi$m AFM1 trong s a bò tươi theo s n lư ng s a M u s a không nhi$m M u s a không nhi$m AFM1 M u s a nhi$m AFM1 S n lư ng s a (kg/con/ngày) S m u s a kh o sát S m u T# l (%) S m u T# l (%) < 10 14 6 42,86 8 57,14 10 - < 15 86 31 36,05 55 63,95 15 - < 20 63 23 36,51 40 63,49 ≥ 20 13 4 30,77 9 69,23 T'ng 176 64 36,36 112 63,64 42,86 57,14 36,05 63,95 36,51 63,49 30,77 69,23 0 10 20 30 40 50 60 70 T l (%) <10 10-<15 15-<20 ≥20 s n lư ng s a Khơng nhi m AFM1 Nhi m AFM1
BiBu đ- 4.3: T# l nhi$m AFM1 trong s a bò tươi theo s n lư ng s a
Qua k t qu đư c trình bày = b ng 4.3 và bi u ñ 4.3 cho th y t# l nhi$m AFM1 trong s a bò tươi = các s n lư ng s a chênh l ch nhau không ñáng k , = s n lư ng s a trên 20 kg / con / ngày chi m t# l cao nh t (69,23%), k ñ n là = s n lư ng s a t 10