Do trong quá trình bi ến đổi có sinh ra hợp chất melanoidin làm cho tỏi có màu đen. Melanoidin là hợp chất có màu nâu, trọng lƣợng phân tử polyme đồng nhất cao đƣợc hình thành khi đƣờng và axit amin kết hợp thông qua Phản ứng Maillard ở nhiệt độ cao.
Trong một nghiên cứu về việc tăng tính chống ox y hóa của tỏi đen, báo cáo cho rằng màu đen có th ể đƣợc bắt nguồn từ anthoc yanin và làm cho polyphenol đƣợc tăng lên [ 1 1 ]
21
CHƢƠNG III. NGHIÊN CỨU TÌNH HUỐNG
3.1. Nghiên cứu tác dụng của tỏi đen lên hệ thống miễn dịch
Từ hơn 4000 năm về trƣớc, tỏi đƣợc sử dụng nhƣ một loại thuốc tru yền thống dđể điều trị một số rối loạn nhƣ tiểu đƣ ờng, viêm kh ớp và một số bệnh nhi ễm trùng (bao gồm cảm, sốt rét và lao) [ 1 8 ] , [ 1 1 ]. Hơn nữa nhà sinh học Louis Pasteur đã ch ứng minh đƣợc những đặc tính di ệt khuẩn của tỏi. Sau đó t ỏi còn đƣ ợc gọi là “Russian penicillin” trong th ế chiến thứ II.
Dƣới tác động của đời sống xã hội, chúng ta đã tìm hiểu các lợi ích sinh học của thực phẩm chức năng từ cá mực [ 1 7 ], tỏi[ 6 ] , [ 2 0 ] , [ 2 1 ], nấm (Sasaki et al. 2000) , và bắp ngọt [ 2 3 ]. Các nghiên cứu đã đƣ ợc báo cáo trƣớc đây cũng đã xác nhận tính năng của tỏi nhƣ giảm huyết áp, giảm cholesterol, ngăn ngừa các bệnh tim mạch và ung thƣ, và kháng khu ẩn
[ 1 8 ] , [ 1 1 ]. Ngoài ra, hiệu lực kháng Bacillus anthracis (từng đƣ ợc sử dụng
nhƣ súng sinh học ở Mỹ vào năm 2001) và vi khuẩn gây xuất huyết đƣờng ruột Escherichia coli 0157 (gây ng ộ độc thực phẩm diện rộng ở Nhật Bản năm 1996), và tính kháng ox y hóa, tính kháng đơng, tính gi ải độc đối với các hợp chất hữu cơ gây độc đều đã đƣợc chứng minh [ 1 3 ]
. Gần đâ y, tỏi đen – một loại tỏi mới đƣợc sản xuất ở Nhật Bản dƣ ới điều kiện kiểm soát ch ặt chẽ nhiệt độ và độ ẩm mà không sử dụng bất kì một chất phụ gia nào. Tỏi đen cịn ít hoặc khơng cịn mùi hă ng nồng của tỏi, có vị ngọt nhẹ của trái câ y, có th ể bóc vỏ và ăn dễ dàng.
Những nghiên cứu trƣớc đã có mơ tả hoạt tính kháng kh ối u mạnh mẽ của tỏi đen trong mơ hình thí nghi ệm BALB/c v ới chuột [ 2 2 ]. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng t ỷ lệ kháng kh ối u là 50% và không gâ y đ ộc cho tế bào. Từ kết quả đó, có thể có nghi ng ờ rằng hoạt tính sinh học của tỏi đen đã tác động đến hệ thống miễn dịch đểtiêu diệt hoàn toàn tế bào khối u [ 2 2 ].
22
Y. F. Danan Wang và cs (2010) thực hiện nghiên c ứu “Dịch chiết tỏi đen (Allium sativum) giúp tăng cƣờng hệ thống miễn dịch”
Y. F. Danan Wang, Jun Liu, Jiangzhong Yan, Meiru Wang , Jinichi Sasaki, Changlong Lu, Black Garlic (Allium sativum) Extracts Enhance the Immune S ystem, Medicinal and Aromatic Plant Science and Biotechnolog y, 4 (2010), pp. 37 -40.
3.2. Vật liệu và phƣơng pháp
3.2.1. Quy trình sản xuất tỏi đen
Tỏi đen đƣợc tạo ra từ tỏi tƣơi dƣới sự kiểm soát ch ặt chẽ về nhiệt độ (khoảng 65 – 80oC) và độ ẩm (khoảng 70 – 80o
C) trong 30 – 40 ngà y, mà không t hêm bất kì hóa ch ất xử lý và ph ụ gia nào khác. T ỏi tƣơi sẽ thay đổi màu sắc từ trắng đến nâu và đen. Tỏi đen có vị trái cây dịu với mùi dễ chịu hơn t ỏi tƣơi.
3.2.2. Thiết kế thí ngiệm
Giống chu ột cái C57BL/6 đƣ ợc mua từ trung tâm thực nghiệm Sinica Shanghai (Thƣợng Hải, Trung Quốc), nuôi trong điều kiện sạch bệnh. Chuẩn bị 8 chuồng cho thí nghi ệm. Chọn 5 con chu ột nặng khoảng 20g đƣợc xếp trong 1 chuồng. Tất cả đều nuôi trong điều kiện nhiệt độ và độ ẩm bình thƣờng trong suốt thời gian thí nghiệm. Mỗi con sẽ đƣợc tiêm dịch chiết tỏi đen với liều lƣ ợng 100 µg/0.1 ml/ngà y trong vịng 5 ngà y. Sau đó ngƣng tiêm từ ngày thứ 6 cho đến khi kết thúc thí nghiệm. 5 con trong 1 nhóm s ẽ đƣợc phân tích lách và hu yết thanh cho thí nghi ệm miễn dịch. Tế bào lách và hu yết thanh đƣợc bảo quản ở -80oC cho tới khi làm thí nghi ệm phân tích. Nh ững thí nghi ệm trên động vật đã đƣợc sự đồng ý của ủ y ban đạo đức của trƣ ờng đại học Hirosaki, Nh ật Bản và trƣờng đại học y dƣ ợc Trung Qu ốc, Trung Quốc.
3.2.3. Chiết tỏi đen
Tỏi đen đƣợc tách ra t ừng tép nh ỏ và ngâm trong nƣ ớc nóng ở 90 – 100oC trong 1 – 2 giờ, với t ỷ lệ 30 g/100 ml, để thu các cấu tử tan trong
23 nƣớc. Dịch thu đƣợc đem ly tâm 3000 rpm trong 20 phút đ ể thu dịch nổi, đông lạnh ở -80oC sau đó đem đơng khơ (máy đông khô, BFB – 2, Nihon Freezer Co. Ltd, Nh ật Bản) để bảo quản cho các phản ứng miễn dịch.
3.2.4. Hóa phân tích
Dịch chiết đƣ ợc sử dụng để xác định S – all yl – L – c yst eine (SAC) và γ – glutamyl – S – allyl – L – cysteine (GSAC) (tiền chất của SAC) bằng phƣơng pháp s ắ kí lỏng: kích thƣ ớc cột (2 mm x 50 mm), nhi ệt độ (40oC), tốc độ dòng (0,2 ml/phút), dung tích (5µl), pha di động [nƣ ớc (85): 10mm ammonium formate (10): methanol (5)] (Alliance 2696, Co. Ltd., Nhật Bản)
3.2.5. Khảo nghiệm hoạt tính kháng
Hiệu lực kháng ox y hóa c ủa tỏi đen đƣ ợc xác định bằng DPPH (1.1 – diphen yl – 2 – picr yh ydraz yl) (Wako Co. Ltd., Nh ật Bản) và thể hiện bằng mg tiêu thụ để giảm 50% 1.1 – diphen yl – 2 – picr yh ydraz yl (RS50%). Dịch chiết đƣợc trộn với DPPH (0,1 mM) trong ethanol. Ủ 20 phút ở nhiệt độ phòng, đ ọc kết quả hấp thụ bƣớc sóng 217 nm
3.2.6.Hoạt tính tế bào NK (natural killer) ở tế bào lách
Tế bào YAC – 1 nhƣ tế bào đích đƣ ợc sử dụng để xác định hoạt tính của tế bào NK (từ ngân hàng tế bào của viện khoa h ọc Trung Qu ốc; No.13917329935). Pha loãng YAC – 1, 1.0 x 105/ml trong 10% FBS (hu yết thanh bò) RPMI 1640 (Gibco Co. Ltd, USA). T ế bào lách sử dụng để đáp ứng kích thích đƣợc pha loãng 1.0 x 106
/ml/giếng nhỏ (Costa Co. Ltd, USA) và tr ộn 1.0 x 104/ml/giếng tế bào đích. Ni các t ế bào nà y trong 96 giếng ở điều kiện: 5.0% CO2, 37oC. Sau đó cấy 100 ml sang giếng mới trong 10 phút cũng v ới điều kiện nhƣ trên. 100 ml ch ất nền LDH (lactate dehydrogenase) đƣ ợc giữ trong tối trong 10 phút. Thêm acid citric 30.0 µl (1.0 mol/l)/gi ếng, phản ứng sẽ ngƣng lại. Lặp lại mỗi thí nghiệm 3 lần
24
3.2.7.Cảm ứng NO (nitric oxide) trong s ự phân chia
tế bào lách
Tạo hu yền phù t ế bào lách: 5.0 x 106/mL trong 10% FBS RPMI 1640, ủ ở điều kiện: 5.0% CO2, 37oC trong 48 gi ờ và cấ y dịch nổi để xác định hàm lƣợng sản phẩm [ 8 ]
. Trộn 0.1 mL dịch hu yền phù và 0.1 mL dung dịch Giress (Wako Co. Ltd, Nh ật Bản), giữ ở nhiệt độ phịng t rong 10 phút. Sau đó xác định OD ở bƣớc sóng 550 nm
3.2.8.Sự sản xuất cytokine trong t ế bào lách
Tạo hu yền phù t ế bào lách: 5.0 x 106/mL trong 10% FBS RPMI 1640, ủ ở điều kiện: 5.0% CO2, 37oC trong 48 gi ờ. Xác định bằng ELISA Kit: IL – 2 (R&D s ystem, Inc. DY 402, USA), TNF – α (R&D s ystem, Inc. DY 410, USA), IL – 4 (R&D s ystem, Inc. DY 404, USA), và IFN - γ (eBioscience, Inc. 88 -7314-88, USA). Lặp lại mỗi thí nghiệm 3 lần
3.2.9.Phương pháp thống kê
Sử dụng phƣơng pháp student (windows 16.0, SPSS) v ới *P<0.05, **p<0.001
3.3. Kết quả và thảo luận
3.3.1. Hiệu lực kháng kh ối u của tỏi đen
Kích thƣớc khối u trung bình của những con chuột đƣợc tiêm dịch chiết giảm một nửa so với nhóm đối chứng. Nhƣ vậ y, kết quả cho thấ y có dịch chiết tỏi đen có hiệu lực kháng kh ối u.
3.3.2.Sự tạo thành các hợp chất hóa học trong dịch chiết
tỏi đen
Hàm lƣợng carbohydrat, quyết định tính ngọt của tỏi đen, tăng từ 28.7% trong tỏi tƣơi lên 47.0% trong t ỏi đen [ 2 2 ]. Những hợp chất khác nhƣ protein và lipid thì khơng th ấy có sự khác biệt đáng kể so với tỏi tƣơi. Tuy nhiên, các acid amin nhƣ cysteine, phenylalanine, tyrosine, leucine, valine, alanine, gl ycine, glutamic acid và acid aspartic thì tăng đáng kể trong tỏi đen [ 2 2 ].
25 Hợp chất quan tr ọng tan trong nƣ ớc của tỏi đen là SAC [ 1 5 ]. SAC tăng từ 24 µg/g trong tỏi tƣơi lên 194 µg/g trong tỏi đen (sau 40 ngày). GSAC là tiền chất của SAC đã gi ảm từ 748 đến 247 µg/g [ 2 2 ] điều đó cho thấ y GSAC đã chuyển thành SAC trong q trìn h làm chín tỏi. Việc tạo ra tỏi đen không ph ải là không ph ải là cách lên men liên quan đ ến vi khuẩn. Trên thực tế đã không phát hiện thấ y bất kì lồi Lactobacillus nào trong q trình ủ tỏi đen
3.3.3.Hoạt tính kháng c ủa tỏi đen
Một trong nhựng hoạt tính có l ợi nhất của tỏi đen là tính kháng ox y hóa có liên quan đến sự DNA phá hủy [ 2 4 ]
. Trong một nghiên cứu để đánh giá hoạt động của kháng thể bằng hợp chất chứa lƣu hu ỳnh trong t ế bào ung thƣ gan của ngƣời loại Hep G2, những hợp chất trong tỏi đã bảo vệ chúng khỏi sự phá hủ y của DNA [ 7 ]. Trong thí nghi ệm nà y, hi ệu lực kháng oxy hóa tang lên đáng kể so với tỏi tƣơi [ 2 2 ]
. Hoạt tính nà y bao gồm cả việc bảo vệ cơ thể khỏi DNA phá hủ y do hoạt động của ox y ngu yên tử, là ngu yê n nhân chính gâ y bùng phát ung thƣ [ 1 3 ]
3.3.4.Tăng cường hệ thống miễn dịch bằng tỏi đen
Kết quả thí nghiệm đã cho thấ y sự tham gia c ủa một cơ chế kháng khối u có liên quan đến hệ thống miễn dịch.
Tế bào NK có vai trị quan tr ọng trong miễn dịch qua trung gian t ế bào. Tế bào NK giúp nh ận dạng và tiêu di ệt các tế bào có h ại nhƣ tế bào khối u, tế bào nhiễm virus, và nhi ều loại khác [ 1 4 ]. Hoạt động của tế bào NK tăng và đạt tối đa sau 10 ngày kể từ hi bắt đầu thí nghiệm (5 ngày sau khi ngƣng tiêm) (p < 0.02).
26