Vi khu n đ kháng kháng sinh là v n đ r t quan tr ng, gây nhi u tr ng i cho các th y thu c trong và ngoài n c. Nguyên nhân d n đ n hi n t ng này là do vi c s d ng kháng sinh ch a h p lý. Theo thông tin t t ch c y t th gi i WHO, t i Vi t Nam có h n 70% b nh nhân đ c ch đnh kháng sinh v i li u l ng khơng thích h p.[12]
P.aeruginosa là m t trong nh ng tác nhân kháng thu c th ng g p hi n nay.
Vi c đi u tr các b nh nhi m trùng do tác nhân này gây ra ngày càng tr nên khó kh n và t n kém, b i nó có tính kháng kháng sinh m nh, đ c bi t là kháng nhi u kháng sinh cùng m t lúc (đa kháng).
Tình hình kháng kháng sinh c a P.aeruginosa trên th gi i
M t th ng kê Canada cho th y: hàng n m có kho ng 25 tri u đ n thu c kháng sinh đ c kê trong đó trên 50% kháng sinh đ c kê không h p lý, vì vây tình hình phát tri n kháng thu c c a vi khu n là t t y u. Theo báo cáo c a h th ng giám sát nhi m khu n qu c gia M (NNIS) cho th y t l kháng kháng sinh c a P.aeruginosa nh
sau: n m 2000, kháng Imipenem là 17,7%, Quinolon 27,3%, Cephalosporin th h 3 là 26,4%. n n m 2002, t l kháng v i các kháng sinh trên đã t ng, kháng Imipenem 23,3%, Quinolon 32,8%, Cephalosporin th h 3 là 30,2%. [13]
Tình hình kháng kháng sinh c a P.aeruginosa Vi t Nam.
i v i nhi m khu n b nh vi n do P.aeruginosa thì vi c đi u tr khó kh n vì nguy c vi khu n này kháng v i h u h t kháng sinh k c các kháng sinh đ t tr và kháng sinh carbapenem ph r ng nh Imipenem và Meropenem
P.aeruginosa có đ c tính kháng thu c t nhiên v i nhi u lo i kháng sinh. Các
kháng sinh chính dùng đ đi u tr nhi m khu n do P.aeruginosa thu c nhóm beta- lactam, aminoglycoside, Fluoroquinolon… nh ng m c đ đ kháng v i các kháng sinh này t ng đ i cao. Trong nghiên c u c a Lê c M n, các kháng sinh thu c nhóm
KHĨA LU N T T NGHI P GVHD: TS.BS V B O CHÂU
Cefapim và Cefalosporin th h m i c ng b đ kháng m c cao, ch còn nh y c m v i Imipenem.
Theo nghiên c u đa trung tâm v Tình hình đ kháng kháng Imipenem và Meropenem c a tr c khu n Gram âm d m c k t qu trên 16 b nh vi n t i Vi t Nam
c a Ph m Hùng Vân và nhóm nghiên c u MIDAS: t 5//2008 đ n 11/2009 đã có 1602 ch ng tr c khu n Gram âm d m c đ c nghiên c u t 16 b nh vi n trên toàn qu c. K t qu cho th y có 15,4% P.aeruginosa kháng Meropenem nh ng có đ n 20,7% kháng Imipenem và trong k t qu này có 27.5% và 10,7% là nh y c m và nh y v a v i Meropenem.[11]
kháng kháng sinh c a P.aeruginosa t i b nh vi n B ch Mai t 2008-2010:
kháng Imipenem (26,1-31,9%).
Theo k t qu c a ch ng trình “Giám sát s đ kháng kháng sinh c a vi khu n gây b nh th ng g p Vi t Nam 2005”, P.aeruginosa đã đ kháng m c cao v i h u h t các kháng sinh chuyên tr đ t bi t và gia t ng t l kháng Imipenem: 12,5% (2003), 15,5% (2004), 18,4% (2005).
Theo H i ngh khoa h c k thu t B nh vi n Ch R y 2010, t l kháng Imipenem 25% (2008), 27% (2009)
Theo nghiên c u c a Tr n Th Ng c Anh (2007) v S đ kháng kháng sinh c a
vi khu n gây b nh th ng g p t i b nh vi n Nhi ng 2, h u h t các ch ng
P.aeruginosa thì nh y c m v i CAZ (79,83%), CIP (89,42%), TCC (89,17%), IPM
KHÓA LU N T T NGHI P GVHD: TS.BS V B O CHÂU
PH N II:
I T NG, V T LI U VÀ PH NG
KHÓA LU N T T NGHI P GVHD: TS.BS V B O CHÂU II.1 I T NG NGHIÊN C U: M u b nh ph m t b nh nhân đ c nh n vào đi u tr t i b nh vi n 175 - B nh ph m là m c a các v t th ng b b i nhi m, ch t d ch ph qu n, n c ti u, d ch màng ph i…
- B nh ph m máu c a b nh nhân nghi ng b nhi m khu n huy t.
II.2 A I M VÀ TH I GIAN NGHIÊN C U:
- a đi m: b nh vi n 175
- Th i gian nghiên c u: 11/2013- 5/2014
II.3 V T LI U NGHIÊN C U:
II.3.1 Mơi tr ng, hóa ch t đ nuôi c y vi khu n:
- Môi tr ng t ng sinh: canh thang BHI (Brain Heart Infusion) - Môi tr ng c y máu: chai c y máu ch a môi tr ng BHI. - Môi tr ng nuôi c y, phân l p: th ch máu BA, Uriselect 4 - Môi tr ng làm kháng sinh đ : MHA (Mueller Hinton Agar) - Các đa gi y kháng sinh c a hãng Bio Mesrieux
- N c mu i sinh lý 9o/oo vô trùng.
II.3.2 D ng c , trang thi t b
- D ng c : + a petri + Lame
+ Lame kính hi n vi + èn c n
+ ng nghi m, giá đ ng ng nghi m + T m bơng vơ trùng
KHĨA LU N T T NGHI P GVHD: TS.BS V B O CHÂU + Que c y + Kim tiêm + Panh k p gi y + Gi y th m + G ng tay cao su + Dung d ch r a tay + Bút acetone + … - Thi t b :
+ T mát 4oC (General Electtric USA) + T m 20oC – 40oC
+ T c y vô khu n
+ Máy đo n ng đ Mc Farland c a hãng Bio Meriuex + Cân đi n t Leafcitac (M )
+ Kính hi n vi Olympus + …
II.4 PH NG PHÁP VÀ K THU T NGHIÊN C U
II.4.1 Ph ng pháp nghiên c u:
- Mô t c t ngang
- Thu th p s li u: Ti n c u, h i c u. - X lý s li u b ng th ng kê y-sinh h c
KHÓA LU N T T NGHI P GVHD: TS.BS V B O CHÂU
II.4.2 K thu t nghiên c u:
- B nh ph m đ c l y vô khu n t i các khoa c a b nh vi n và chuy n ngay v phòng xét nghi m vi sinh đ ti n hành nuôi c y, phân l p thích h p.
- Thơng tin b nh nhân nh đ tu i, gi i tính, chu n đoán lâm sàn đ c ghi vào phi u xét nghi m vi sinh.
- nh danh b ng môi tr ng BA, Uriselect 4, các th sinh hóa đ c tr ng c a vi khu n.
- Làm kháng sinh đ theo ph ng pháp khu ch tán trên th ch (Kirby Bauer). Bi n lu n đ ng kính vịng vơ khu n d a theo tiêu chu n NCCLS và ghi nh n k t qu vi khu n nh y c m hay trung gian hay đ i kháng v i kháng sinh th nghi m.
II.4.2.1 i v i b nh ph m là m d ch, ch t d ch ph qu n, n c ti u, d ch màng ph i, phân…
- B nh ph m đ c l y cho vào ng ho c bình đ ng chuyên d ng, dán nhãn ghi rõ h tên ng i b nh và ngày l y, sau đó chuy n ngay đ n khoa vi sinh v t đ ti n hành xét nghi m.
- B nh ph m đ c c y ngay trên môi tr ng phân l p BA, Uriselect 4: di nh xoay tròn t m bơng ch a b nh ph m vào góc đ a th ch, sau đó dùng que c y vơ trùng ria nh trên m t th ch theo k thu t c y phân vùng.
- đa th ch đã c y vào t m 370C/24h.
- C y d phòng vào ng BHI, đ ng th i v i các đa th ch c y phân l p. N u trên h p th ch khơng có vi kh n m c mà ng BHI đ c thì c y phân l p l i t
ng môi tr ng này.
Quan sát h p th ch và ng BHI:
- N u khơng có vi khu n m c và ng BHI không đ c: tr l i k t qu âm tính. - N u có vi khu n m c :
KHÓA LU N T T NGHI P GVHD: TS.BS V B O CHÂU
+ Ch n các khu n l c l n, màu tr ng xám, ho c xanh lá, nh y, l i, b khơng đ u, có th có ánh kim, phát ra mùi th m gi ng mùi khoai môn ho c mùi nho. Trên mơi tr ng th ch máu BA, có d ng tiêu huy t .
+ Ti p t c d nh danh: th nghi m các test sinh hóa đ xác đnh
P.aeruginose và làm kháng sinh đ .
- N u không th y vi khu n m c mà ng BHI đ c: c y phân l p l i t ng mơi tr ng này, sau đó đa th ch này 370C/24h. Quan sát n u th y vikhu n
P.aeruginosa m c thì ti p t c ti n hành đnh danh làm th nghi m sinh hóa đ
xác đnh và làm kháng sinh đ .
- Tr l i k t qu đnh danh và kháng sinh đ .
II.4.2.2 B nh ph m máu:
- Nh ng b nh nhân có tri u ch ng nhi m khu n huy t lâm sàng đ c bác s ch đnh c y máu.
- Máu ph i đ c c y tr c khi b nh nhân làm kháng sinh. Tuy nhiên trong các tr ng h p b nh nhân đang đi u tr kháng sinh nh ng các tri u ch ng c a du khu n huy t hay nhi m trùng huy t v n khơng thun gi m thì c ng nên cho ch đnh c y máu đ phát hi n tác nhân gây nhi m trùng.
- Máu đ c l y t i gi ng b nh và b m tr c ti p vào chai l y c y máu ch a BHI vô trùng.
- Ghi tên b nh nhân, ngày gi c y máu trên nhãn chai c y máu.
- Nuôi c y và phân l p: chai c y máu đ c trong t m 37oC trong vịng 5-7 ngày xem có d u hi u c a vi khu n m c hay không. Các d u hi u vi khu n m c: có h t đóng trên m t h ng c u, đ c đ u hay có màng, tan huy t, đơng huy t t ng.
KHĨA LU N T T NGHI P GVHD: TS.BS V B O CHÂU
- Khi có d u hi u vi khu n m c thì ti n hành c y truy n sang BA và Uriselect 4, 37oC/24h, ch n khu n l c nghi ng P.aeruginosa, ti p t c làm th nghi m
sinh hóa đ xác đ nh P. aeruginosa và làm kháng sinh đ . + Tr l i k t qu đ nh danh và kháng sinh đ .
- Tr l i k t qu âm tính: sau 5 ngày v n không th y vi khu n m c thì ta c y truy n bình máu vào mơi tr ng BA, Uri m t l n n a đ ch c ch n khơng có vi khu n m c tr c khi tr l i c y máu âm tính.
KHĨA LU N T T NGHI P GVHD: TS.BS V B O CHÂU
S đ 1: S đ nghiên c u phân l p, đ nh danh và làm kháng sinh đ c a
P.aeruginosa t m u b nh ph m:
Canh thang trong sau 7 ngày
Canh thang đ c sau 7
ngày Th ch BA, Uriselect 4 ( 37oC/24h) Khơng có d u hi u vi khu n m c Có d u hi u vi khu n P.aeruginosa m c Nhu m gram Th oxydase Kháng sinh đ B nh ph m M d ch, đàm, d ch não t y Máu
Bình canh thang c y máu ( 37oC, trong 7 ngày)
KHÓA LU N T T NGHI P GVHD: TS.BS V B O CHÂU
II.5 PH NG PHÁP NH DANH P.AERUGINOSA
II.5.1 Kh o sát khóm khu n trên th ch BA
Có tiêu huy t hay khơng tiêu huy t. Ki u tiêu huy t , hay . Khóm to hay nh , đ c hay trong, khô hay t.
P.aeruginosa trên th ch BA có ki u tiêu huy t , khóm to và đ c
Hình 2: P.aeruginosa tiêu huy t trên mơi tr ng BA (Ngu n trích: https://www.flickr.com/photos/microbeworld/4888319912/) (Ngu n trích: https://www.flickr.com/photos/microbeworld/4888319912/)
II.5.2 nh danh b ng mơi tr ng Uriselect 4
Ngun t c:
KHĨA LU N T T NGHI P GVHD: TS.BS V B O CHÂU
- Hai lo i ch t màu (chromogenic substrates) có kh n ng phát hi n s ho t đ ng c a các enzym đ c hi u.
- Phát hi n indol nh tryptophan trong th ch - Có ch t c ch m c lan c a Proteus
P.aeruginosa trên th ch Uriselect 4: khu n l c th ng l n, trong, b đ u ho c
khơng đ u, có th có ánh kim lo i, màu xám nh t ho c xanh l trên n n môi tr ng màu h i xanh, mùi th m. C ng có th g p lo i khu n l c xù xì ho c nh y.
Hình 3: P.aeruginosa trên mơi tr ng Uriselect 4 (Ngu n trích: http://did.it/contenuti/biorad/UriSelect.pdf) (Ngu n trích: http://did.it/contenuti/biorad/UriSelect.pdf)
II.5.3 Kh o sát khu n l c b ng ph ng pháp nhu m gram
KHÓA LU N T T NGHI P GVHD: TS.BS V B O CHÂU
Do s khác bi t v c u trúc vách t bào nên trong quá trình nhu m gram, vi khu n gram (+) s gi đ c ph c h p tím Gentians-iod, khơng b t y màu b i ancohol. Trong khi vi khu n gram (-) không gi đ c ph c h p màu này. Do v y, k t qu sau khi nhu m là vi khu n gram (+) v n gi đ c màu tím c a Gentian, còn vi khu n gram (-) n màu h ng c a ph m màu safranin hay fuchsin.
Ti n hành:
- H nh lame kính trên ng n đèn c n, nh gi t n c mu i sinh lý trên lame. T môi tr ng th ch đa dùng que c y b t m t nhóm vi khu n riêng l đ t vào gi t NaCl trên lame, dàn m ng và đ u. lame khô t nhiên ho c h nhanh qua ng n l a đèn c n.
- t lame trên giá nh m, nh dung d ch crytal violet lên ph t vi khu n, đ yên trong 1 phút, sau đó r a n c d i vòi n c ch y r t nh .
- t lame trên giá nh m, nh dung d ch lugol ph đ u trên ph t vi khu n, đ yên trong 1 phút, r a n c.
- T y c n b ng cách c m nghiêng tiêu b n, cho c n 96o ch y t t mép trên phi n kính. Quan sát mép d i cho đ n khi gi t c n v a m t màu tím. Sau đó r a nh lame d i vịi n c ch y nh .
- Ph dung d ch safarin lên ph t nh m, đ yên trong 1 phút. Sau đó r a n c th m khơ, sau đó đ lame khơ hồn tồn ngồi khơng khí.
- Quan sát tiêu b n nhu m b ng kính hi n vi, xác đnh hình thái và cách b t màu c a vi khu n:
K t qu :
Quan sát ph t nhu m gram qua kính hi n vi, d i v t kính d u, vi khu n
KHÓA LU N T T NGHI P GVHD: TS.BS V B O CHÂU
Hình 4: Hình nh nhu m Gram P.aeruginosa
(Ngu n trích: https://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Pseudomonas_aeruginosa)
II.5.3 Th nghi m Oxidase
Nguyên t c: Phát hi n kh n ng sinh enzym cytochrome oxidase c a vi khu n Thao tác:
- Dùng n c mu i sinh lý th m v a đ t gi y th oxidase.
- Dùng vòng c y vô trùng qu t khu n l c vi khu n lên đa gi y th oxidase - Quan sát s đ i màu c a đa gi y th trong 10 giây đ n 1 phút.
K t qu :
- Oxidase (+): đa gi y th đ i sang màu tím. - Oxidase (-): đ a gi y th khơng đ i màu
KHĨA LU N T T NGHI P GVHD: TS.BS V B O CHÂU
P.aeruginosa có ph n ng d ng tính v i th nghi m oxidase: đ a gi y có
màu tím. Do P.aeruginosa có kh n ng sinh enzyme cytochrome oxidase.
Hình 5: P.aeruginosa d ng tính v i oxidase
(Ngu n trích: https://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Pseudomonas_aeruginosa)
II.6 K THU T KHÁNG SINH THEO PH NG PHÁP KIRBY-BAUER.[8] BAUER.[8]
II.6.1 Nguyên t c:
Kháng sinh đ c t m vào đ a gi y v i n ng đ cho t ng lo i. Kháng sinh s khuy ch tán ra m t th ch xung quanh và ng n ch n s phát tri n c a vi khu n.
ng kính vịng vơ khu n b c ch th hi n tính nh y c m c a vi khu n đ i v i thu c kháng sinh. Tr ng h p khơng có vịng c ch ngh a là vi khu n kháng l i thu c kháng sinh. Ph ng pháp này đ c y Ban Qu c Gia v Các Chu n M c Phịng Thí Nghi m Lâm Sàng (NCCLS) ch p nh n và bi n lu n theo NCCLS.
II.6.2 V t li u và ph ng pháp
II.6.2.1 a kháng sinh
Là nh ng đa gi y có đ ng kính 6mm đ c t m m t dung d ch thu c kháng sinh v i n ng đ tiêu chu n. a kháng sinh ph i đ c b o qu n trong các ng có ch a ch t ch ng m nhi t đ -4oC. Khi chu n b dùng thì l y ra đ nhi t đ phòng t 1